Determinazione degli additivi per mangimi: valutazione dei metodi di analisi disponibili
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1 Determinazione degli additivi per mangimi: valutazione dei metodi di analisi disponibili Cinzia Civitareale e Maurizio Fiori Istituto Superiore di Sanità LNR per gli additivi nei mangimi III Workshop dei LNR per Metalli Pesanti negli Alimenti e nei Mangimi e Additivi nei Mangimi Roma, Ottobre 2013
2 1. Perché controllare gli additivi/pnaa Disponibilità metodi di analisi/banca dati EURL-FA 3. Verifica e applicabilità per il controllo ufficiale 4. Trasferimento e Armonizzazione del controllo (LNR-FA)
3 PERCHE controllare gli additivi? REGOLAMENTO (CE) N.882/2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali Gli Stati membri dovrebbero applicare la normativa in materia di mangimi e di alimenti e le norme sulla salute e il benessere degli animali nonché controllare e verificare il rispetto delle pertinenti disposizioni delle medesime da parte degli operatori del settore in tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione. A tal fine si dovrebbero organizzare i controlli ufficiali. I controlli dei mangimi e degli alimenti provenienti da paesi terzi di cui alla direttiva 97/78/CE si limitano agli aspetti veterinari. Occorre integrare tali controlli con controlli ufficiali su aspetti non coperti dai controlli veterinari come ad esempio quelli relativi agli additivi, all etichettatura, alla tracciabilità, all irradiazione di prodotti alimentari e ai materiali a contatto con gli alimenti.
4 PERCHE controllare gli additivi? Controllo della qualità e conformità degli alimenti per animali Assicurare la salute e il benessere animale Sicurezza del consumatore
5 Regolamento (EC) No 1831/2003 Tra gli additivi per mangimi figurano i seguenti: additivi tecnologici: per esempio, conservanti, antiossidanti, emulsionanti, agenti stabilizzanti, regolatori di acidità, additivi per insilaggio; additivi organolettici: per esempio, aromatizzanti, coloranti; additivi nutrizionali: per esempio, vitamine, aminoacidi, oligoelementi*; additivi zootecnici: per esempio, promotori della digestione, stabilizzatori della flora intestinale; coccidiostatici e istomonostatici* * Inseriti in PNAA
6 PNAA La programmazione dei controlli ufficiali nella filiera alimentare animale prevede due tipi di attività differenti (coerentemente con il Regolamento 882/2004): Monitoraggio - l attività di campionamento volta alla raccolta di dati al fine di valutare l evoluzione di un determinato fenomeno (ex Sorveglianza ). Sorveglianza - l attività di campionamento volta alla verifica della conformità alla normativa (ex Vigilanza ).
7 PNAA Programma di Monitoraggio/Sorveglianza degli additivi NUOVI OBIETTIVI Si intende ribadire, visto quanto sopra riportato, che nell ambito dei controlli ufficiali sui mangimi debbano essere inclusi, nel corso del triennio, attività di monitoraggio/sorveglianza per altre categorie di additivi (tecnologici, organolettici, zootecnici) e per altri additivi appartenenti alla categoria degli additivi nutrizionali finora non previste dai precedenti piani e dal presente.
8 PNAA Programma di Monitoraggio/Sorveglianza degli additivi NUOVI OBIETTIVI Raccogliere indicazioni affinché si possa cominciare ad intraprendere un attività di monitoraggio nuova rispetto a quelle definite nei piani precedenti al fine di approfondire la conoscenza nell ambito dell utilizzo degli additivi sul territorio e al fine di verificare la conformità dei limiti minimi e/o massimi definiti per gli additivi autorizzati nel mangime completo.
9 PNAA Proposta Ministero della Salute inserimento dei controlli per additivi in particolare: Vitamine vitamina D Amminoacidi L-valina, L-isoleucina, acido guanidinacetico Promotori della digestione 6-fitasi, 3-fitasi, endo-1,4-beta-xilanasi Stabilizzatori della flora intestinale Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecium Altri additivi zootecnici acido benzoico, sodio benzoato
10 Ricognizione disponibilità metodi Disponibilità di metodi per il controllo degli additivi nel data base dei metodi del EURL-FA
11 RICHIESTA DI AUTORIZZAZIONE Il Regolamento (CE) n. 1831/2003 definisce la procedura di autorizzazione comunitaria degli additivi e prevede l emissione di un regolamento di autorizzazione in cui sono definiti requisiti specifici (es.: composizione, specie animale di destinazione, istruzioni d uso), la definizione di un contenuto minimo e/o massimo, nonché i metodi analitici da utilizzare nei controlli ufficiali dei mangimi.
