Utilizzo delle tecniche molecolari per lo studio della distrofia muscolare di Duchenne-Becker

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1 ~ Utilizzo delle tecniche molecolari per lo studio della distrofia muscolare di Duchenne-Becker E. PELO, S. FRUSCON, F. SBERNN, F. TORRCELL U.O. Citogenetica Azienda Ospedaliera Careggi FRENZE NTRODUZONE Nell'ultimo decennio l'analisi del DNA ha cominciato a rappresentare una metodologia valida sia nel laboratorio clinico, sia nella diagnostica di un numero sempre maggiore di malattie genetiche. Soprattutto nel campo dei disordini monofattoriali come le talassemie, la fibrosi cistica, la distrofia muscolare' e le emoglobinopatie, le tecniche della biologia molecolare si sono rivelate vincenti. l numero delle malattie genetiche identificabili mediante l'analisi del DNA cresce parallelamente alla determinazione di nuovi geni malattia. l metodo di scelta per la diagnosi di molte malattie genetiche è attualmente la PCR, soprattutto per i suoi vantaggi di accuratezza e sensibilità. DSTROFA MUSCOLARE D DUCHENNE-BECKER La distrofia muscolare di Duchenne-Becker (D/BMD) è tra i difetti genetici più frequenti; viene ereditata in forma recessiva legata...al cromosoma X e la sua incidenza è, per la DMD, di 1/500 maschi nati vivi, mentre la forma Becker è 10 volte meno frequente (1). La forma Duchenne e la forma Becker vengono discriminate in base al decorso clinico. La DMD è la forma, per così dire, grave dove la diagnosi corretta viene fatta entro i cinque anni, ma almeno la metà dei pazienti presenta già qualche segno della malattia prima della deambulazione autonoma. Con il passare del tempo aumentano le difficoltà a camminare, correre, salire le scale, rialzarsi e diviene sempre più evidente la deambulazione anserina. Dopo la perdita della deambulazione, verso i 12 anni, compaiono la scoliosi e le contratture muscolari. muscoli lisci sono meno interessati dal processo patologico, mentre il cuore diviene ipertrofico e possono manifestarsi vari tipi di aritmia. n molti casi si osserva un modesto ritardo mentale non progressivo. La morte sopraggiunge durante l'adolescenza e non più del 20-25% dei casi sopravvive oltre i 25-0 anni. La BMD provoca debolezza ed atrofia degli stessi muscoli interessati nella Duchenne, ma ha un esordio più tardivo, verso gli 11 anni, e un decorso più benigno. L'età media nella quale viene persa la capacità di camminare è 25-0 anni; la morte sopraggiunge di solito nella quinta decade. L'interessamento cardiaco è meno frequente e le facoltà intellettive sono normali. DSTROFNA: GENE E PROTENA La localizzazione del gene DMD-BMD sul cromosoma X è nota fin dal 1951, anche se i primi studi eseguiti all'inzio del secolo, avevano già identificato le manifestazioni cliniche della malattia nei maschi nati da femmine sane (Fig. 1). Le prime osservazioni favorevoli alla localizzazione del gene sul braccio corto del cromosoma X in posizione p21 si ottennero da rari casi di femmine con fenotipo Duchenne. Gli studi citogenetici su queste pazienti mostrarono una traslocazione X-Autosomica (2) con punto di rottura nella banda Xp21. Successivamente fu avviato lo studio della regione Xp21 utilizzando sonde di DNA in grado di individuare polimorfismi di restrizione (). Furono utilizzati marcatori sia in posizione distale che prossimale nella regione che doveva contenere il gene DM D, e si vide che questi marcatori segregavano con il gene DMD nelle famiglie Duchenne presentando ciascuno una frequenza di ricombinazione del 20%, successivamente furono isolate sonde più vicine al gene DMD come la C7 in prossimità ' e la 754 in 5', tutt'oggi utilizzate per gli studi di linkage. Le stesse sonde risultarono informative anche per le famiglie Becker, dove i marcatori genici segregavano in modo simile alla Duchenne. Così si giunse alla conclusione che il gene responsabile delle forme Becker doveva mappare nella stessa banda Xp21 in cui era localizzato il gene DMD. Gli studi successivi hanno poi confermato