I virus. Capitolo 17 e 18 Prescott, Capitolo 10 Stanier, Capitolo 9 Brock. La scoperta dei virus

Transcript

1 I virus Capitolo 17 e 18 Prescott, Capitolo 10 Stanier, Capitolo 9 Brock La scoperta dei virus I virus sono stati scoperti nel XIX secolo; la loro esistenza e le loro caratteristiche sono state dedotte da diversi scienziati. La difficoltà di studio risiedeva nel fatto che questi agenti di malattie non potevano essere isolati in colture pure studi di L. Pasteur sulla rabbia studi di A. Mayer sulla malattia del mosaico del tabacco D. Iwanowsky dimostra che TMV è un agente filtrabile M. Beijerinck osserva che TMV prolifera nelle cellule dell ospite in crescita P. Rous identifica un virus responsabile del sarcoma di pollo 1915/ F. Twort e F. d Herelle scoprono virus che infettano i batteri (batteriofagi o fagi) Alla fine degli anni 30 fu chiaro che i virus erano dei complessi di acidi nucleici e proteine in grado di riprodursi solo all interno di cellule viventi.

2 Identificazione dei virus Per molto tempo i virus furono individuati in base a tre proprietà: 1 - agenti infettivi di malattia 2 - invisibili al microscopio, passano attraverso i filtri che bloccano i batteri 3 - non crescono in terreni batteriologici Questa descrizione è insufficiente per operare una distinzione tra batteri e virus (es. Clamydiae) µm Proprietà generali dei virus Sistema di classificazione di Baltimore (Nobel 1975) HepB Genoma virale: kbp E. coli: 4X10 3 kbp Possiamo dire che i virus differiscono dalle cellule, sia eucariote che procariote, per almeno tre punti essenziali: 1 - la semplice organizzazione cellulare 2 - la presenza nello stesso virione di un solo tipo di acido nucleico 3 - l incapacità di riprodursi in assenza di cellule ospiti (Clamydiae rientrano nel punto 3, ma non soddisfano i criteri 1 e 2)

3 Fig. 9.3 Struttura dei virus Dimensioni: i virus hanno dimensioni che variano da 10 a 400 nm. I virus più piccoli sono appena più grandi dei ribosomi mentre i poxvirus possono avere la dimensione di un piccolo batterio. Tutti i virioni sono costituiti da un acido nucleico (DNA o RNA) situato all interno di un rivestimento proteico denominato capside. Il capside è formato da un certo numero di molecole proteiche definite subunità strutturali. Spesso diverse proteine si associano per formare i capsomeri. L insieme di acido nucleico e proteine viene definito nucleocapside. Molti virus possiedono strutture più complesse in cui il nucleocapside è racchiuso da una membrana definita involucro pericapsidico. In base alle caratteristiche morfologiche del capside e alla struttura del virione è possibile individuare quattro gruppi principali: 1 - I virioni che al ME appaiono sferici vengono definiti poliedrici in quanto le subunità proteiche che lo costituiscono (capsomeri) sono disposti in modo da formare un poliedro. Il poliedro più comune è l icosaedro, un poliedro a 20 facce triangolari equilatere, 30 spigoli e 12 vertici. I capsomeri di questi virus sono proteine multimeriche composte da 5, 6 o più subunità. Fig. 9.4

4 2 - I virioni che al ME appaiono come bastoncini sono invece elicoidali. Un esempio è fornito dal TMV. In questo caso l RNA è associato con i capsomeri a formare un cilindro cavo. Nel TMV l elica ha 16.5 subunità per giro e le dimensioni globali del virione sono di 18X300 nm. La lunghezza dei virus elicoidali è determinata dalla lunghezza del genoma, la larghezza dalla grandezza e dal grado di impacchettamento delle subunità proteiche. Fig Virus rivestiti ovvero dotati di envelope (strato membranoso esterno che avvolge il capside) Questi virus hanno una forma sferica e in qualche modo variabile mentre il nucleocapside sottostante può essere icosaedrico o elicoidale. 4 - virus complessi: hanno unna simmetria capsidica che non è né del tutto icosaedrica, né del tutto elicoidale. Possono presentare diverse strutture quali una struttura icosaedrica (testa) connessa ad una struttura elicoidale (coda). Questa combinazione (struttura binaria) è molto comune tra i fagi, ma non nei virus animali o vegetali. struttura dei fagi T-pari

