Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 14

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 14

2 Caratterizzazione strutturale delle proteine Concetti chiave: Per poter essere sequenziata, una proteina deve essere separata in singoli polipeptidi che possano essere scissi in un insieme di frammenti sovrapponibili. La sequenza amminoacidicapuò essere determinata utilizzando la degradazione di Edman, una procedura che rimuove i residui N-terminali uno alla volta. La spettrometria di massa èin grado di identificare le sequenze amminoacidichepartendo dal rapporto carica-massa dei frammenti di proteina in fase gassosa.

3 Caratterizzazione strutturale delle proteine La conoscenza della sequenza amminoacidica di una proteina costituisce il prerequisito per la determinazione della sua struttura tridimensionale ed è essenziale per comprenderne il suo meccanismo d azione molecolare. Il confronto tra sequenze di proteine analoghe ottenute da specie differenti consentono di approfondire le conoscenze sulla funzione di queste proteine e svelano le relazioni evolutive tra le proteine e gli organismi che le sintetizzano (sistematica molecolare). Numerose malattie ereditarie sono causate da mutazioni che determinano una sostituzione amminoacidica in una proteina. Le analisi delle sequenze amminoacidiche possono essere di ausilio nello sviluppo di test diagnostici e di terapie efficaci.

4 Caratterizzazione strutturale delle proteine La determinazione della sequenza dei 51 residui dell insulina, la prima proteina sequenziata nel 1953 da Sanger, richiese dieci anni e circa 100 g di proteina. Anche se oggi, con le nuove tecnologie automatizzate, la maggior parte delle proteine può essere sequenziata in pochi giorni o mesi di lavoro con pochi microgrammi di materiale, la strategia di sequenziamento è simile a quella utilizzata da Sanger. La proteina viene rotta in frammenti sufficientemente piccoli da poter essere sequenziati individualmente. La struttura primaria della proteina intatta si ricostruisce partendo dai tratti delle sequenze sovrapponibili.

5 Caratterizzazione strutturale delle proteine Sanger utilizzò il DNFB che reagisce con i gruppi amminici terminali dando origine a un derivato DNP giallo. La proteina veniva poi idrolizzata per rompere i legami peptidici e l amminoacido N-terminale identificato mediante cromatografia.

6 Frederick Sanger Sanger ricevette per i risultati delle sue ricerche un premio Nobel nel Un secondo premio nobel gli venne assegnato nel 1980 per aver messo a punto il metodo di sequenziamento degli acidi nucleici mediante terminazione di catena.

7 Fasi preliminari La determinazione della sequenza amminoacidica di una proteina prevede l esecuzione di alcune tappe preliminari che includono: L isolamento delle subunità per proteine con struttura quaternaria La determinazione della composizione amminoacidica L analisi dei residui N-terminali L analisi dei residui C-terminali La riduzione ed il blocco dei ponti disolfurici La determinazione del peso molecolare

8 Isolamento delle subunità per proteine multimeriche Una verifica della presenza di più subunità in una proteina può essere effettuata mediante SDS-PAGE in presenza di un agente riducente come DTT o mercaptoetanolo. Il successivo isolamento può essere effettuato mediante cromatografia per gel filtrazione (subunità con diverso peso molecolare) o altre tecniche cromatografiche nel caso le subunità hanno peso molecolare simile. Proteina multimerica Catena A Catena A Catena B Catena A Denaturazione con SDS in presenza di β-mercaptoetanolo Catena B Catena B

9 Determinazione della composizione amminoacidica La determinazione della composizione amminoacidica di una proteina prevede le seguenti fasi: Idrolisi dei legami peptidici per l ottenimento dei singoli amminoacidi Separazione mediante cromatografia Derivatizzazione degli amminoacidi (post-colonna) Rivelazione spettrofotometrica

10 Determinazione della composizione amminoacidica L idrolisi acida dei legami peptidici avviene in 6N HCla 110 Cper h sotto atmosfera di azoto o argon. La derivatizzazione degli amminoacidi può essere effettuata prima della separazione cromatografica degli amminoacidi (pre-colonna) oppure all uscita dalla colonna cromatografica (post-colonna).