12 Cosa devono contenere i fascicoli REGOLAMENTO (CE) N. 429/2008 Sulle modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda la preparazione e la presentazione delle domande e la valutazione e l'autorizzazione di additivi per mangimi
13 Cosa devono contenere i fascicoli efficacia e sicurezza Relazioni dettagliate sugli studi destinati a dimostrare l efficacia e la sicurezza dell utilizzo dell additivo.
14 Cosa devono contenere i fascicoli metodi analitici 1) Studi per stabilire l identità e le proprietà fisico-chimiche dell additivo nonché i metodi di determinazione quali- quantitativa atti a valutare la presenza del principio attivo nelle premiscele e nei mangimi al fine di determinare la conformità ai livelli massimi o minimi proposti.
15 Cosa devono contenere i fascicoli - metodi analitici La descrizione dei metodi di analisi nel mangime o in acqua devono essere conformi alle norme di BPL di cui alla direttiva 2004/10/CE e/o alla norma EN ISO/IEC I metodi devono rispettare le disposizioni dell articolo 11 del regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004
16 Cosa devono contenere i fascicoli - metodi analitici La caratterizzazione dettagliata dei metodi include le caratteristiche appropriate di cui all'allegato III del Regolamento (CE) n. 882/2004. I metodi proposti devono essere convalidati da parte del richiedente mediante ring test o se validati in house devono essere verificati da un secondo laboratorio indipendente accreditato.
17 Cosa devono contenere i fascicoli - metodi analitici 2) Metodi analitici qualitativi e quantitativi per la determinazione dei residui marcatori del principio attivo nei tessuti bersaglio e nei prodotti di origine animale. Dati e metodologia di convalida (recupero, specificità, accuratezza, precisione, limite di rivelazione, limite di quantificazione). I relativi limiti di quantificazione dei metodi proposti devono essere inferiori dei LMR
18 VALUTAZIONE METODI EURL-FA La valutazione critica dei metodi di analisi proposti, viene effettuata dal Centro Comune di Ricerca della Commissione (European Commission s Joint Research Centre JRC, Geel, Belgio) nominato EURL-FA e assistito dal Consorzio di LNR (REGOLAMENTO (EC) N. 378/2005 emendato dal REGOLAMENTO (EC) N. 885/2009)
19 Responsabilità del EURL -FA (REGOLAMENTO (EC) N. 1831/2003) Ricevimento, preparazione, immagazzinaggio e mantenimento dei campioni di controllo; Valutazione dei dati forniti dal richiedente l autorizzazione onde valutare, testare, o convalidare il metodo di rilevazione; Presentazione di relazioni valutative complete all EFSA.
20 Responsabilità del EURL -FA (REGOLAMENTO (EC) N. 885/2009) La relazione di valutazione deve comprendere: Una valutazione indicante se i metodi di analisi integrati nei dati presentati nella domanda sono adatti per essere utilizzati nei controlli ufficiali; L'indicazione se la sperimentazione di un metodo di analisi è considerata necessaria; L'indicazione se una convalida di un metodo di analisi tramite studio di intercomparazione è considerata necessaria.
21 European Union Register of Feed Additives pursuant to Regulation (EC) No 1831/2003 List of additives (Released ) Sito web: ves/comm_register_feed_additives_ pdf
22 1. Data base EURL-FA Portale Joint Research Center Institute for Reference Materials and Measurement (IRMM) 1 EU Reference Laboratories 2 EURL feed additives 3 Method database
23 2. Data base EURL-FA Se vado su: 1 Authorisation 2 Evaluation reports Trovo l elenco dei FAD (Food Additive Dossiers) report di valutazione dei metodi analitici proposti per determinare la sostanza attiva nell additivo, nelle premiscele, nei mangimi e in acqua (se pertinente) nonché i residui e/o i metaboliti negli alimenti.
