I principali lipidi del metabolismo. Lipoproteine metabolismo delle lipoproteine valutazione del metabolismo lipidico.

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1 I principali lipidi del metabolismo Lipoproteine metabolismo delle lipoproteine valutazione del metabolismo lipidico Insolubili in acqua, solubili in solventi organici. I principali lipidi sierici: ACIDI GRASSI LIBERI TRIGLICERIDI: sono costituiti da una molecola di glicerolo esterificata con tre acidi grassi uguali (trigliceride semplice) o diversi (trigliceride misto) FOSFOLIPIDI COLESTEROLO: è un costituente importante delle membrane biologiche ed è anche il composto di base per la sintesi degli ormoni steroidei e degli acidi biliari TRIGLICERIDE FOSFOLIPIDE Cholesteryl Ester O P N R C O N BASE AZOTATA P FOSFORO ACIDO GRASSO Digestione dei lipidi I lipidi rappresentano il 20-40% delle calorie assunte con la dieta. I principali lipidi contenuti negli alimenti sono: Trigliceridi Fosfogliceridi Colesterolo Esteri del colesterolo I lipidi assunti con la dieta, sono soggetti a due principali processi: l emulsionamento, in cui i lipidi assunti con la dieta e presenti nell intestino sono circondati da strutture polari (principalmente sali biliari rilasciati dal fegato) formando delle strutture chiamate micelle; la digestione (o idrolisi), che avviene attraverso l intervento di enzimi digestivi rilasciati dal pancreas ed immessi nell intestino. Questo permette ai lipidi di essere assorbiti dall enterocita. Le lipoproteine I lipidi sono composti non idrosolubili, quindi, per poter essere immessi nel sangue e trasportati ai diversi organi e tessuti, devono essere in qualche modo resi idrosolubili. Per questo motivo, essi vengono circondati da un involucro di proteine (chiamate apoproteine) e formano una struttura che prende il nome di lipoproteina. La lipoproteina è costituita da un involucro esterno proteico, ed un core centrale che contiene lipidi, questa struttura rispecchia la sua funzione principale: trasporto dei lipidi e delle sostanze idrofobiche nel sangue. Classificazione delle lipoproteine Le lipoproteine che sono classificate in base a: Densità Contenuto proporzionale di lipidi e proteine Tipo di apoproteina Tipo prevalente di lipidi contenuti nel core Il contenuto in lipidi delle lipoproteine è in rapporto diretto con le dimensioni ma inversamente correlato con la loro densità Passando dai chilomicroni alle HDL, il rapporto tra contenuto di lipidi e contenuto di proteine diminuisce, e quindi la densità della lipoproteina progressivamente aumenta. Oltre ai lipidi, anche le apoproteine che costituiscono le diverse classi di lipoproteine sono differenti; le apoproteine, oltre a svolgere la funzione di costituire un involucro intorno al core lipidico per rendere la molecola più idrosolubile, hanno anche alcune funzioni specifiche CHILOMICRONI LDL HDL DIAMETRO % COLEST. LIB MOBILITA ELETROF. Origine Pre β β α % COLEST. ESTER % TRIGLICERIDI 80-90* % FOSFOLIPIDI % PROTEINE APOLIPOPROT. B-48 B-1OO B-100 AI, AII 1

2 SEPARAZIONE DELLE LIPOPROTEINE DEL PLASMA MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO ZONA DI APPLICAZIONE DEL PLASMA CHILOMICRONI LDL (β) (Pre β) HDL (α) + Le principali caratteristiche delle lipoproteine Due sono i grandi complessi ricchi in trigliceridi: Chilomicromi: trasportano i lipidi di origine esogena dall intestino a tutte le cellule (Very Low Density Lipoproteins): trasportano i lipidi di origine endogena dal fegato alle cellule; contengono i trigliceridi endogeni sintetizzati nel fegato; deviano la luce e, ad elevati livelli,determinano IPERLIPEMIA (plasma torbido e lattescente). Le altre sono più piccole e contengono principalmente colesterolo: LDL (Low Density Lipoproteins): costituite da fosfolipidi e colesterololibero ed esterificato HDL (High Density Lipoproteins): contengono colesterolo e fosfolipidi non deviano la luce e non determinano lipemia. IDL (Intermediate Density Lipoproteins): stato transitorio che si forma durante la conversione delle in LDL Chilomicroni Sono le lipoproteine più grandi. Hanno un elevato rapporto tra lipidi e proteine, e questo ne determina la bassissima densità; i principali lipidi presenti nel core sono i trigliceridi; in superficie contiene diverse apoproteine (Apo A-I, Apo B, Apo C ed Apo E). I chilomicroni sono la classe di lipoproteine formate nell enterocita dopo l assorbimento intestinale dei lipidi, ed hanno la principale funzione di trasportare i trigliceridi ai tessuti, principalmente quello adiposo e muscolare. (very low density lipoprotein, lipoproteine a densità molto bassa) Sono al secondo posto dopo i chilomicroni per densità e per contenuto in trigliceridi, contengono inoltre una quota di colesterolo Le sono sintetizzate nel fegato; trasportano e cedono una parte dei loro lipidi ai diversi tessuti, e gradualmente si trasformano in IDL IDL (intermediate density lipoprotein) hanno densità intermedia, e minor rapporto lipidi/proteine rispetto alle. Derivano dalle dopo che queste hanno ceduto una quota di trigliceridi al tessuto adiposo, quindi, rispetto alle contengono una minor quota di trigliceridi contengono inoltre colesterolo La principale apoproteina di superficie è l apo B. Le IDL sono a loro volta i precursori delle LDL LDL (low density lipoprtoein, lipoproteine a bassa densità) contengono, come quota lipidica, soprattutto esteri del colesterolo derivano dalle IDL (rispetto alle quali sono molto più piccole) ed hanno la funzione di trasportare il colesterolo al fegato. In superficie contengono principalmente l apo B che serve ad interagire con un recettore specifico localizzato sulla superficie dell epatocita: attraverso questa interazione la LDL viene internalizzata dall epatocita e trasporta il colesterolo all interno della cellula epatica 2

3 HDL (high density lipoprotein, lipoproteine ad alta densità) sono le lipoproteine che contengono la minor quota percentuale di lipidi rispetto alle proteine, e contengono principalmente fosfolipidi e colesterolo. La funzione delle HDL è quella di recuperare colesterolo dai tessuti, come ad esempio dai vasi arteriosi. Per questo motivo vengono considerate lipoproteine buone poichè proteggono dallo sviluppo di aterosclerosi. Il meccanismo di recupero è favorito dalla presenza dell enzima LCAT (Lcolesterolo aciltrasferasi), che aggiunge un gruppo acile al carbonio 3 del colesterolo, rendendo il colesterolo ancor più liposolubile, e favorendo quindi il suo ingresso nel core della HDL. Funzione delle apoproteine Le diverse apoproteine presenti sulla superficie della lipoproteina non hanno soltanto la funzione di favorire la solubilizzazione dei lipidi e quindi il loro trasporto nel sangue, ma hanno anche numerose funzioni specifiche. Ad esempio: La Apo B 48 presente sui chilomicroni, serve a riconoscere il recettore per i chilomicroni sulla cellula adiposa, e quindi favorisce il rilascio di trigliceridi al tessuto adiposo La Apo CII presente sulla superficie del chilomicrone, attiva l enzima lipoprotein-lipasi, che serve a scindere il legame tra glicerolo ed acidi grassi presenti nei trigliceridi e facilitando così l ingresso degli acidi grassi nel tessuto adiposo La Apo B 100, presente sulle LDL serve