Antibiogramma e nuovi criteri interpretativi EUCAST. Lettura interpretativa dell Antibiogramma: Esercitazioni. Paolina Cavalcanti
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1 Antibiogramma e nuovi criteri interpretativi EUCAST Lettura interpretativa dell Antibiogramma: Esercitazioni Paolina Cavalcanti
2 Il ruolo del laboratorio di Microbiologia DIAGNOSI MICROBIOLOGICA identificazione agente eziologico e ATB tempestività dei risultati PROGRAMMI DI CONTROLLO DELLE INFEZIONI epidemiologia locale sorveglianza: alert organisms
3 ANTIBIOGRAMMA
4 ANTIBIOGRAMMA L'antibiogramma è un test in vitro che si esegue esponendo una concentrazione standard dell agente etiologico in esame ad una serie di concentrazioni scalari e definite di farmaci impostazione di un antibioticoterapia mirata
5 Antibiogramma: Metodi APPROCCI FENOTIPICI basati su attività antimicrobica e breakpoint Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE) Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC) Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM,...) Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider,...) APPROCCI GENOTIPICI basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto meca blaz vana vanb, PBP2a β-lattamasi APPROCCI DEDUTTIVI lettura interpretativa (expert rules) Se meca-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi) Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae) Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)
6 CAMPIONE BIOLOGICO SEMINA IDENTIFICAZIONE MACROSCOPICA PRESUNTIVA DELL AGENTE ETIOLOGICO E SUO ISOLAMENTO
7 Esame della purezza delle colonie Luce Riflessa Luce trasmessa
8 TEST DI DISCO DIFFUSIONE SU AGAR Seleziona le colonie Prepara l inoculo
9 Standardizza l inoculo Vortex
10 Immergi il tampone Striscia sulla piastra
11 Addiziona i dischi antibiotati Incuba overnight
12 Misura gli aloni Luce trasmessa Luce riflessa
13 Modifica del terreno germi fastidious
14 CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE (MIC) La più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita microbica dopo h diluizione in brodo g/ml
15 Microdiluizione Prepara l inoculo
16 Standardizza l inoculo e mescola
17 Disponi la sospensione nel supporto e inocula
18 Incuba overnight
19 Lettura MICs
20 Lettura MICs
21 MIC su striscie blottate (gradiente di concentrazione)
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23 Sistemi automatici vitek2 phoenix
24 MIC Il cardine di tutti i saggi di sensibilità Endpoint Valore determinato in laboratorio Valore assoluto riferito a quel particolare microrganismo Standardizzazione : adempimenti tecnici e procedurali Alla base della determinazione dei breakpoint
25 Breakpoint Valori prestabiliti, stabiliti cioè da appositi comitati nazionali o sovranazionali Valori soglia di riferimento che danno un significato all endpoint Standardizzazione : criteri interpretativi
26 EUCAST
27 EUCAST: basi per la determinazione dei breakpoint Il processo che porta a fissare i breakpoint è un compromesso tra aspetti clinici, epidemiologici e metodologici
28 EUCAST breakpoint clinici e cut-off epidemiologici EUCAST riconosce e distingue due tipi di breakpoint: breakpoint clinici Per prevedere un esito migliore (sensibile) o peggiore (resistente) del trattamento di una data infezione con un dato antibiotico. Usati nell attività quotidiana del laboratorio di microbiologia clinica per fornire informazioni utili ai fini della terapia. cut-off epidemiologici per riconoscere precocemente lo sviluppo di una resistenza. Devono essere usati come la misura più sensibile dello sviluppo di una resistenza. Epidemiologic cut-off = ECOFF
29 EUCAST : categorie in base ai breakpoint clinici Sensibile (S) Il livello di attività dell antibiotico nei confronti del microrganismo è associato ad un elevata probabilità di successo terapeutico Intermedio (I) Il livello di attività dell antibiotico nei confronti del microrganismo è associato ad un effetto terapeutico incerto Non è escluso che l infezione possa essere trattata appropriatamente in distretti corporei in cui il farmaco è attivamente concentrato o utilizzando alti dosaggi La categoria intermedia rappresenta anche una zona cuscinetto che potrebbe evitare che modesti ma difficilmente controllabili fattori tecnici possano causare importanti discrepanze interpretative Resistente (R) Il livello di attività dell antibiotico nei confronti del microrganismo è associato ad un elevata probabilità di fallimento terapeutico
30 EUCAST : categorie in base ai cut-off epidemiologici Wild-type (WT) Un microrganismo che non ha acquisito meccanismi di resistenza all antibiotico in questione. Un microrganismo wild-type può rispondere clinicamente oppure no al trattamento con quell antibiotico Non-wild-type (NWT) (Resistenza microbiologica) Un microrganismo che ha acquisito meccanismi di resistenza all antibiotico in questione. Un microrganismo non-wild-type può rispondere clinicamente oppure no al trattamento con quell antibiotico.
