CONTEGGIO DIRETTO DI ESCHERICHIA COLI

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1 METODO NAZIONALE STANDARD CONTEGGIO DIRETTO DI ESCHERICHIA COLI F 20 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Specialist and Reference Microbiology Division W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. PagIna 1 di 10

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per Per cortesia cortesia prendere prendere nota nota che che la la bibliografia bibliografia è è attualmente attualmente formattata formattata con con il il software software Reference Reference Manager. Manager. Se Se si si modifica modifica o o si si cancella cancella il testo il testo senza senza avere avere installato installato nel nel computer computer il Reference il Reference Manager, Manager, la la bibliografia bibliografia non non sarà sarà aggiornata aggiornata automaticamente. automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2004). Direct enumeration of Escherichia coli. National Standard Method F 20 Emissione 1 ww.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 2 di 10

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA INTRODUZIONE.. 5 SCOPO.. 5 INFORMAZIONE DI BASE PRINCIPIO DEFINIZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA PROCEDIMENTO PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DILUIZIONE SEMINA ED INCUBAZIONE CONTEGGIO DELLE COLONIE PROVE DI CINFERMA CALCOLO DEI RISULTATI REFERTAZIONE DEI RISULTATI. 8 ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI CONTEGGIO DIRETTO DI E. COLI... 9 BIBLIOGRAFIA.. 10 W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 3 di 10

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato F 20 Procedura Operativa Standard per il conteggio Diretto di Escherichia coli Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 4/ Prima pagina Stato del Documento Ridisegnata Revisionato 4 Pagina della procedura di modifica Ridisegnata W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 4 di 10

5 PROCEDURA OPERATIVA STANDARD PER IL Scopo Il presente metodo per conteggio delle E. coli è applicabile a tutte le matrici tranne che ai molluschi bivalvi ed ai prodotti alimentari congelati e disidratati che possono contenere microrganismi danneggiati. Non è applicabile ai prodotti caseari. Conoscenza di base La presenza di Escherichia coli nell alimento è considerata indice di contaminazione fecale. Conteggi di 100 unità formanti colonie (ufc) o superiori di E. coli sono considerati non soddisfacenti per gli alimenti pronti al consumo 1. Le linee guida specificano che per gli alimenti pronti cotti e raffreddati 2 conteggi di 10 ufc/g o superiori sono considerati insoddisfacenti. Le linee guida commerciali per gli alimenti pronti al consumo pongono il valore limite per le E. coli a 10 ufc/g. W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 5 di 10

6 1.0 PRINCIPIO Il conteggio di E. coli con questo metodo prevede la semina di una concentrazione 10-1 sulla superficie di un agar selettivo contenente acido 5-bromo-4cloro-3-indolil-ß-D glucuronico. L incubazione è a 30 C per 4 ore per consentire la rivitalizzazione, ed a 44 C per 18 ore per consentire la crescita selettiva delle E. coli. Il riconoscimento delle colonie si avvale del substrato cromogeno BCIG per rilevare l attività delle ß-glucoronidasi tramite la formazione di colonie di colore blu. L attività della ß-glucoronidasi nei batteri Gram negativi è ristretta a E. coli (90%), Shigella, Yersinia e Salmonella. 2.0 DEFINIZIONI Nel contesto di questo metodo si applica la seguente definizione: Escherichia coli Microrganismi che nelle condizioni di prova crescono in presenza di sali biliari a 44 C e mostrano una reazione ß- glucoronidasi positiva. 3.0 CONDIZIONI DI SICUREZZA Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. 4.0 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Bilancia con sensibilità di 0.1g Stomacher Diluitore gravimetrico (opzionale) Vortex Piastratore a spirale (opzionale) Termostato a ciclo automatico: 30 C 1 C 44 C 0.5 C Contatore di colonie (opzionale) Buste per Stomacher (sterili) Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare volumi fino a 10mL e 1mL (opzionale) Pipette (sterili con rilascio totale) 10mL e 1mL graduate in volumi di 0.1 ml (opzionale) Spatole sterili 5.0 TERRENI DI COLTURA Diluente peptone salino (consente il maggior recupero di microrganismi) (DPS) Peptone Cloruro di sodio Acqua ph a 25 C 1.0 g 8.5 g 1 L Acqua peptonata tamponata W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 6 di 10

