Come facciamo ad isolare un gene da un organismo? Utilizziamo una libreria ovvero una collezione dei geni del genoma del cromosoma di un organismo
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1 Come facciamo ad isolare un gene da un organismo? Utilizziamo una libreria ovvero una collezione dei geni del genoma del cromosoma di un organismo
2 GENOMA di alcuni organismi viventi raffigurato come libri
3 Come si fa a clonare un gene da un organismo? genoteca Si parte da una Un gruppo di cloni di DNA contenente, nell insieme, l intero genoma. Genoteca di DNA genomico Genoteca cromosomica Genoteca di cdna
4 Come ottenere DNA clonabile? -Frammentazione meccanica (ago da siringa, sonicazione) -Taglio con enzimi di restrizione Enzimi con siti di riconoscimento 4 basi (Hae III, Sau3A, HpaII, HhaI ) 6 basi (Bam H1, Bgl II, Eco RI, Hind III ) 8 basi (Not I, ) Quale enzima taglierà più spesso nel genoma? Considerando un DNA con una distribuzione casuale di coppie di nt, vi sarà uguale probabilità di trovare uno dei 4 possibili nt G A T C in qualsiasi posizione. La sequenza di riconoscimento AAGCTT si ritroverà con una probabilità calcolata così: (P) A= 1/4 (P) A= 1/4 Ogni base si ritroverà con una probabilità che è (P) G = 1/4 indipendente dalle altre. (P) C= 1/4 (P) complessiva= (1/4)6 (P) T= 1/4 (P) T= 1/4 In generale (1/4 )n
5 E R 6 basi BamH1 Y F G Your Favorite Gene BamH1 BamH1 BamH1 BamH1 Il gene può venire tagliato, la libreria deve contenere pezzi molto grandi. E R 4 basi Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Sau3A Il gene può venire tagliato ma si possono fare digestioni parziali
6 COSTRUZIONE DI LIBRERIA GENOMICA
7 Come creare molecole di DNA ricombinanti con i vettori plasmidici
8 Rappresentatività di una libreria
9 DNA cellula aploide umana 3 X 10 9 bp digestione Frammenti di circa 150 kb Da inserire in vettori per costruire la libreria kb / 150 kb = cloni EQUIVALENTE GENOMICO Per essere sicuri con un certo livello di confidenza di avere una libreria che sia effettivamente rappresentativa del genoma (ovvero che contenga tutti i loci genomici) bisogna avere un numero f = di cloni 150 sempre kb / 3 superiore x 10 9 bp all equivalente = 0.5 x 10 genomico. -4 N = Quanto è la frazione di genoma contenuta in ogni clone? ln (1-p) ln (1-f) Quanti sono i cloni che devo analizzare per essere sicuro di avere tutti i frammenti di genoma nella mia libreria? Frazione di genoma che può essere contenuta in ogni clone N cloni necessari per ottenere con frammenti di lunghezza relativa f la rappresentatività di tutti i cloni con probabilità p p 95% 99% 99.9% N 45 x x x 10 6
10 Le librerie genomiche non ci consentono di isolare geni interi o ne contengono in scarsa quantità Librerie a cdna
11 CLONARE UN cdna...
12 Come si convertono i trascritti di RNA in cdna S1 nucleasi
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16 Screening di una genoteca tramite ibridazione con una sonda marcata
17 Screening Immunologico Al filtro si legheranno le proteine. Solo quelle che riconoscono l anticorpo identificano il clone di nostro interesse
18 Nell era postgenomica il genoma è stato completamente sequenziato Ma la sequenza non ci dà informazioni sulla funzione dei geni Human Genome Mapping Project Mammalian Gene Collection Forniscono un plasmide contenente una copia di cdna di un gene specifico di uomo o di topo
19 Radioattiva; Fluorescente; Chemiluminescente DNA RNA 1. Random priming 2. Nick Translation 3. Marcatura terminale Si ottiene con la trascrizione in vitro Anticorpo Identifica direttamente il prodotto = proteina
20 Marcatura di una sonda Esonucleasi 5-3 polimerasi 5-3 Random Primer Nick Translation
21 Marcatura terminale Polynucleotide KINASI 32 P 32 P 32 P 32 P
22 Se conosco la sequenza della proteina in amminoacidi come posso costruire una sonda di DNA (oligonucleotidi)? Devo conoscere il codice genetico
23 Librerie basate su PCR Ovvero su RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
24 Librerie sottrattive Libreria Driver Marcata con biotina Libreria tester Per isolare geni espressi in modo differenziale
25 Screening attraverso la complementazione funzionale CDC2+ transform CDC2+ chr cdc2 - chr cdc2 - Yeast cell Blocco G1 del ciclo cellulare (mutazione in un gene chiave del ciclo) Yeast cell La cellula riprende il normale ciclo cellulare
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