5 Dimensioni e morfologia di alcuni virus Enzimi presenti nei virus Batteriofagi: lisozima Virus animali: neuroamidasi (rompe i legami glicosidici delle glicoproteine ed i glicolipidi di membrana) Retrovirus: trascrittasi inversa

6 Purificazione dei virus centrifugazione isopicnica su gradiente centrifugazione differenziale 1 - centrifugazione differenziale 2 - centrifugazione su gradiente 3 - precipitazione con solfato d ammonio 4 - trattamento con solventi organici come cloroformio (i virus sono più resistenti a questi trattamenti) 5 - degradazione enzimatica (i virus sono più resistenti a trattamenti con ribonuleasi o tripsina) Metodi di saggio - saggio delle placche Fig. 9.6 I conteggi ottenuti con il saggio delle placche sono sempre inferiori a quelli ottenuti con il microscopio elettronico. l efficienza di piastramento è di circa il 50% per i batteriofagi e del 0.1/1% per i virus animali. La concentrazione di una sospensione fagica (titolo) viene quindi espressa come PFU (unità formanti placche) Es. 0.1ml di una diluizione 10-6 di una preparazione virale porta alla formazione di 75 placche; la concentrazione originale delle unità formanti placche è PFU/ml = (75PFU/0.1ml)(10 6 ) = 7.5X10 8 /ml

7 Morfologia placche di diversi batteriofagi Metodi di saggio - metodo della diluizione finale Quando è impossibile valutare gli effetti biologici prodotti dal virus, la quantità di virus necessario per dare la malattia o morte può essere calcolato con il metodo della diluizione finale. Colture cellulari sono inoculate con diluizioni seriali di una sospensione virale per determinare la diluizione che distrugge o danneggia il 50% delle cellule ospiti. La dose letale LD50 o dose infettante ID50 (diluizione al punto finale) è quella diluizione che contiene una dose di virus sufficiente a distruggere o danneggiare il 50% delle cellule ospiti

8 Le fasi della moltiplicazione virale Attacco (adsorbimento): recettori (trasportatori), acidi teicoici, lipopolisaccaridi, flagelli e pili. La capacità di adsorbimento è usata nella tipizzazione fagica. Penetrazione (iniezione) Replicazione genoma virale Sintesi proteine del capside Assemblaggio delle subunità proteiche e impacchettamento del genoma Rilascio (lisi) sintesi del lisozima che idrolizza i legami peptidici del peptidoglicano. In altri casi vengono usati altri enzimi litici. Fig. 9.8 Cinetica della crescita virale Esperimento a singolo ciclo di crescita (M. Delbruck 1940) Infezione coltura batterica Diluizione così che le particelle virali non infettino immediatamente nuove cellule Determinazione del numero di particelle virali liberate (conta delle placche) Fase di latenza Periodo di crescita Plateau Dimensione di scoppio: numero di virioni prodotti per cellula infettata Periodo di eclisse: la cellula batterica non contiene particelle virali intere e infettanti

9 Cinetica della crescita virale Fig. 9.9 Fase di adsorbimento Recettori: componenti della superficie della cellula ospite (proteine, carboidrati, glicoproteine, lipidi, lipoproteine,) contattati dal virione T1: proteina per l assorbimento del ferro lambda: proteina per l assorbimento del maltosio T2: proteina di membrana T4: componente polisaccaridico della membrana Virus influenza: acido sialico (presente in molti tipi cellulari) Virus HIV: proteina CD4 (presente solo in alcune cellule del sistema immunitario)