24 Metodi proposti dalle Ditte Additivi proposti dal Ministero della Salute 1. Che tipo di metodi sono comunemente proposti (Ufficiali o sviluppati ditta)? 2. Rispondono ai requisiti di un metodo per il controllo ufficiale (allegato III Reg. 882/2004/CE)?
25 Vitamina D 3 3a vitamine e provitamine Uso: mangime/acqua 0,05-0,250 mg/kg. Tutte le specie animali e categorie Registro: 0,05-0,1 mg/kg N.1 Dossier valutato dal CRL Metodi raccomandati per mangimi e premiscele Premiscele: HPLC-UV 265 nm VDLUFA* 1997, Method Mangime: HPLC-UV 265 nm VDLUFA 1997, Method ; RP-HPLC-UV 265 nm EN Acqua: RP-HPLC-UV 265 nm EN (matrice: latte a bassa percentuale di grassi) Entrambi validati mediante ring-trial e LOQ mg/kg *VDLUFA: Association of German Agricultural Analytic and Research Institutes
26 Metodo ufficiale nazionale MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI Approvazione del metodo ufficiale di analisi per la determinazione del contenuto di vitamina D 3 negli alimenti per gli animali (Decreto 17 luglio 2012,Gazzetta n. 180 del 3 agosto 2012 ) Metodo HPLC-RP - LOQ 2000 UI/Kg (equiv. 0,05 mg/kg)
27 L-valina 3c aminoacidi, loro sali e analoghi Uso: mangime mg di L-valina totale/kg. Tutte le specie animali. L inclusione del prodotto nel mangime dipende dalla concentrazione di L-valina naturalmente presente nella componente del mangime. Registro: rimanda ad regolamento di autorizzazione in cui non ci sono indicazioni di min/max N. 4 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore) Metodi raccomandati per mangimi e premiscele Commission Regulation (EC) No 152/2009 EN ISO 13903:2005 standard method (Animal feedingstuffs determination of amino acids content) (HPLC-VIS) (validazione mediante ring-trial del metodo in Reg. EC 152/2009) Tecnica: Analizzatore di aminoacidi o HPLC scambio ionico nm (derivatizzazione post colonna con ninidrina) Nota: Il metodo è applicabile per la determinazione di L-valina libera e totale (sintetica e naturale) non distingue tra le forme L- e D- né tra L-valina aggiunta o naturalmente presente
28 L-isoleucina 3c aminoacidi, loro sali e analoghi Uso: l inclusione del prodotto nel mangime dipende dalla concentrazione di L-isoleucina naturalmente presente nella componente del mangime e dalle richieste nutrizionali delle differenti specie animali. Registro: rimanda ad regolamento di autorizzazione in cui non ci sono indicazioni di min/max N.1 Dossier valutato CRL Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: Commission Regulation (EC) N. 152/2009 EN ISO 13903:2005 (validazione mediante ring-trial del metodo in Reg. EC 152/2009) Tecnica: Analizzatore di aminoacidi o HPLC scambio ionico 570 nm (derivatizzazione post colonna con ninidrina) Nota: Il metodo è applicabile per la determinazione di L-isoleucina libera (sintetica e naturale) e totale (libera e legata in forma peptidica) non distingue tra le forme L- e D- né tra L-isoleucina aggiunta o naturalmente presente Method AOAC VDLUFA method (Association of German Agricultural Analytical Research Institues) Nota: i due metodi consentono la determinazione quantitativa di aminoacidi liberi.