31 EUCAST : 2 breakpoint clinici, 1 cut-off epidemiologico breakpoint clinici (sistema SIR): Breakpoint della sensibilità divide i ceppi sensibili (S) da quelli intermedi (I) Breakpoint della resistenza divide i ceppi intermedi (I) da quelli resistenti (R) cut-off epidemiologico: divide i ceppi wild-type (WT) da quelli non-wild-type (NWT)
32 Cut-off epidemiologici e breakpoint clinici, sensibilità e resistenza Numero di isolati Cut-off epidemiologico Breakpoint clinici S R WT NWT MIC S Concentrazioni di antibiotico raggiungibili nei tessuti I R
33 REGOLA BASE IN CHEMIOTERAPIA CONCENTRAZIONE PLASMATICA > MIC = MIC < MIC Successo quasi certo Risultato incerto Probabile fallimento
34 COFATTORI DI EFFICACIA DI UNA TERAPIA ANTIBATTERICA MICROBIOLOGICI Sensibilita Intermedio Resistenza FARMACOLOGICI Adeguati Probabilmente adeguati Inadeguati IMMUNOCOMPETENZA Normale Parzialmente compromessa Compromessa
35 Il puzzle della (appropriata) terapia antibiotica Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42:
36 Un poster della seconda guerra mondiale
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39 Classificazione degli antibiotici sulla base della solubilità e delle proprietà farmacocinetiche / farmacodinamiche Antibiotici idrofili Beta lattamici Glicopeptidi Aminoglicosidi Antibiotici lipofili Macrolidi Fluorochinoloni Tetracicline Caf Rifampicina Linezolid Limitato volume di distribuzione Incapacità a diffondere passivamente attraverso la membrana cellulare delle cellule eucariotiche Inattivi sui patogeni intracellulari Eliminazione renale come farmaco non modificato Largo volume di distribuzione Diffondono liberamente attraverso la membrana cellulare delle cellule eucariotiche Attivi sui patogeni intracellulari Spesso eliminati mediante metabolismo epatico mod. Pea & Viale Clin Infect Dis 2006; 42:
40 Attività degli antibiotici Tempo dipendenti Concentrazione-dipendenti Correlazione PK/PD T > MIC AUC / MIC Cmax / MIC Mazzei T., 2004
41 T>MIC Il tempo durante il quale le concentrazioni plasmatiche si mantengono al di sopra della MIC del patogeno AUC/MIC Progressivo incremento di attività antibatterica all aumentare della concentrazione dell antibiotico
42 POSOLOGIA ANTIMICROBICI EFFETTO TEMPO - DIPENDENTE (es. beta LATTAMICI) EFFETTO CONCENTRAZIONE - DIPENDENTE (es. AMINOGLICOSIDI) SOMMINISTRAZIONE CONTINUA O A BREVI INTERVALLI ALTE DOSI A LUNGHI INTERVALLI
43 Penetration of different β-lactam antibiotics into Epithelial lining fluid (ELF) Agent Reference Protein binding (%) Penetration (%) Cefepime Ceftazidime Ertapenem Ceftobiprole Piperacillin Tazobactam British Society for Antimicrobial Chemotherapy
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45 ARBITRARY INTERPRETIVE CRITERIA FOR ANTIBIOTIC COMBINATIONS Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index) FIC Index= MIC AB /MIC A + MIC BA / MIC B FIC Index 0.5 Interpretation Synergy > 0.5 and 1.0 Additative > 1 and 4.0 Indifference > 4.0 Antagonism Pseudomonas aeruginosa FIC Index = 0.28 Amikacina R 128 µg/ml Cefepime R 16 µg/ml Amikacina + Cefepime 4µg/ml
46 SVILUPPO DELLA RESISTENZA La pressione selettiva
47 DEVELOPMENT OF RESISTANCE: Food Food is also a source of infection that could affect the development of resistance. - More meals are prepared outside the home. - Contamination goes unnoticed until infection has started. Outbreaks of Escherichia coli O157 in spinach and lettuce in the US. - As the number of foodborne infections increases, so does the use of antibiotics.