a riconoscere il recettore presente sulla superficie dell epatocita, consentendo così l ingresso della LDL nella cellula epatica Apo AI Sede sintesi Fegato, Intestino Lipoproteine HDL Funzione Attivatore LCAT Schema del metabolismo delle lipoproteine AII Fegato, Intestino HDL B100 Fegato LDL, Catabolismo LDL per interazione con il recettore LDL B48 Intestino Chilomicroni Assemblaggio chilomicroni CI Fegato Attivatore LCAT, Inibitore catabolismo IDL,, Remnants CII Fegato,HDL Attivatore LPL CIII Fegato Inibisce l assunzione epatica delle e dei residui dei chilomicroni D Vari tessuti Trasferimento degli esteri del colesterolo E Fegato, LDL Fattore di riconoscimento e di legame dei residui dei chilomicroni e delle remnants da parte delle cellule LCAT= Lecitin cholesterol acyl transferasi: Esterifica il colesterolo libero LPL=Lipoprotein Lipasi: idrolizza i trigliceridi 1.Colesterolo e trigliceridi vengono assorbiti a livello intestinale 2.L epatocita incorpora colesterolo ma soprattutto trigliceridi nel chilomicrone 3.Il chilomicrone passa in circolo e raggiunge il tessuto adiposo; attraverso l Apo B 48 di superficie il chilomicrone riconosce un recettore e attraverso l Apo CII attiva l enzima lipoprotein lipasi. Quest enzima scinde il legame tra acidi grassi e glicerolo presente nei trigliceridi e favorisce l ingresso deglia cidi grassi nell adipocita. 4.Le LDL, che derivano da lipoproteine a più bassa densità, trasportano il colesterolo al fegato che ha bisogno di colesterolo per la sintesi dei sali biliari; l Apo B 100 presente sulla superficie della LDL riconosce un recettore sull epatocita e questo favorisce l ingresso della LDL (e quindi di colesterolo) nel fegato. Le LDL tendono anche a cedere colesterolo all endotelio vascolare, innescando il processo dell aterosclerosi. 5.Le HDL trasportano colesterolo ai tessuti steroidogenici, ad esempio le ghiandole del corticosurrene che hanno bisogno di colesterolo per la sintesi degli ormoni steroidei, ma recupera anche il colesterolo depositato sull endotelio vascolare. Il rischio cardiovascolare I fattori di rischio tradizionali (ad es., ipertensione, iperlipidemia,fumo, diabete) non sono in grado di spiegare completamente la variabilità interindividuale nel rischio cardiovascolare. Ad esempio, un ampia percentuale di individui che soffrono di malattia cardiovascolare hanno pochi o nessun fattore di rischio. La sfida per clinici, ricercatori e laboratoristi è quella di identificare gli individui a rischio di eventi cardiovascolari molto prima che i sintomi appaiano. Gli interventi di prevenzione possono infatti essere più efficaci in questo periodo, in quanto l'aterosclerosi richiede decenni prima di manifestarsi. Parametri di laboratorio per la valutazione del metabolismo lipidico 1.Parametri di I livello: colesterolemia e trigliceridemia 2.Parametri di II livello: colesterolo LDL e colesterolo HDL 3.Altri parametri (in genere riservati ad una valutazione più specialistica): ad esempio ricerca di mutazioni nel gene del recettore per le LDL Se il rischio cardiovascolare di un determinato paziente è particolarmente elevato, sarà più probabile che il clinico inizi una terapia farmacologica tesa ad abbassare il colesterolo LDL (con le statine) o a ridurre il rischio trombotico (con l aspirina). 3

