UTILIZZO DELLE COLTURE CELLULARI

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1 COLTURE CELLULARI

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3 UTILIZZO DELLE COLTURE CELLULARI Elettrofisiologia Studio dei recettori Modelli di morte cellulare Farmaci

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5 CELLULE CONNETTIVALI Fibroblasti Osteociti Condrociti Adipociti CELLULE MUSCOLARI Miocardiociti Cellule muscolari scheletriche Cellule muscolari lisce CELLULE NERVOSE Glia Neuroni CELLULE EPITELIALI Epatiche Alveolari Bronchiali Cutanee Vescicali Renali CELLULE VARIE Endocrine Tumorali Endoteliali Tutte le cellule usate nelle colture eccetto i neuroni sono non interamente differenziate

6 FATTORI SPERIMENTALI CHE FAVORISCONO: La proliferazione: bassa densità cellulare bassa concentrazione di Ca ++ fattori di crescita La differenziazione: alta densità cellulare alta concentrazione di Ca ++ ormoni fattori di differenziamento (NGF) in genere le condizioni di coltura usate comunemente favoriscono la proliferazione anziché la differenziazione

7 TESSUTO EMBRIONALE alta capacità proliferativa diverse dalle cellule adulte TESSUTO ADULTO ridotta capacità proliferativa simili alle cellule adulte

8 COLTURE PRIMARIE (appena isolate) linee cellulari o sottocolture in seguito a replicazione ripetuta meccanismi? COLTURA CONTINUA O IMMORTALE (più facili da coltivare, instabili geneticamente, possono essere diverse dalle cellule di origine) COLTURE NEOPLASTICHE (elevata capacità di riproduzione, molto simili alle cellule da cui originano)

9 MEZZI DI COLTURA a base di siero favoriscono la sopravvivenza cellulare privi di siero favoriscono la crescita di tipi cellulari specifici la composizione dei mezzi di coltura può essere variata in base alle particolari caratteristiche che si richiedono alla coltura stessa

10 CARATTERISTICHE DEL SIERO Componenti del siero Albumina Fibronectina Alfa-2-macroglobulina Transferrina Ormoni Funzioni note o presunte Trasporto molecole biologiche Adesione cellulare Inibizione tripsina Trasporto ferro Controllo di funzioni metaboliche Fattori di crescita Insulin-like growth factors (IGF), platlet derived growth factor (PDGF), Somatomedina, Epidermal growth factor (EGF), Endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF),ecc. Lipidi e acidi grassi, Minerali, Metaboliti, Polipeptidi

11 ADESIONE CELLULARE è necessario provocarla in tutti quei casi (numerosi) in cui le cellule coltivate non crescono in sospensione plastiche speciali fattori di adesione

12 FATTORI DI ADESIONE CELLULARE Polilisina PIU COMUNI Collagene Fibronectina

13 PREPARAZIONE DI COLTURE

14 PRELIEVO TESSUTO E DIGESTIONE COLTURA PRIMARIA INCUBAZIONE DELLA COLTURA LAVAGGIO DEGLI ENZIMI DI DIGESTIONE DISTRIBUZIONE SU PIASTRE E CRESCITA i protocolli di generazione delle colture cellulari sono molto riproducibili le cellule in crescita hanno bisogno di un cambio di medium ogni 4-5- giorni

15 PLASTICHE PER COLTURE CELLULARI

16 CONTAMINAZIONE batterica coltura torbida e variazioni ph virale alterazioni morfologiche micoplasma test mirati

17 CONSERVAZIONE si deve essere assolutamente certi del tipo di cellula su cui si sta lavorando banche cellulari congelamento in azoto liquido secondo protocolli definiti

18 Conservazione di linee cellulari

19 Dove trovare le linee cellulari Produzione in laboratorio Banche cellule European Collection of Cell Culture AmericanTissueCultureCentre (USA) National Cell Culture Center (USA) German Collection of Microorganism and Cell Culture IZS Centro Substrati Cellulari IST Servizio Biotecnologie

20 CONTROLLO VITALITA CELLULARE Coloranti Respirazione cellulare Incorporazione timidina marcata Incorporazione leucina marcata

21 la fluorescina si mantiene solo nelle cellule intatte

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23 cellule piramidali di ippocampo

24 CONTROLLO SOPRAVVIVENZA agente chimico o farmaco a breve termine a medio termine clonaggio in monostrato riduzione capacità riproduttiva clonaggio in soft agar isola quelle cellule che crescono in sospensione (crescita rapida)

25 Elutriator l elutriator separa le cellule sulla base del diverso gradiente di sedimentazione è un metodo rapido, standardizzato e riproducibile

26 Resistenza elettrica Le cellule sono dei cattivi conduttori di elettricità e oppongono resistenza al passaggio della corrente elettrica. Il contatore Coulter è una apparecchiatura in cui una sospensione cellulare viene fatta passare attraverso una sottilissima fessura su entrambi i lati della quale sono posti degli elettrodi. Una cellula che si frapponga tra i due elettrodi impedisce il passaggio della corrente e determina una caduta di voltaggio che viene registrata sotto forma di un impulso la cui altezza è proporzionale al volume della cellula. Contando gli impulsi e la loro forma, tale sistema consente di determinare il numero e le dimensioni delle cellule presenti in una data sospensione. Non si distinguono le cellule vive da quella morte e i valori sono quindi riferiti a conte totali. Citometria a flusso Procedimento analogo al precedente in cui le cellule sono marcate con coloranti fluorescenti e si misurano assorbimento di luce e fluorescenza, con l ottenimento di istogrammi che indicano le varie popolazioni cellulari

27 Per effettuare il conteggio: dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato un dato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti nei quadrati delimitati da una doppia barra