questa localizzazione e chiarito che il gene codifica per una proteina detta distrofina. l gene per questa proteina è 2,4 Mb di DNA; la sequenza codificante è costituita da 79 esani separati da introni di circa 200 kb; un introne particolarmente grande è presente all'estremità 5' del gene ed un altro tra gli esani 44 e 45. La proteina ha un peso molecolare di 427 kd (4-5), èò costituita da 685 aminoacidi ed ha una struttura filamentosa in cui si riconoscono quattro domini principali: - una porzione N-terminale simile al dominio che lega l'actina della a. actinina - una porzione di sequenze ripetute - un dominio ricco di cisteina simile al dominio C-terminale della a. actinina - una porzione C-terminale che non presenta omologia con altre proteine note Essa è localizzata lungo la membrana sarcoplasmatica ed è ancorata alla membrana mediante il DAP-Complex (Fig. 2). Questo complesso serve per collegare la distrofina alla membrana ed è costituito da 6 proteine di 59, 25, 50, 4, 5, 156 kd rispettivamente. Le componenti da 59 e 25 kd non sono glicosilate, le altre si. l dominio ricco di cisteina e il C-terminale della distrofina sono legati al DAP-Complex attraverso la componente da 59 kd, che a sua volta è strettamente legata a 4 DAP transmembrana con peso molecolare di 25, 50, 4, 5 kd che sono associate con una proteina UGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

2 OMOgeoe, -2 x 10 bp DMOmRNA iluili'h","'""""',"",,,,,,,,,,,,, "'ii"hlicrt -14 x 10 bp dystrophin -.6 x 10 aa FGURA 1 a) localizzazione del gene della Distrofina sul Cromosoma X; b) gene della Distrofina; c) mrna per Distro.tllla; d) Distrofina FGURA 2 Modello schematico della Distrofina, del DAP-Complex, e della Laminina La Distro.tlna si presenta come un dimero antiparallelo. L 'estremità C-Terminale di ciascuna molecola di Distrofina è legata con la componente da 59kD del DAP-Complex, mentre l'estremità N-Terminale si lega con l'actina. La componente da 156 kd del DAP-Complex si lega con la porzione merosinica della Laminina. LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

3 della superficie esterna della membrana cellulare di 156 kd; quest'ultima si lega alla componente merosinica della laminina della matrice extracellulare. La funzione della proteina è quella di stabilizzare la membrana delle cellule muscolari. Secondo la legge di Haldane ad ogni generazione un terzo dei pazienti DBMD porta una nuova mutazione originata nei gameti paterni o materni. restanti casi sono dovuti a mutazioni ereditate attraverso la rnadre, che presumibilmente sono originate come nuove mutazioni in una generazione precedente. DAGNOS MOLECOLARE D DUCHENNE-BECKER Prima della scoperta del gene della distrofina, la diagnosi delle forme di DBMD era basata su dati clinici, aumento del CK nel siero, caratteristiche morfologiche della biopsia muscolare e studi elettromiografici. Dopo l'identificazione del gene e della proteina gli studi sul DNA, o l'analisi della distrofina con immunoblot e metodi immunoistochimici, hanno permesso diagnosi anche di casi sporadici di Duchenne e Becker non solo in base all'età, ma individuando direttamente le diverse anomalie della distrofina. Le alterazioni del gene sono rappresentate nel 65% da delezioni, nel 7% da duplicazioni, ed il resto da mutazioni puntiformi o da microdelezioni (Fig. 4) (6). Le delezioni possono interessare qualsiasi parte del gene della distrofina, ma preferenzialmente si trovano in due regioni dette "hot-spot", ossia zone ad alta frequenza di mutazioni; il 40% mappa nella regione centrale del gene, a 1200 kb dal promotore, mentre il 20% si verifica a circa 500 kb all'estremità 5' del gene. L'estensione e la localizzazione delle delezioni sembrano non correlare con la gravità e la progressione della malattia. Secondo l'ipotesi di Monaco (7) le delezioni creano uno slittamento del modulo di lettura del trascritto (Fig. 5). Si parla di delezioni OUT-FRAME quando la mutazione porta ad uno slittamento del modulo di lettura e di conseguenza