11 Sistemi con derivatizzazione pre-colonna Sistemi con derivatizzazione pre-colonna Cromatografia a fase inversa ad alta pressione (RP-HPLC) 1 fluoro-2,4 dinitrobenzene(365 nm) dansil cloruro ( nm) Fluoresceina isotiocianato(495 nm) Ortoftalaldeide(340nm, Em 450nm)

12 Sistemi con derivatizzazione post-colonna Sistemi con derivatizzazione post-colonna Cromatografia a scambio ionico e colorazione con ninidrina H 2 SO 4 La cromatografia a scambio ionico viene effettuata utilizzando uno scambiatore cationico forte con resina di polistirene/divinil benzene cui sono legati gruppi solfonici

13 Sistemi con derivatizzazione post-colonna La miscela di amminoacidi viene caricata sulla colonna ad un ph acido (2.2) al quale tutti gli amminoacidi hanno una carica positiva (ph<pi) e si legano. L eluizione viene effettuata mediante un aumento di ph, forza ionica etemperatura. Saranno eluiti prima gli aa acidi, poi i neutri ed infine i basici che, con la loro carica positiva, interagiscono più fortemente con lo scambiatore cationico della colonna.

14 Sistemi con derivatizzazione post-colonna La derivatizzazione post-colonna viene effettuata con ninidrina che reagisce con gli amminoacidi liberi dando origine ad un colore coloreblu con gli α-amminoacidio giallo con gli imminoacidi (prolina). L assorbimento viene dunque letto ad una lunghezza d onda di 570(giallo) e 420(violetto) nm. Composto di Ruhemann(Blu-violetto) Vi è il largo impiego di questa reazione nei test per la rivelazione delle impronte digitali in quanto amminoacidi in tracce vengono depositati sulle superfici toccate.

15 Determinazione della composizione amminoacidica Poiché l assorbanza è proporzionale alla quantità di amminoacidi, la derivatizzazione con ninidrina consente di effettuare una determinazione quantitativa estremamente accurata degli amminoacidi rilevati come una serie di picchi (cromatogramma) che possono essere integrati per il calcolo della concentrazione. Tempo di ritenzione (min) Il tempo di ritenzione del picco identifica l'amminoacido dal punto di vista qualitativo, mentre l'area dello stesso è utilizzata per ricavarne la concentrazione. Il sistema deve essere calibrato con una miscela di amminoacidi standard, da cui ricavare successivamente i dati relativi al nostro campione.

16 Analizzatore automatico di amminoacidi Gli analizzatori automatici di amminoacidi sono costituiti da sistemi integrati per l analisi di amminoacidi. Lo schema a blocchiconsente di effettuare tutte le fasi dell analisi in maniera automatizzata. Sistema tamponi Ninidrina Colonna a scambio ionico Analizzatore di amminoacidi Reattore (a 100/130 C) Registratore Sistema di integrazione Fotometro

17 Analisi dei residui N-terminali I residui N-terminali di ogni catena polipeptidica (se non sono bloccati per via chimica) possono essere determinati mediante marcatura con composti rivelabili spettrofotometricamente. Il dansil cloruro reagisce con le ammine primarie formando peptidi dansilati.

18 Analisi dei residui N-terminali Il trattamento con un acido ad alta temperatura idrolizza i legami peptidici liberando il residuo N-terminale che può essere separato mediante cromatografia ed identificato mediante la fluorescenza gialla.

19 Analisi dei residui C-terminali I residui C-terminali non possono essere identificati per via chimica ma si utilizzano enzimi che tagliano in maniera sequenziale il residuo C-terminale. I residui rilasciati al C-terminale vengono identificati mediante reazione con ninidrina e successiva cromatografia a scambio ionico. Carbossipeptidasi A taglia tutti i residui eccetto Pro, Arg, e Lys Carbossipeptidasi B agisce solo su residui di Arg e Lys Carbossipeptidasi A

20 Riduzione dei ponti disolfurici I residui di cisteina possono formare ponti disolfurici intermolecolari ed intramolecolari