10 Ingresso nella cellula T4 Fig Restrizione e modificazione dei virus da parte dell ospite Enzimi di restrizione: riconoscono delle sequenze palindrome a 4, 6 o più basi. La restrizione è un meccanismo generale di difesa delle cellule contro l invasione da parte di acidi nucleici esogeni. La cellula protegge il proprio DNA modificando i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione attraverso la metilazione delle basi azotate. Alcuni virus modificano a loro volta il proprio genoma tramite la metilazione e la glucosilazione (fagi T pari) Altri fagi (T3 e T7) evitano la restrizione codificando proteine che inibiscono i sistemi di restrizione dell ospite. La capacità di modificare gli acidi nucleici non è presente in tutti i ceppi ospiti che permettono la crescita di un dato virus. Inoltre esistono sistemi di restrizione che riconoscono solo il DNA modificato. 5-idrossimetilcitosina

11 RNA messaggero dei virus RNApol-RNAdipendente (virione) RNApol-RNAdipendente (virione) Fig E tutto qui? AMBIVIRUS virus con genoma a RNA a singola elica, metà del quale in orientamento + e metà nella configurazione -

12 Proteine virali 1. Proteine (generalmente enzimi) sintetizzate subito dopo l infezione, chiamate proteine precoci, che sono necessarie per replicare il genoma virale 2. Proteine sintetizzate dopo l inizio della replicazione, chiamate proteine tardive, che comprendono le proteine del rivestimento 3. Proteine litiche, che causano la rottura della cellula ospite permettendo il rilascio della progenie virale Principali virus batterici Fig. 9.11

13 Cosa abbiamo scoperto tramite lo studio dei batteriofagi? Il DNA è il materiale genetico Esistenza della ricombinazione genetica nei virus Presenza degli enzimi di restrizione Presenza di funzioni geniche uniche codificate dal virus... Batteriofagi con genoma di DNA lineare a doppio filamento T4 Genoma di circa 1,7X10 5 bp con circa 250 geni. Presenta una base insolita, la 5- metilidrossicitosina in cui al gruppo ossidrile possono essere aggiunte molecole di glucosio rendendo così il virus resistente alla restrizione batterica. Il cromosoma di T4 è a forma di bastoncello, ma viene rappresentato in forma circolare per il fatto che la sequenza nucleotidica del cromosoma presenta una ridondanza terminale che può andare dalle 3000 alle 6000 coppie di basi.

14 Ciascun cromosoma di T4 rappresenta una permutazione circolare di una sequenza nucleotidica comune ABCDEFG e ciascuno possiede una ridondanza terminale della sequenza di inizio. Quando viene esaminata una popolazione di T4 sembra che ciascun gene sia adiacente al successivo, come se non esistano estremità Fig Sintesi degli acidi nucleici e delle proteine fagiche Interruzione sintesi DNA, RNA e proteine dell ospite e sintesi degli mrna precoci. Alcune proteine virali degradano il DNA dell ospite bloccando così l espressione genica e fornendo materiale da costruzione Alcune proteine virali iniettate modificano l RNA polimerasi dell ospite che in questo modo riconosce in maniera privilegiata i promotori del virus. Geni precoci e tardivi fanno parte di gruppi distinti trascritti in direzioni opposte e si trovano su eliche diverse Per la sintesi di 5-idrossimetilcitosina sono richiesti 2 enzimi codificati dal genoma virale; appena sintetizzato, il DNA di T4 viene glucosilato

15 Sono rilasciate circa 100 nuove particelle virali RNAPol MotA geni intermedi Fig. 9.15

16 Virus batterici temperati: la lisogenia Durante la lisogenia, non viene espressa la maggior parte dei geni fagici e il genoma virale si replica in sincronia con il cromosoma dell ospite. In questa situazione si parla di provirus o profago. L instaurarsi del ciclo litico viene indotto da stimoli esterni quali raggi X, raggi UV e in generale quei trattamenti che causano danni al DNA e che inducono il sistema SOS. La presenza di un profago rende la cellula batterica immune da un altra infezione con un virus dello stesso tipo. Fig Infezione di lambda: ciclo litico Genoma costituito da una molecola di DNA lineare che circolarizza in virtù delle estremità coesive. Circa basi Può intraprendere sia il ciclo litico che lisogeno Lambda si attacca ad un recettore di E. coli, penetra all interno e subito il DNA circolarizza. Le prime fasi sono le stesse sia per il ciclo litico che lisogeno RNApol dell ospite inizia a trascrivere da pochi promotori. P L e P R sono localizzati ai lati della regione regolativa Fig. 9.18