4 Colesterolo e trigliceridi La valutazione del colesterolo e dei trigliceridi nel siero, richiede alcune considerazioni: A differenza di altri parametri di laboratorio, per il colesterolo e i trigliceridi sierici non vi sono intervalli di riferimento, ma piuttosto valori desiderabili* oppure valori decisionali**, che corrispondono a: 190 mg/dl per il colesterolo 180 mg/dl per i trigliceridi è fortemente consigliato che i valori di colesterolo e trigliceridi sierici siano inferiori Considerazione n. 1 Nel mondo occidentale una larga parte della popolazione presenta valori di colesterolo superiori a 190 mg/dl e quindi associati a rischi elevati gli intervalli di riferimento non sono adeguati ad esprimere la relazione di un dato valore di colesterolo con il rischio! Popolazione italiana n = 2500 *valori desiderabili : valori che non corrispondono a rischio **valori decisionali : valori che fanno decidere per ulteriori indagini o per una terapia colesterolo, mg/dl Considerazione n. 2 Considerazione n. 3 La relazione fra colesterolemia totale e rischio cardiovascolare è continua La relazione fra colesterolemia totale o LDL e rischio cardiovascolare è continua ma reversibile: gli studi di intervento ne hanno dimostrato la reversibilità! death rate per 1000 men Serum cholesterol, mg / dl cumulative incidence 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 placebo 37% risk reduction drug Jama 1998; 279: anni Valutazione del rischio cardiovascolare Le linee guida internazionali per la prevenzione di eventi cardiovascolari suggeriscono che l iter diagnosticoterapeutico inizi con la valutazione del rischio cardiovascolare globale Fattori di rischio maggiori: Ipertensione, diabete, età, sesso, fumo, colesterolo In presenza di valori più elevati, spesso non sono presenti malattie in atto, ma piuttosto inizia a crescere in maniera progressiva il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari. La variabilità biologica influenza significativamente i valori di colesterolo sierico; quindi è buona norma conoscere la variabilità biologica e la variabilità analitica del metodo di dosaggio utilizzato, e calcolare la differenza critica, cioè il valore che rende realmente significativa una differenza di valori di colesterolo osservata in un individuo. 4

5 Le differenze critiche consentono di calcolare in modo rigoroso la differenza minima che due risultati in tempi successivi della stessa analisi devono avere perchè si possa concludere che i risultati sono tra loro significativamente diversi. Variabilità biologica espressa ed indice di individualità Le differenze critiche possono essere calcolate facilmente, conoscendo la variabilità analitica e la variabilità biologica che caratterizzano un dato analita Se la differenza tra due valori consecutivamente osservati in un dato soggetto eccede il valore della differenza critica, bisogna ritenere, con una probabilità del 5% di sbagliare (è questo il livello di confidenza statistica qui impiegato) che i due valori differiscono significativamente tra loro. I valori delle differenze critiche dei principali analiti sono calcolati in tabelle assumendo che la variabilità analitica sia la metà della variabilità biologica. Poichè il colesterolo è molto influenzato dalla variabilità biologica, è buona norma effettuare più controlli nel tempo, prima di definire il range di livelli di colesterolo propri di un individuo. I livelli di colesterolo e ancor più di trigliceridi risentono del periodo di digiuno prima del Per prelievo, indici per di cui individualità è rigorosamente <0.6 necessario utilizzo verificare degli che intervalli il soggetto, prima del prelievo, sia a digiuno da 8 ore. di riferimento di scarsa utilità Parametri di laboratorio dal I al II livello Valori ripetuti di colesterolo e trigliceridi inferiori ai valori decisionali sono suggestivi di un normale metabolismo lipidico, non è richiesto in genere un approfondimento