21 Riduzione dei ponti disolfurici I ponti disolfurici possono essere scissi mediante riduzione con mercaptani (composti che contengono gruppi SH) come ditiotreitolo(dtt) o β-mercaptoetanolo(β-me) DTT in eccesso

22 Riduzione dei ponti disolfurici I gruppi sulfidrilici liberi sono poi alchilati mediante trattamento con iodoacetato (o iodoacetamide) per impedire la riformazione dei ponti disolfuro mediante ossidazione da parte di O 2 Cisteina ridotta Iodoacetamide Cisteina Carboamidometilata

23 Degradazione di Edman 1. Il reagente di Edman fenilisotiocianato (PITC), reagisce con il gruppo amminico N- terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline. 2. Si forma così un addotto feniltiocarbamilico(ptc). 3. Tale composto trattato con acido trifluoroacetico (CF 3 COOH) anidro libera il residuo N- terminale sottoforma di derivato tiazolinonico, senza idrolizzare gli altri legami peptidici.

24 Degradazione di Edman Il derivato tiazolinone-amminoacido è estratto selettivamente con un solvente organico ed è convertito nel più stabile derivato feniltioidantoina (PTH) mediante trattamento con un acido in soluzione acquosa.

25 Degradazione di Edman E possibile risalire alla sequenza amminoacidica di una proteina partendo dall N-terminale e spostandosi verso l interno, sottoponendo il polipeptide a cicli ripetuti della degradazione di Edman e, dopo ogni ciclo, identificando il PTH-amminoacido liberato.

26 Degradazione di Edman Il tipo di amminoacido è identificato mediante confronto con i tempi di eluizione dei 20 PTHamminoacidistandard di riferimento separati mediante cromatografia a fase inversa. E possibile rilevare meno di una picomole di PTH-amminoacido. L analisi di sequenza può essere condotta su quantità dell ordine di 5-10 pmol di peptide (<0.1 µg).

27 Degradazione di Edman Oggi tutte le fasi della degradazione di Edman sono state automatizzate e possono essere effettuate utilizzando sequenziatori automatici.

28 Degradazione di Edman Dopo circa cicli diventa difficile determinare la sequenza amminoacidica. Ciò accade perché, dopo un numero elevato di cicli, gli effetti cumulativi di reazioni incomplete e di reazioni secondarie del processo di degradazione di Edman (carry over) rendono impossibile una identificazione certa dell amminoacido rilasciato e quindi della sequenza amminoacidica.

29 Strategia per il sequenziamento delle proteine La proteina da sequenziaredeve essere scissa in frammenti sufficientemente brevi da poter essere sequenziati individualmente.

30 Strategia per il sequenziamento delle proteine Poi, partendo dalla sequenza dei tratti sovrapposti, si ricostruisce la struttura primaria della proteina intatta.

31 Peptidasi Le endopeptidasisono enzimi che catalizzano l idrolisi dei legami peptidici interni, contrariamente alle esopeptidasiche rimuovono i residui N- o C-terminali.

32 DIGESTIONE DELLE PROTEINE proteina - amminoacido

33 DIGESTIONE DELLE PROTEINE proteina -arginina -lisina

34 DIGESTIONE DELLE PROTEINE Tripsina Riconosce e taglia con elevata specificitài legamipeptidicial terminale carbossilico dei residuidiarge Lys se ilresiduo successivo non è Pro -arginina -lisina

35 DIGESTIONE DELLE PROTEINE -arginina -lisina

36 DIGESTIONE DELLE PROTEINE -arginina -lisina

37 DIGESTIONE DELLE PROTEINE

38 DIGESTIONE DELLE PROTEINE

39 DIGESTIONE DELLE PROTEINE La digestione con tripsina di una proteina da luogo a frammenti di varia lunghezza che terminano, ad eccezione del C-terminale, con un residuo di lisina o arginina.