all'assenza della proteina o alla produzione di una proteina troncata ed instabile dando luogo alla forma più grave della malattia (DM D). Si hanno delle delezioni N-FRAME quando il modulo di lettura non viene alterato dalla delezione e si produce una proteina anomala ma parzialmente funzionante che caratterizza la forma più lieve della malattia. Le delezioni possono essere testate direttamente con la PCR multipla che permette lo screening di minimo 18 esoni del gene della distrofina: Pm,, 4, 6, 8, 12, 1, 17, 19,4,44,45, 47,48, 50,51,52, 60 (Figg. 6, 7) (8-10).1155% dei pazienti con DMD e il 68% con BMD presentano almeno uno di questi esoni deleto. nizialmente l'indagine sul DNA utilizzava il Southern blot, quindi l'applicabilità e l'efficienza dell'uso di un metodo di PCR è ben chiaro. Le Multiplex PCR offrono numerosi vantaggi rispetto agli iniziali test per B/DMD. E' stato accertato che con la PCR multipla si individuano circa il 98% delle delezioni del gene della distrofina, permettendo una rapida diagnosi nel 45-50% di tutti i casi della malattia. l metodo ha un'alta accuratezza: in uno studio multicentrico del 1992 un risultato anomalo si è ottenuto in un caso su 745 (99,9% di accuratezza, con lo 0,01% di falsi positivi). Sempre riferendosi allo stesso studio multicentrico, l'individuazione delle delezioni si è rivelata accurata in 45 su 46 casi di delezione. Se non è stata trovata una delezione nel paziente, e la PCR multipla è così risultata non essere informativa, possono essere usati altri approcci diagnostici (11). Uno dei vantaggi dei dosaggi con PCR è la velocità. La PCR multipla può dare risultati anche in un giorno tenen- do presente che due settimane è il tempo normalmente richiesto per il Southern blot, l'elettromiografia e l'analisi istopatologica della biopsia muscolare. noltre la PCR è un metodo non radioattivo. Alcune precauzioni sono di aiuto per l'interpretazione dei risultati: la qualità e la quantità del DNA genomico aggiunto alla reazione può influenzare l'interpretabilità del risultato; troppo poco o di bassa qualità (OD260/0D280 minore di 1,8 (12)) può dare un amplificato insufficiente. Questo problema può generalmente essere risolto con cicli aggiuntivi alla PCR. Anche da un DNA parzialmente degradato si possono ottenere risultati chiari, tuttavia DNA di circa 1 o 2 kb, come quello ottenuto da sezioni paraffinate, può drammaticamente alterare il relativo prodotto di reazione. Sono sempre importanti un controllo positivo ed uno negativo. nfatti un'ulteriore potenziale causa di errore quando si usa la PCR, è la contaminazione da DNA non deleto, da DNA clonato, o da un precedente prodotto della reazione; in una diagnosi prenatale di DNA ottenuto da un prelievo di villo coriale può essere contaminato da DNA materno (1). PROTOCOLLO RACCOMANDATO PER LA DAGNOS D D/BMD La diagnosi molecolare di DBMD può essere richiesta in varie situazioni cliniche in presenza di sintomi o segni classici di distrofia, per un aumento dei livelli di CK e per segni di miopatia all'elettromiografia o alla biopsia muscolare, e in famiglie con storia positiva per distrofia di tipo Duchenne o Becker (Fig. ). Altre patologie neuromuscolari Maschio con probabile DBMD e storia familiare negativa No Duplicazioni/Delezioni Normale jt Non nformativo ~ Maschio con sospetta DBMD e storia familiare negativa WestemBlot per Distrnfina Possibiltà della Biopsia Muscolare nelle femmine per l'analisi della Distrofina lndividuazione delle Portatrici Analisi di Linkage FGURA Protocollo per la diagnosi di D/BMD (schema) Biopsia Muscolare Anonnale DMD Fenotipo BMD ntermedio ~ PCR elo Southem Blot per lo screening di delezioni duplicazioni Duplicazioni/Delezioni DBMD nformativo Diagnosi Prenatale ndividuzione delle Portatrici L1 GAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