17 Infezione di lambda: ciclo litico Vengono prodotti Cro ed N N è un antiterminatore che consente alla RNApol di continuare oltre i terminatori e porta alla sintesi di cii e ciii. N è poco efficace a monte di Q, quindi la proteina Q viene prodotta in piccole quantità. Anche Q è un antiterminatore è, se viene prodotta in sufficienti quantità, promuoverà la trascrizione del trascritto R2. Questo trascritto verrà tradotto nelle proteine necessarie alla lisi cellulare. Contemporaneamente all aumento di Q, aumenta anche Cro, il repressore che blocca la trascrizione da P L e P R Fig Infezione di lambda: ciclo litico Cro si lega ai tre siti in questo ordine: 3, 2, 1. Cro blocca la trascrizione di P R solo quando si trova legato al sito 1. Quando P L e P R sono bloccati non verranno prodotti cii e ciii, necessari per la lisogenia. Quindi, in presenza di alte concentrazioni di Cro, si intraprende il ciclo litico Fig. 9.19

18 Infezione di lambda: ciclo litico Nell ultimo stadio, lambda duplica il DNA con il meccanismo del cerchio rotante. Entrambe le nuove eliche di DNA stanno per essere copiate alla forca replicativa e sono già state prodotte due copie del genoma. Questa sintesi è di tipo asimmetrico, dato che solo una delle eliche parentali continua a fungere da stampo mentre l altra viene usata una volta sola Fig Infezione di lambda: ciclo lisogenico Affinché si stabilisca lo stato lisogenico deve essere inibita la sintesi delle proteine litiche e una copia del genoma virale deve essere integrata nel cromosoma dell ospite. ci codifica per il repressore di lambda, situato tra P R e P L. Tuttavia, la trascrizione di ci parte da P E, situato dopo cro. P E viene attivato da cii, normalmente degradata dalle proteasi batteriche. Se queste proteasi sono poco abbondanti, o se c è un eccesso di ciii, cii attiverà P E e la sintesi del repressore ci. ci si lega agli stessi siti di cro, ma con un affinità inversa (1, 2 e 3). Appena di lega al sito 1, blocca l attività del promotore P R

19 Infezione di lambda: ciclo lisogenico Però, senza la proteina cii il promotore P E non può funzionare Il promotore P M, è attivato quando il repressore si lega al sito 1 ed è represso quando il repressore è legato a tutti e tre i siti. ci può quindi funzionare sia da attivatore che da repressore. Dopo l integrazione di lamba come profago, viene prodotto solo il repressore Il delicato equilibrio tra lisogenia e lisi In entrambi i casi si segue la stessa via fino all ultimo. La differenza si riduce al problema se sia il repressore ci oppure Cro a occupare i due operatori L evento iniziale per stabilire la lisogenia è il legame del repressore al sito 1 di O R L evento iniziale per il legame nel ciclo litico è il legame di Cro al sito 3 O R Crescita in un mezzo ricco: proteasi attive = cii inattivato = lisi Crescita in condizioni di starvation: poche proteasi = cii attivo = lisogenia

20 espressione dei geni ci e int. Il promotore del gene int è attivato da cii L evento di escissione richiede il prodotto del gene xis Fig Crescita litica di lambda dopo l induzione Agenti che danneggiano il DNA inducono in E. coli la risposta SOS. Viene prodotta la proteina RecA, una proteasi che distrugge il repressore di lambda

21 Forma e relative dimensioni dei virus dei vertebrati Fig Forma e relative dimensioni dei virus dei vertebrati Fig. 9.22

22 Possibili effetti dei virus su cellule animali (herpes) Fig Struttura e funzione dei retrovirus gag: proteine strutturali interne pol: trascrittasi inversa e integrasi env: glicoproteine dell involucro Fig Codifica per una tirosin chinasi coinvolto trasformazione cellulare

23 Processo di replicazione di un retrovirus Come primer usa un trna Processo di replicazione di un retrovirus

24 Viroidi e prioni (9.13)