40 DIGESTIONE DELLE PROTEINE La digestione con tripsina di una proteina da luogo a frammenti di varia lunghezza che possono essere separati ed isolati mediante cromatografia a fase inversa e sequenziati individualmente N ter K K R R K C ter N ter K cter N ter K cter N ter R cter 1 peptide 2 peptide 3 peptide RP-HPLC N ter cter 4 peptide N ter -----K cter 5 peptide N ter C ter 6 peptide Sequenziamento

41 Peptidasi Altre endopeptidasi hanno specificità diversa e producono serie di frammenti peptidici con sequenze che si sovrappongono.

42 Idrolisi chimica con CNBr Molti reagenti chimici promuovono la scissione dei legami peptidici in corrispondenza di particolari residui. Uno dei più utilizzati è il bromuro di cianogeno (CNBr) che taglia sul lato carbossiterminale dei residui di metionina. Il C-terminale di nuova formazione dà origine ad una struttura ciclica (omoserina lattone).

43 Strategia per il sequenziamento delle proteine E necessario adoperare enzimi proteolitici diversi per generare una serie di frammenti peptidici sovrapposti Anche in questo caso si procederà alla determinazione della sequenza di ciascun peptide Le serie di sequenze peptidiche sovrapposte consentono di ricostruire la sequenza di ciascun polipeptide

44 Esempio N-Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Pro-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu- Ala-Gly Arg-His Lys-Trp-Lys-Ser Glu-Asn-Leu- Ile-Arg-Thr-Tyr-C Tyr-C Tripsina N-Asp-Ala-Gly-Arg Ser-Glu Glu-Asn His-Cys Cys-Lys-Pro-Lys Asn-Leu-Ile-Arg Thr-Tyr Tyr-C I peptidi vengono separati mediante RP-HPLC e sequenziati mediante degradazione di Edman

45 Esempio Tripsina Tyr-Gly-Lys Ala-Lys Ile-Thr-Pro Ala-Asp-Phe-Ser-Arg Chimotripsina Ser-Arg-Ile-Thr-Pro Gly-Lys-Ala-Asp-Phe Ala-Lys-Tyr Ala-Lys-Tyr-Gly-Lys-Ala-Asp-Phe-Ser-Arg-Ile-Thr-Pro Ala-Asp-Phe-Ser-Arg-Ile-Thr-Pro

46 Banche dati di sequenze proteiche Le sequenze delle proteine possono essere depositate ed immagazzinate in specifiche banche dati consultabili via Internet (e.g. Molte sequenze proteiche sono state sequenziate direttamente, altre sono state dedotte dalle loro sequenze nucleotidiche (DNA).

47 Spettrometria di massa La spettrometria di massa è una tecnica che misura in maniera accurata il rapporto tra massa e carica (m/z) di ioni in fase gassosa. Viene utilizzata per la determinazione del peso molecolare delle proteine e anche per sequenziare i polipeptidi.

48 Spettrometria di massa Nella spettrometria di massacon ionizzazione per elettronebulizzazioneo elettrospray (ESI, electrospray ionization) una soluzione di una macromolecola come un polipeptide è vaporizzata in un capillare cui èapplicato un alto voltaggio sotto flusso di azoto per formare goccioline altamente cariche da cui il solvente evapora generando ioni in fase gassosa. L analizzatore dello spettrometro di massa determina poi il rapporto m/z di tali ioni con un accuratezza superiore allo 0.01%. Le cariche derivano dalla protonazione dei residui di Lyse Arg.

49 Spettrometria di massa Spettro ESI-MS della apomioglobina (mioglobina priva dello ione Fe) di cuore di cavallo. Sono indicati i rapporti m/z e le cariche dei picchi da cui è possibile ricavare il peso molecolare della proteina.

50 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) I peptidi possono essere sequenziati mediante spettrometri di massa con analizzatori disposti in serie. Il primo analizzatore seleziona lo ione (peptide) di interesse che viene poi frammentato in una cella di collisione (secondo analizzatore). Le masse dei frammenti vengono poi misurate nel terzo analizzatore.

51 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) Poiché la frammentazione avviene in determinate condizioni prevalentemente a livello dei legami peptidici, raffrontando le masse molecolari dei frammenti è possibile stabilire le identità dei residui amminoacidici dei peptide ad eccezione dei residui che la stessa massa molecolare (i.e. Ile e Leu).