4 A sa 1-2. B c ls6 U 1M U O.5 56+S SO ' » C).> 2e 28 2& > D amo lrl OMO '" ~ :~ii ~... : :2" :.'4 ::::~:. ~ l''~' ~ io 21"'~ 21!... ~ :::' ~~ /,tr~ ' l t t t ~ ::~.1 41 L::: ::::::::::::~::. '1 ' t;i i' ~.. t t,1 ti t t t 2 1 FGURA 4 Delezioni del gene della Distrofina, loro effetto sullo slittamento del modulo di lettura, e corrispondenza con ilfenotipo clinico dei pazienti COli D/BMD. Le barre verticali indicano l'estensione delle delezioni in 27 casi indipendenti di D/BMD. A) sonde a cdna della Distrofina utilizzate perl'individuazione delle delezioni (le sonde non sono mostrate poichè non sono state descritte le delezioni individuate da queste sonde)j B) nll1nero degli esonij C) esoni contenenti siti di taglio per Bind (misura in kb)j D) sono indicate l'estensione delle delezioni associate afenotipi BMD, intermedi, e DMDj LlGAND ASSAY VaL 1 NUMERO 1 ANNO 1996

5 '-e. o.... Del. Delezione che detennina un fenotipo DMD genedmd e Delezione che determina un fenotipo BMD ---- cr.._..._ _....._- mrnadmd Dlstroftna \. Dlst.rofina severamente t-oncata e rapidamente degradata dalle cellule t..""" _... oeu ~'~' s.r 1 R N-FRAME "" ~~~~9 Cl Distroftna int.enlamente deeta, senrlfunzionante b FGURA 5 Basi molecolari dei fenotipi Duchenne e Becker. Secondo l'ipotesi di Monaco (7) le delezioni creano uno slittamento del modulo di lettura del trascritto. a) Delezioni OUT-FRAME determinano l'assenza della proteina o proteina troncata e instabile. b) Delezio ni N -FRAME determinano una protei1la anomala, ma parzialmente funzio nante FGURA 6 PCR Multiplex Beggs: dall'alto gli Esoni Pm,, 4, 50, 1, 6, 47, 60, 52, del gene della Distrofina separati in PAGE a15% e colorati con etidio bromuro. Linea 1 MW, Linea 2 Controllo sano, Linea e 5 paziente non deleto, Linea 4 controllo deleto (delezione degli esoni 50, 52), Linea 6 bianco, Linea 7 MW. FGURA 7 PCR-Multiplex Chamberlain: dall'alto gli esoni 45, 48, 19, 17, 51,8,12,44,4, del gene della Distro.tzna separati in un Gel di Agarosio al %+1% di NuSieve (FMC). Linea 1 MW, Linea 2 Controllo sano, Linea paziente C01l delezione dell'esone 51, Linea 4 controllo deleto (delezione degli eso1li 45, 48), Linea 5 bianco, Linea 6 MW. LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

6 Se l'analisi della distrofina risulta anormale, può essere eseguito il test del DNA mediante PCR e se questa non risulta informativa, viene eseguito un Southem bio!. Nei casi in Southem cui non si identifica una delezione o una duplicazione, può essere eseguita un'analisi di linkage che, se informativa, può permettere l'identificazione di una portatrice o una diagnosi prenatale. Se una biopsia muscolare non è eseguibile, la PCR o il Southem blot su DNA da sangue periferico possono essere utilizzate per confermare la diagnosi di D/SMD. ANALSNDRETA E LlNKAGE Più complessa è l'individuazione del cromosoma a rischio nelle famiglie in cui il probando non presenta deiezione. L'identificazione delle femmine portatrici non solo in questo caso, ma anche quando il probando presenta la delezione, è molto indaginosa. La tecnica di PCR non consente infatti una visualizzazione delle delezioni nelle portatrici. n questi casi per le famiglie a rischio possono essere utilizzati: RFLPs con Southern blot o PCR (14-15) STRs (16) dosaggio degli esoni deleti con PCR quantitativa L'analisi di linkage si basa sullo studio dei polimorfismi del DNA nelle famiglie interessate. Questo metodo permette di identificare l'aplotipo associato all'allele mutato seguendo la trasmissione nelle famiglie di marcatori genetici strettamente concatenati al gene. Questo ha un ruolo particolarmente importante nelle famiglie in cui non è stata individuata una delezione nell'affetto, potendo distinguere l'aplotipo associato alla mutazione nei diversi componenti della famiglia, permettendo poi di effettuare la diagnosi di portatrice ed eventualmente di feto affetto in una diagnosi prenatale. L'accuratezza degli studi di linkage è limitata dalla frequenza di ricombinazione all'interno del locus DMD. l J gene DMD è estremamente grande e va incontro ad eventi di ricombinazione nel 5% di tutte le meiosi, per cui questa analisi ha un limite massimo di