7 Peptone Cloruro di sodio Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph a 25 C 10.0 g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 L Agar BCIG Triptone Sali biliari No. 3 Agar BCIG Acqua ph a 25 C 20.0 g 1.5 g 15.0 g 75 mg 1 L 6.0 PROCEDIMENTO 6.1 Preparazione e diluizione del campione Seguendo la procedura descritta nello Standard Method F2 Preparazione del Campione e delle Diluizioni preparare un omogeneizzato a 10-1 in diluente peptone salino (DPS) o in acqua peptonata tamponata (APT) e, se richiesto, le successive diluizioni decimali in DPS. 6.2 Semina ed incubazione Seminare 0.5 ml di omogeneizzato alla concentrazione di 10-1 al centro di una piastra di agar BCIG precedentemente asciugata. Utilizzando una spatola sterile per distribuire l inoculo in modo accurato sulla superficie del terreno ponendo attenzione a non toccare i bordi della piastra di Petri. Lasciare assorbire l inoculo nel terreno ed inserire in un termostato a ciclo automatico a 30 C per 4 1 ore e poi a 44 C per 18 2 ore. Quando è necessario il riscontro di 10ufc/g utilizzare due piastre, ciascuna seminata con 0,5 ml di omogeneizzato Quando sono attese concentrazioni di E. coli > 10 3 /g utilizzare, oltre alla piastra per spatolamento, un piastratore a spirale per seminare 50 µl della diluizione 10-1 su una piastra di agar BCIG, come descritto nello Standard Method F 4 Preparazione del Campione e delle Diluizioni. 6.3 Conteggio colonie Esaminare le piastre di agar BCIG per la presenza di colonie di colore blu (ß-glucoronidasi positive). Utilizzando piastre contenenti fino a 150 colonie contare e registrare il numero di colonie tipiche. 6.4 Prove di conferma Non sono richieste prove di conferma. L identificazione si avvale della crescita su agar bile triptone a 44 C e della reazione positiva alla ß-glucoronidasi (colonie blu). Ceppi di controllo Controllo positivo: E. coli NCTC 9001 Controllo negativo: K. aerogenes NCTC 9528 W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 7 di 10

8 7.0 CALCOLO DEI RISULTATI I conteggi dovrebbero essere effettuati, ove possibile, utilizzando le diluizioni che presentano 15 o più colonie per piastra. Calcolare il numero di E. coli per grammo nel modo seguente:- Numero per g = No. colonie confermato x Fattore di diluizione No colonie saggiato 8.0 ESPRESSIONE DEI RISULTATI Se non sono rilevate colonie di colore blu refertare nel modo seguente: Inferiore a 20/g o ml Quando è stato seminato 0.5 ml di una diluizione 10-1 in una sola piastra o Inferiore a 10/g o ml Quando è stato seminato 0.5 ml di una diluizione 10-1 in due piastre Se i il numero di microrganismi ricercati è fra 10 e 99 per grammo refertare: a per g o ml ove a è il numero compreso fra 10 e 99 Se il numero di microrganismi ricercati è pari a 1100 o superiore per g o ml refertare: a x 10 b ufc/g o ml ove a non è mai inferiore a 1.0 o superiore a 9.9 e b rappresenta l appropriata potenza di dieci Arrotondare il numero per eccesso se l ultima cifra è uguale o superiore a 5 e per difetto se l ultima cifra è 4 o minore: esempio ufc per g è repertato come 1,9 x 10 3 ufc per g ; ufc per g è repertato come 2.4 x 10 5 ufc per g W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 8 di 10

9 Allegato: Diagramma di flusso che illustra il conteggio diretto di Escherichia coli Preparare una diluizione10-1 del campione Omogeneizzare con stomacher Se richiesto preparare diluizioni successive in diluente peptone salino Eseguire sottocolture con 0,5 ml sulla superficie di una piastra BCIG Incubare a 30 C for 4 hours and 44 C for 18 hours Conteggiare le tipiche colonie di colore blu W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 9 di 10

10 REFERENCES 1 PHLS. Microbiological guidelines for some ready-to-eat foods at the point of sale: an expert opinion from the Public Health Laboratory Service (PHLS). PHLS Microbiology Digest. 1996; 13: Department of Health, Guidelines for Cook Chill and Cook Freeze Catering Systems. London: HMSO, 1989 W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 10 di 10