Produzione di proteine eterologhe. Cosa occorre per l espressione l livello di una proteina nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilità

Transcript

1 Cosa occorre per l espressione l ad alto livello di una proteina nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilità Promotore forte (trascrizione) Presenza di segnali per il riconoscimento dell mrna da parte dei ribosomi (traduzione) Assenza di proteasi specifiche (stabilità) Il Promotore perfetto (?) UP element -35 Ext AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn nnntgntataatnnattan 4-6nt 14nt 4-6nt 17nt Riconosciuto dalla subunità α Riconosciuti dalla subunità σ nt An...nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-taannnnn Term. (Ribosome Binding Site/ SD box (Shine-Dalgarno) Terminatore di trascrizione Produzione di proteine eterologhe Domanda: Un sistema spinto al massimo,, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine eterologhe? Risposta: NO Problemi di tossicità di proteine eterologhe, e della loro conformazione corretta

2 Tossicità di proteine eterologhe nell ospite Escherichia coli Peso sul bilancio energetico della cellula batterica Interazione erronea con componenti cellulari: Legame al DNA Danno al DNA Stress ossidativo Interazione/sequestro di altre proteine essenziali Induzione di sistemi di risposta allo stress Mutazioni che portano all eliminazione dell espressione espressione del gene clonato e/o del plasmide Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Produzione di proteina (unità arbitrarie) Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

3 Plac, il promotore inducibile per eccellenza A B (LacI) (LacI) (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG) IPTG P lac LacI P tac P trc Derivati di P lac * più forti *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi Phage T7

4 Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dell RNA polimerasi batterica) Ara C AraC -Ara +Ara represses PBAD induces PBAD P BAD AraC RNA pol P BAD

5 EK=Sito di proteasi Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici L uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Ma troviamo sempre siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare? Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain reaction) 1 1 (15-20 nt) 2 Ibridazione con sonde specifiche per l amplificazione del gene bersaglio 3 DNA-sintesi

6 Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: (BamHI) (HindIII) Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: (BamHI) (HindIII) Ai primers può essere aggiunta una coda non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

7 Fattori post-trascrizionali trascrizionali che possono influenzare l espressionel Stabilità del mrna: : l utilizzo l di alcuni mutanti in alcune RNasi (ad es. le esonucleasi RNasi II, PNPasi o la endonucleasi RNasiE) ) può far aumentare la stabilità dei trascritti Differenze nell uso dei codoni tra procarioti ed eucarioti può avere un impatto sulla produzione di proteine eterologhe in E. coli (ad es. i codoni arginina AGA e AGG sono molto rari in E. coli,, ma molto comuni negli eucarioti). Possibile soluzione: cambiare questi codoni nel codone CGC, preferito da E. coli, oppure co-esprimere il gene per il trna Arg(AGG/AGA) Stabilità delle proteine: uso di mutanti defettivi per proteasi Codon usage in Escherichia coli UUU 22.3 (89985) UCU 10.8( 43728) UAU 18.0( 72440) UGU 5.3( 21431) UUC 15.8 (63684) UCC 9.4( 37738) UAC 12.1( 48758) UGC 6.0( 24208) UUA 14.5 (58346) UCA 9.7( 38904) UAA 2.0( 7907) UGA 1.0( 4206) UUG 12.7 (51140) UCG 8.5( 34448) UAG 0.3( 1149) UGG 13.9( 55921) CUU 12.3 (49607) CCU 7.8( 31303) CAU 12.5( 50496) CGU 19.3( 77801) CUC 10.1 (40777) CCC 5.5( 22191) CAC 9.0( 36460) CGC 18.8( 75701) CUA 4.4 (17639)* CCA 8.6( 34744) CAA 14.3( 57536) CGA 4.0( 16167) CUG 46.9 (189204)* CCG 19.8( 79918) CAG 28.4(114518) CGG 6.4( 25766) AUU 29.5 (118960) ACU 10.9( 43846) AAU 21.8( 87884) AGU 10.5( 42329) AUC 23.0 (92826) ACC 21.7( 87349) AAC 21.4( 86073) AGC 15.0( 60556) AUA 7.8 (31326) ACA 10.3( 41555) AAA 35.1(141491) AGA 4.2( 16943) AUG 26.0 (104652) ACG 13.8( 55504) AAG 12.9( 51895) AGG 2.5( 10033) GUU 20.0 (80574) GCU 17.4( 70044) GAU 32.8(132131) GGU 25.2(101534) GUC 14.2 (57354) GCC 24.0( 96703) GAC 19.1( 76987) GGC 26.2(105620) GUA 11.8 (47387) GCA 21.5( 86585) GAA 38.1(153370) GGA 10.4( 41743) GUG 23.7 (95503) GCG 28.6(115274) GAG 18.8( 75654) GGG 11.6( 46760) *)= Entrambi i codoni corrispondono alla leucina