con esami di II scelta Valori di colesterolo e/o trigliceridi >300 mg/dl (se il soggetto ha rispettato le norme di digiuno da 8 ore), sono fortemente suggestivi di un alterazione metabolica o di patologie associate a ipercolesterolemia o ipertrigliceridemia, o infine di una iperlipoproteinemia familiare. In questi casi è opportuno suggerire al paziente una valutazione da parte di uno specialista. Valori di colesterolo superiori ai valori decisionali, ma comunque non particolarmente elevati, possono essere associati a patologie, ma anche ad una dieta fortemente sbilanciata; in questi casi è opportuno effettuare una valutazione degli esami di II scelta. Gli esami di II scelta Gli esami di II scelta per la valutazione del metabolismo lipidico sono rappresentati dalla valutazione delle frazioni del colesterolo. Il colesterolo circolante è contenuto principalmente nelle LDL (che hanno tendenza a cedere colesterolo al tessuto endoteliale) e nelle HDL (che hanno la tendenza opposta, ossia quella di recuperare il colesterolo ceduto ai tessuti vascolari). Quando si dosa il colesterolo sierico, esso rappresenta la somma di quello contenuto nelle diverse lipoproteine, per cui non abbiamo un informazione completa sull eventuale rischio di sviluppare malattie cardiovascolari dovute all accumulo di colesterolo nei tessuti. VARIABILITA PRE-ANALITICA: 1. PAZIENTE Variabilità biologica fonte ineliminabile di variabilità Quindi, nei soggetti che mostrano livelli di colesterolo moderatamente superiori ai valori decisionali è utile il dosaggio del colesterolo contenuto nelle diverse lipoproteine, e quindi: Colesterolo LDL, i cui valori sierici non devono superare i valori decisionali di 160 mg/dl. Colesterolo HDL, i cui valori desiderabili devono essere superiori a 40 mg/dl. Col totale Col HDL Col LDL trig CVb ~ 6% 7% 9% 20% Gli effetti della VB si controllano effettuando più di 1 misura a distanza di qualche settimana (due - quattro) 5

6 VARIABILITA PRE-ANALITICA: 2. PRELIEVO VARIABILITA PRE-ANALITICA: 3. CAMPIONE ortostatismo 10% PRELIEVO occlusione 10% CAMPIONE siero/plasma conservazione Standardizzazione: Standardizzazione: posizione seduta (da almeno 5 min.) EDTA 5% + 4 C per 4-5 giorni - 70 C se >1 settimana laccio (il meno possibile) Metodi routinari di dosaggio del colesterolo METODI CHIMICI METODI ENZIMATICI CHOD / POD / TRINDER METODI ENZIMATICI Siero Colesterolo 2/3 esteri del colesterolo 1/3 in forma libera Esteri colesterolo colesterolo +R-COOH Esterasi di Pseudomonas: specificità acidi grassi legati al colesterolo METODO ENZIMATICO CHOD/ POD/TRINDER Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi ossidasi Colesterolo + O 2 colestenone + H 2 O 2 METODI CHIMICI Dosaggio del colestenone o perossidasi H 2 O aminofenazone + fenolo 4-p-benzochinone-monoimino-fenazone + H 2 O METODI ENZIMATICI con idrolisi chimica completamente enzimatici Misura a 500 nm 6

7 Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi METODI ENZIMATICI con idrolisi chimica dei trigliceridi con alcali a caldo con idrolisi enzimatica dei trigliceridi con lipasi Trigliceridi Lipasi glicerolo + acidi grassi glicerolo + ATP glicerolo-3.fosfato +ADP Glicerolo chinani ADP + fosfoenolpiruvato piruvatochinasi ATP + piruvato Piruvato + NADH + H latticodeidrogenasi Lattato + NAD Il NADH consumato è in rapporto stechiometrico con il glicerolo Svantaggi Reattivi poco stabili Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi METODI ENZIMATICI glicerolo-3.fosfato + O2 glicerolofosfato.