accuratezza del 95%. Accanto allo studio degli RFLPs mediante Southern blot è possibile utilizzare dei polimorfismi di restrizione intragenici evidenziabili con PCR (Figg. 8, 9) ed identificare sequenze ripetute (CA) (GT) (Fig. 10). l DNA utilizz'ato nell'analisi di linkage è ottenuto da sangue periferico, da colture di amniociti o villo coriale se è un DNA fetale. MOSACSMO GERMNALE Durante la consulenza di famiglie nelle quali c'è un caso sporadico di D/BMD è importante considerare la possibilità di un mosaicismo germinale. Se si assume che la mutazione può essersi verificata precocemente nello sviluppo embrionale postzigotico, sia maschi che femmine possono presentare un mosaicismo della linea somatica che si può manifestare con modeste elevazioni dei livelli del CK nella persona affetta, indipendentemente dal sesso. Se una donna senza storia familiare per D/BMD ha un solo figlio malato, e se essa non è stata trovata essere portatrice, il rischio di avere un altro maschio affetto da D/BMD non è trascurabile. Quando la nuova mutazione si realizza durante la mitosi in un clone delle cellule germinali della madre dà luogo ad un mosaicismo germinale. Dagli studi di Bakker (17, 18) su famiglie in cui la malattia era dovuta ad una nuova mutazione è emerso che l'aplotipo legato alla mutazione era trasmesso 41 volte, 5 nei maschi. normali e 6 nei maschi affetti. Questo implica il 14% del rischio di ricorrenza per le madri di pazienti in cui sia stata identificata una nuova mutazione associata all'aplotipo. Bakker e colleghi hanno anche analizzato una famiglia nella quale era stata identificata una delezione del probe J (j 7 8 FGURA 8 PCR dell'rflp pert Xmn Linea 1 MW, Linea 2 paziente DMD, Linea madre pz. DMD, Linea 4 padre pz. DMD, Linea 5 MW, Linea 6 zia materna del pz. DMD, Linea 7-8 sorelle del pz. DMD, Linea 9 MW. FGURA 9 PCR dell'rflp per T Bam H Linea paziente DMD, Linea 2 madre pz. DMD, Linea padre pz. DMD, Linea 4 zia materna del pz. DMD, Linea 5 MW, Linea 6 e 7 sorelle del pz. DMD, Linea 8 controllo omozigote + pert Bam H l. LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

7 Uarker order 5'STR STR44 STR45 STR49 STR50 'STR 5 P H U 1 5 K J K E 2 9 L G G L. 'G. G 9 'm' U 2 5 P H U 1 STR49 STRSO M K G. ~ l E C'< ~ ~ ";"...,..1._- :i: _ L K - '7.~", ~.... l'!., ~ J H G STR44 STR45 FGURA lo' Esempio di uno studio di Linkage in una famiglia DMD mediante l'uso di STR a) pedigree della famiglia studiata dove è stato utilizzato il cromosoma di unfratello sano per caratterizzare il cromosoma delle portatrici e poter eseguire ulla diagnosi prenatale. b) STRs. pert87-15 trasmessa a due figli da una donna che non aveva la delezione nel proprio DNA. Essa potrebbe essere un mosaico con le delezioni originate nelle cellule germinali. Darres e Francke hanno descritto una famiglia studiata per 4 generazioni: una donna con 5 figlie, due delle quali hanno figli affetti da DMD portatori di una delezione intragenica non trovata nella madre. Studi sull'aplotipo mostrano che le figlie hanno ereditato il cromosoma mutato dal loro padre non affetto. Questa è una confema che il mosaicismo germinale può essere sia nei maschi che nelle femmine. LlGAND ASSAY VaL 1 NU MERO 1 ANNO 1996

8 ~ CONCLUSON Mutazioni che colpiscono il gene della distrofina sono causa dell'insorgenza di una B/DMD. La tecnica della per permette l'identificazione del 98% delle delezioni individuate dalle sonde a cona in tempi molto ridotti rispetto all'analisi con Southern blot. Per questo motivo la per è utilizzata come primo approccio diagnostico nelle B/DMD. Sia la per che il Southern blot sono metodologie applicabili alla diagnosi prenatale, che è altamente precisa (100%) nei casi in cui la delezione è stata individuata nel DNA dell'individuo affetto della famiglia. Nelle famiglie in cui non si è identificata una delezione nell'affetto si può caratterizzare l'aplotipo del malato per valutare la trasmissione del cromosoma affetto. nfine in presenza di un caso sporadico di D/BMD è necessario tenere presente la possibilità di un mosaicismo germinale. E' importante ribadire che essendo la D/BMD una malattia legata al cromosoma X e trasmessa come carattere recessivo, è sempre necessario analizzare contemporaneamente il malato ed il suo nucleo familiare (DNA da sangue periferico o da biopsia muscolare) per poter eseguire sia una diagnosi diretta (ricerca delle delezioni con Southern blot o per), che una analisi di linkage. BBLOGRAFA Koenig M, Beggs AH, Moyer M, Scherpf S. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscul ar dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 1989; 45: Zatz N, Vianna-Morgante AM, Campos P, Diament AJ. Traslocation (X; 6) in a female with Duchenne muscul ar dystrophy: implications for the localization of the DMD locus. J Med Genet 1981; 18: De Martinville B, Kunkel LM, Bruns G, Morle F, Koenig M. Localization of DNA sequences in region Xp21 of the human X chromosome: search for molecular markers close to the Duchenne muscular dystrophy locus. Am J Hum Genet 1985; 7: Hoffman EP, Brown RH, Kunkel LM. Dystro fi n: the protei n product of the Duchenne muscolar dystrophy locus.cel1987;5 1:919. Ahn AH, Kunkel LM. The structural and functional diversity of dystrophin. Nat Genet 199; : 28. Den Dunnen JT, Grotschoten PM, Bakker E, Bonden LAJ, Ginjaar HB, Wapenaar MC, Van Paassen HMB, Van Broeckhoven C, Pearson PL, Van Ommen GJB. Topography of Duchenne Muscul ar Dystrophy (DMD) Gene: FGE and cdna analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 1 duplications. Am J Hum Genet 1989; 45: Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S, Moser H, Kunkel LM. An explanation fo r the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD 10cus. Genomics 1988; 2: Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. PCR primers for the dystrophin gene that complement existing ones to detect over 98% of DMD-BMD delec tions. NucJeic Acids Res Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Caskey CT. Multiplex per for diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, in "per: Protocols and Applications-A Laboratory Manual", nnis M, Gelfand D, Sninski J, White T. (Eds): Academic Press, 1989 ; : Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy 10cus vi a multiplex DNA amplification. Nucleic Acid Res 1988; 16: Gilgenkrantz H, Chely J, Lambert M, Recan D, Barbot JC, Van Ommen GJB, Kaplan Je. Analysis of molecular deletions with cdna probes in patiens with Duchenne and Becker musc ul ar dystrophies. Genomics 1989; 5: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, Molecular coning. A Laboratory Manual (Second Edition) eold Spring Hm bor Laboratory Press, Multicenter Study Group. Diagnosis of Duchenne and Becker Muscul ar Dystrophies by Pol ymerase ehain Reacti on lama 1992; 267 No Speer A, Spiegler A WJ, Hanke R, Grade K, Giertler U, Schieck J, Forrest S, Davies KE, Neumann R, Bollmann R, Bommer C, Sommer D, Coutelle C. Possibilities and imitation of prenatal diagnosis and carrier determination far Duchenne and Becker muscular dystrophy using cdna probes. ] Med Genet 1989; 26: Bakker E, Hofker MH, Goor N, Mandel JL, Wrogemann K, Davies KE, Kunkel LM, Willard HF, Fenton W A, Sandkuyl L. et al. Pre natal diagnosis and carrier detection of Duchenne musc ul ar dystrophy with closely inked RFLPs Lancet, 1985; : Oudet C, Heilig R and Mandel JL. An information polymorphism detectable by polymerase chain reaction at the ' end of the dystrophin gene. Hum Genet 1990; 84: Bakker E, Van Browckhoven C, Bonten EJ, Van de Vooren MJ, Veenema G, Van Hul W, Van Ommen GJB, Vandenberghe A, Pearson PL. Germline mosaicism and Duchenne muscul ar c1ystrophy mutations. Nature 1987; 29: Bakker E, Veenema G, Den Dunnen JT, Van Broeckhoven e, Grootscholten PM, Bonten EJ, Van Ommen GJB, Pearson PL. Germinai mosaicism increase the recurrence ri sk far "new" Duchenne muscular dystrophy mutations. J. Mecl Genet 1989; 26: LlGANDASSAY VOL.1 NUMERO 1 ANNO 1996

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