48 USO APPROPRIATO DI ANTIBIOTICI NELLA PRODUZIONE DEL CIBO PER ANIMALI Antibiotic resistance can pass from animals to humans (CDC 2006) Antibiotic resistance is increasing in human and veterinary medicine
49 Antibiotic Resistance A Global Problem PRP MRSA VRE VISA ESBL MBL VRSA All β-lactams Vancomycin Vancomycin and teicoplanin Penicillin 3 rd gen. Carbapenem Vancomycin Cephalosporin and Teicoplanin
50 Gram-negativi Evoluzione dell antibioticoresistenza
51 Enterobacteriaceae ESBL caratteristiche Amoxicillina alto grado di Resistenza Ampicillina Piperacillina Azlocillina Ticarcillina Cefalotina (Cefalosporine I-II gen.) Cefotaxime Ceftriaxone Ceftazidime Cefepime Aztreonam Ridotta Sensibilità Clavulanato Sulbactam Tazobactam Sensibilità inibiscono le ESBL CEFAMICINE: Cefoxitina, Cefotetan e Moxalactam CARBAPENEMI: Imipenem, Meropenem Sensibilità Non sono idrolizzati da ESBL
52 Β lattamasi classificazione
53
54 CARBAPENEMASI (CPE) resistenza Penicilline Cefalosporine Inibitori β lattamasi Carbapenemi
55 Il 2010: il problema emergente si complica Klebsiella pneumoniae NDM-I (New Dehli Metallo B-lattamasi tipo I) Enzima capace di trasferirsi con estrema facilità ad diversi generi di microorganismi l plasmide NDM-I è stato isolato in E.coli e K.pneumoniae in USA, Canada, Europa, India e Pakistan Efficaci solo Colistina e Tigeciclina Lancet Infect Dis Apr;9(4): The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Nordmann P, Cuzon G, Naas T. J Infect Dev Ctries May 14;6(5): Detection of carbapenem-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 in Lebanon. El-Herte RI, Araj GF, Matar GM, Baroud M, Kanafani ZA, Kanj SS.
56 Gram-positivi Evoluzione dell antibioticoresistenza
57 Cocchi Gram-positivi Evoluzione dell antibioticoresistenza Penicillina Meticillina S. aureus [1940s] S. aureus penicillino-resistente [1960s] S. aureus (MRSA) meticillino-resistente S. aureus (VRSA) resistente alla vancomicina Vancomicina S. aureus (VISA/GISA) intermedio o resistente a vancomicina/glicopeptidi [1960s] Enterococco (VRE) resistente alla vancomicina CDC, Prevent Antimicrobial Resistance, Aprile 2002
58 Come si identificano?
59 K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxytoca ESBL +
60 Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici per la valutazione della presenza di ESBL K.pneumoniae, E.coli, P.mirabilis, K.oxitoca Ceftazidime e/o Cefotaxime MIC 2mg/L no ESBL - si Screening positivo per la produzione di ESBL test di conferma
61 Produzione di Carbapenemasi nelle Enterobacteriaceae
62 Test di screening e di conferma ai fini epidemiologici della presenza di carbapenemasi AMCLI, Marzo 2012 Indicazioni per la conferma fenotipica della produzione di carbapenemasi nelle Enterobacteriaceae Screening positivo Meropenem 0.5 mg/l o diametro alone di inibizione 25 mm test di conferma
63 test di conferma Test di sinergia con EDTA Test di sinergia con Ac Boronico EDTA Ac.BOR + K.pneumoniae MBL+ K. pneumoniae KPC+ Test di Hodge E.coli ATCC Alone di inibizione Alone di inibizione modificato evidenzia solo la presenza di attivita carbapenemasica (es. OXA-48)
64 Staphyococcus aureus hvisa e VISA
65 VSSA VISA hvisa VSSA VSSA VISA Esempi di cambiamento nella morfologia delle colonie che si ha nei ceppi hvisa, VISA, VSSA
66 Nota A: breakpoint per vancomicina è stato portato a 2 mg/l il test di diffusione da disco non è raccomandato
67 Cosa si nasconde dietro una MIC compresa tra 1 e 2 mg/l? hvisa Etest vancomicina
68 Antibiogramma: Metodi APPROCCI FENOTIPICI basati su attività antimicrobica e breakpoint Determinazione della MIC (brodo, agar, Etest, MICE) Altre determinazioni quantitative (MBC, MPC) Diffusione da dischetto (EUCAST, CLSI, BSAC, CA-SFM,...) Sistemi automatici (Vitek, Phoenix, MicroScan, Wider,...) APPROCCI GENOTIPICI basati sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto meca blaz vana vanb, PBP2a β-lattamasi APPROCCI DEDUTTIVI lettura interpretativa (expert rules) Se meca-positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Stafilococchi) Se ESBL- positivo, riportare come resistente ai β-lattamici (Enterobacteriaceae) Se eritromicino resistente, riportare come resistente anche a claritromicina e azitromicina ( Streptococchi)
69 EUCAST Expert rules Sono una raccolta di conoscenze di esperti su: resistenze intrinseche fenotipi eccezionali di resistenza regole interpretative che possono essere applicate ai tests antimicrobici per ridurre gli errori e seguire appropriate raccomandazioni per refertare particolari tipi di resistenza.