- diidrossiacetone fosfato + H 2 O 2 ossidasi H 2 O clorofenolo-4-aminofenazone Reazione Trinder misurata 500nm perossidasi Svantaggi Bilirubina inibisce la formazione del cromoforo Vantaggi Buona precisione, reattivi stabili nel tempo fenazone +2 H 2 O+ HCl VARIABILITA ANALITICA: 2.COLESTEROLO HDL METODI DI PRECIPITAZIONE PER LA MISURA DI HDL COLESTEROLO Metodo Definitivo? Standard Primario? Metodo di Riferimento eparina-mn (su d> 1.006) Metodi Routinari precipitanti, omogenei (diretti) Interazione tra cariche degli agenti precipitanti (polianioni e/o cationi bivalenti) e quelle delle lipoproteine contenenti APOB Precipitazione con: eparina/magnesio fosfotungstato/magnesio solfato di Destrano/Magnesio PEG VARIABILITA ANALITICA: 3.COLESTEROLO LDL Formula di Friedewald C-LDL =C-totale - (C-HDL + TG / 5) Vantaggi fa risparmiare tempo e denaro utilizzata negli studi epidemiologici VARIABILITA ANALITICA: 3. COLESTEROLO LDL Standardizzazione: formula di Friedewald: verificare l accuratezza di col tot, HDL e TG metodi omogenei: utilizzare materiali certificati Svantaggi solo se TG < 4,5 mmol/l; 400 mg/dl dipende da precisione, accuratezza e variabilità biologica di C-tot, C-HDL e T COL / TG in variabile è una stima 7

8 FLOW-CHART PER LA GESTIONE DELLA RICHIESTA DI PROFILO LIPIDICO VARIABILITA ANALITICA: 4. TRIGLICERIDI Standardizzazione: fisiologicamente la concentrazione del glicerolo è ~ 0.3 mmol/l; 3mg/dL cause pre-analitiche di apporto: tappi, materiali di calibrazione paziente: diabete, trattamento con eparina, edema cerebrale soggetto ospedalizzati: glicerolo bianco PROPOSTA DI REFERTAZIONE PER I LIPIDI PLASMATICI da parte del Gruppo di studio SIBioC-SISA INTERPRETAZIONI DEI RISULTATI Refertazione Le linee guida internazionali per la prevenzione di CHD fissano valori di colesterolo totale e LDL quali target terapeutici in funzione degli altri fattori di rischio presenti Colesterolo totale valore decisionale 190 mg/dl Colesterolo-HDL valore desiderabile (M) 39 mg/dl (F) 43 mg/dl Colesterolo-LDL valore decisionale 160 mg/dl Trigliceridi valore desiderabile 180 mg/dl ATP III (Adult Treatment Panel III - National Cholesterol Education Program) Risk category LDL goal mmol/l; mg/dl CHD and CHD equivalents < 2,6; 100 multiple risk factors < 3,4; risk factor < 4,1; 160 Strategia per la valutazione del rischio lipidico Parametri: Colesterolo totale, HDL, LDL, Trigliceridi Rischio globale individuale Il punteggio ottenuto rappresenta la probabilità di incorrere in un primo evento cardiovascolare fatale o non, nei successivi 10 anni priorità 1. Pazienti con patologia cardiovascolare (prevenzione secondaria) 2. Soggetti a rischio elevato per la coesistenza di più fattori di rischio (fumo, obesità, ipertensione, diabete) 3. Parenti di 1 grado dei soggetti del punto 1 e 2 4.Tutti i soggetti che vengono a contatto con le strutture sanitarie per altre cause 8

9 Calcolo del rischio Il National Cholesterol Education Program-Adult Treatment Panel III propone una refertazione basata sul confronto con più livelli decisionali, dal desiderabile, al bordeline, all elevato. Tuttavia, l integrazione con informazioni come l età, il diabete, l ipertensione, l abitudine al fumo determinano rischi cardiovascolari molto differenti che dovrebbero essere espressi nel referto. La refertazione dei lipidi, soprattutto nella valutazione del rischio, è una refertazione critica, che può indurre ad un azione anche farmacologica. L efficacia della terapia è monitorata sulle concentrazioni di colesterolo e delle lipoproteine a bassa densità (LDL-C). Questo fatto può essere di grande efficacia clinica nei soggetti a rischio, oppure inappropriato in soggetti non a rischio, anche se con iperlipemie. 9