29 Acido guanidinacetico 3c aminoacidi, loro sali e analoghi Uso: mg/kg mg di sostanza attiva/kg di mangime completo (tutte le specie). Registro: 600 mg/kg min/max (polli da carne) N.2 Dossier valutati CRL Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: metodo validato in house e verificato da un secondo lab. Tecnica: cromatografia ionica con rivelazione UV (IC-UV) - LOQ 55 mg/kg
30 6-fitasi 4a promotori della digestione Uso: concentrazione variabile a seconda della specie e della formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suini Registro: solo tenore minimo FTU (unità di attività)/kg mangime completo FYT/kg mangime completo 250 PPU/kg mangime completo OTU/kg mangime completo N.11 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: EN ISO 30024:2009 Tecnica: misura dell attività enzimatica (quantità di enzima che rilascia 1µmol di fosfato inorganico dal fitato al minuto in condizioni definite) mediante metodo colorimetrico. Fitato: sale dell acido fitico (chim.: mio-inositolo esafosfato - riserva di fosforo nei vegetali)
31 3-fitasi 4a promotori della digestione Uso: concentrazione variabile a seconda della specie e della formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suini Registro: RPU (unità di attività)/kg mangime completo N.3 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: VDLUFA-Methodenbuch III, 4. Erg metodo validato mediante ring-trial Metodo validato in house Tecnica: misura dell attività enzimatica (quantità di enzima che rilascia 1µmol di fosfato inorganico dal fitato al minuto in condizioni definite) mediante metodo colorimetrico
32 Endo-1,4-beta-xilanasi 4a promotori della digestione/1k 1 enzimi Uso: concentrazione variabile a seconda della specie e della formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suini Registro: Differenti autorizzazioni/differenti unità di attività N. Circa 20 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) alcune formulazioni in associazione con altri enzimi Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: Differenti Metodi validati in house e verificati da un secondo lab. Tecniche: misura dell attività enzimatica (espressa in unità diverse dipende dalle condizioni operative) mediante metodo colorimetrico; metodo viscosimetrico (unità di concentrazione espressa in unità diverse dipende dalle condizioni operative).
33 Saccharomyces cerevisiae 1k2-microorganismi/4a promotori della digestione/4b stabilizzatori della flora intestinale Uso: concentrazione variabile a seconda della specie. Suini, conigli, cavalli. Registro: varie autorizzazioni tenori espressi in CFU/kg mangime completo N. 8 Dossier valutati CRL (diversi per ceppo di lievito produttore) Metodo raccomandato per mangimi e premiscele: EN 15789:2009 (Enumerazione del microorganismo) Tecnica: Enumerazione: conta su piastra Identificazione del ceppo: reazione a catena della polimerasi (PCR)
34 Enterococcus faecium 1k2-microorganismi /4b stabilizzatori della flora intestinale Uso: concentrazione variabile a seconda della specie. Avicoli da carne, bovini, suini, cani e gatti Registro: diverse autorizzazioni per ceppo di Enterococcus faecium N. 11 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) alcune formulazioni in associazione con altri microorganismi Metodo raccomandato per mangimi e premiscele: EN (Enumerazione del microorganismo) Tecnica: Enumerazione: conta su piastra Identificazione del ceppo: elettroforesi su gel in campo pulsato (PFGE)
35 Acido benzoico 1j regolatore di acidità Uso: 1) 106, mg/kg (avicoli); 2) 5 g/kg (suinetti); 3) mg/kg avicoli Registro: suini da ingrasso mg/kg mangime completo N. 3 Dossier valutati CRL Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: 1) Metodo validato in house e verificato da un secondo lab. (HPLC-UV) LOQ 10 mg/kg 2)Adattamento di ISO 9231:2008 benzoic acid in milk and milk products (HPLC-UV) (verifica dell applicabilità al mangime in house) - LOQ 0,5 g/kg 3) Metodo validato in house e verificato da un secondo lab. (GC-IDMS) LOQ 85 mg/kg
36 Sodio benzoato 1a conservanti (antimicrobico) Uso: additivo per conservazione dell insilato e del mangime (tutte le specie); differenti formulazioni/ differenti dosaggi mangimi e insilato (da 3000 a mg/kg) Registro: mg/kg cereali N. 3 Dossier valutati CRL Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: Metodo validato in house e verificato da secondo lab. (HPLC-UV) Metodo validato mediante ring-tial (HPLC-RI (indice di rifrazione)/uv) Metodo validato in house (HPLC-UV) dall Agenzia per la Salute e Sicurezza Alimentare (AGES) - Austria Insilato: CRL-FA non raccomanda alcun metodo per il controllo ufficiale a causa delle intrinseche proprietà della matrice insilato
37 CONSIDERAZIONI: Accesso alla Banca Dati (accesso alla documentazione riservata); Scelta del metodo: criteri (es.: Vitamina D3 metodo normato; acido benzoico vari metodi sviluppati in house); Validazione metodo scelto e armonizzazione dei controlli per gli additivi per cui non sono disponibili metodi ufficiali (LNR); Numero elevato di additivi - come scegliere gli additivi da controllare (tenori min/max definiti; tecnica analitica chimico/biologico; rischio associato; esigenze specifiche)?
38 GRAZIE PER L ATTENZIONE
Ilaria Ciabatti Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana
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