70 Resistenza intrinseca è una resistenza connaturata, non acquisita, di tutti o quasi tutti i rappresentanti della specie
71 Resistenza intrinseca Numero di isolati Specie intrinsecamente resistenti (tutti i ceppi della specie sono resistenti agll antibiotico) MIC Concentrazioni di antibiotico raggiungibili nei tessuti
72 Enterobacteriaceae: resistenza intrinseca
73 Resistenze intrinseche nei batteri Gram-positivi Nota bene: i batteri Gram-positivi sono intrinsecamente resistenti ad aztreonam, temocillina, polimixina B/colistina ed acido nalidixico Gli stafilococchi sono intrinsecamente resistenti al ceftazidime
74 Fenotipi eccezionali di resistenza Potrebbero indicare un errore nella identificazione o nella esecuzione dei test di chemiosensibilità. Se entrambi sono confermati, bisognerebbe inviare l isolato ad un laboratorio di riferimento. Tali fenotipi di resistenza possono cambiare con il tempo e variano in relazione a differenze geografiche
75 Fenotipi eccezionali di resistenza
76 REGOLE INTERPRETATIVE Sulla base della resistenza ad un particolare antibiotico e alla identificazione di un isolato è possibile dedurre un meccanismo di resistenza e predire la resistenza ad un altro antibiotico. L evidenza e il significato clinico di queste regole hanno gradi diversi: A. Esistono evidenze cliniche che correlano la interpretazione di sensibilità al fallimento clinico. B. Evidenza debole e basata su pochi casi o su modelli sperimentali. C. Evidenza clinica inesistente, ma i dati microbiologici suggeriscono che l uso clinico del farmaco deve essere sconsigliato.
77 REGOLE INTERPRETATIVE EUCAST rule 13.6 (Salmonella spp.) IF ciprofloxacin MIC is >0.06 mg/l, THEN report as resistant to all fluoroquinolones Evidence for clinical failure of fluoroquinolones in cases of resistance caused by the acquisition of at least one target mutation in gyra Evidence for this rule is A only for S.Typhi (B for other salmonella)
78 REGOLE INTERPRETATIVE EUCAST rule 11.3 (Streptococcus spp.) IF resistant to erythromycin but susceptible to clindamycin, THEN Test for inducible MLSB resistance. If positive, report as susceptible to clindamycin with a warning that resistance may develop during treatment Evidence for this rule is C
79 Conoscendo l agente etiologico Dalla valutazione delle resistenze intrinseche, dei fenotipi eccezionali e con l ausilio delle regole interpretative è possibile intraprendere una terapia antibiotica razionale
80 AZIENDA OSPEDALIERA DI COSENZA U.O.C. di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare Direttore Dr. Cristina Giraldi Paziente XXXXXXXXXXX Richiesta n XXXXXXXXXXX data di nascita XXXXXXXXX del XXXXXXXXXXXXXXXXXX URINOCOLTURA Urine da mitto intermedio Ricerca di: -1- Escherichia coli UFC /ml germi non esigenti Antibiogramma RSI MIC Break Point MIC (SENS) ESBL - AMPICILLINA R >32 8 AMOXIC/AC. CLAV S 8 8 PIPERACILLINA R >64 8 CEFOTAXIME S <=1 1 GENTAMICINA S <=1 2 NITROFURANTOINA S 4 64 NORFOLXACINA S <=0,5 0,5 CIPROFOLXACINA S <=0,5 0,5 AMIKACINA S <=2 8 CEFTAZIDIME S 1 2 IMIPENEM S 0,5 2 CEFEPIME S <=1 1 TRIMETHO/SULFAM R > Legenda RSI= Resistente Sensibile Intermedio MIC= Concentrazione Minima Inibente ( g/ml) Break-point MIC SENS = Limite di sensibilità ( g/ml) Dal 3 ottobre 2011 l interpretazione dell antibiogramma segue I criteri dell European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)
81 Conseguenze dell antibiotico-resistenza Gli antibiotici sono essenziali per la medicina moderna Chirurgia Trapianti d organo Chemioterapia oncologica Terapia intensiva Cura dei neonati pretermine Fonte: Prof. Otto Cars, Director of Strama (The Swedish Strategic Programme Against Antibiotic Resistance) 82
82 grazie Grazie
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