Dott.ssa Stefania Soranno Dirigente Biologo S.C. di Patologia Clinica P.O. SS. Annunziata - Taranto

Transcript

1 Dott.ssa Stefania Soranno Dirigente Biologo S.C. di Patologia Clinica P.O. SS. Annunziata - Taranto

2 Albumina 1 Albumine L elettroforesi delle proteine è un esame di laboratorio basato sulla separazione delle proteine in presenza di corrente elettrica ed in funzione della propria carica Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 2

3 L elettroforesi delle siero-proteine (S-EF) rappresenta la tecnica analitica di elezione per la rivelazione delle CM sieriche e per la loro quantificazione, essendo in grado di rilevare l omogeneità molecolare della proteina. Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali (Biochimica clinica Vol.38, n 1)

4 Requisiti di qualità : Elevata Sensibilità < 1g/L (il limite di rilevabilita di una CM è 0.5g/L) Alta risoluzione: Deve essere apprezzabile la tenue banda della pre-albumina Si deve apprezzare l eventuale eterozigosi della alfa1antitripsina Nella zona alfa2 si deve poter distinguere la componente anodica(alfa2macroglob.) da quella catodica (aptoglobina) In zona β-globulinica si deve poter distinguere la transferrina dal fattore C3 del complemento. Personale specificamente formato e con esperienza Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali (Biochimica clinica Vol.38, n 1)

5 Elettroforesi delle proteine sieriche Ricerca, monitoraggio e dosaggio di componenti monoclonali Rilevazione di varianti genetiche delle proteine Rilevazione di varianti indotte delle proteine Valutazione di variazioni dell assetto proteico globale

6 Elettroforesi delle proteine urinarie Tipizzazione della localizzazione del danno renale

7 Separazione Separazione didi particelle particelle dotate dotate di di cariche, cariche, attraverso attraverso un un mezzo mezzo liquido liquido e/o e/o solido, solido, ee sotto sotto l impulso l impulso didi un un campo campo elettrico. elettrico. La mobilità delle molecole dipende da: Carica delle molecole Dimensioni delle molecole ( e in parte forma), Viscosità del mezzo elettroforetico

8 Le particelle migrano e si separano, fra i pori di un supporto solido inerte, in base alla diversa mobilità e si raggruppano in zone ristrette in cui migrano una o più proteine specifiche ACETATO DI CELLULOSA AGAROSIO GEL DI POLIACRILAMMIDE CAPILLARE RIEMPITO DI UN TAMPONE

9 Punto di applicazione ( Albumina, Alfa1, Alfa2, Beta ) Anodo Campo elettrico (Gamma globuline ) EEO Catodo Supporto vettore (gel di agarosio) Soluzione tampone (PH 9,2) ΔV Rivelazione del segnale dopo colorazione, decolorazione, asciugatura e lettura densitometrica.

10 Lettura spettrofotometrica diretta No colorazione Completa automazione Migrazione

11

12 Comparison of capillary zone and immunosubtraction with agarose gel and immunofixation electrophoresis for detecting and identifying monoclonal gammopathies. Litwin CM, Anderson SK, Phillips G, et al. l gammopathies. Am J Clin Pathol 1999 L AGE rileva solo 11 su 14 (79% IgA) picchi monoclonali identificati con CZE : 617 campioni di siero analizzati con CZE e AGE.Corrispondenza di rilevazione per picchi monoclonali di tipo IgM, IgG, cloni biclonali e catene leggere libere.

13 AGAROSIO CAPILLARE : Immunoglobuline -1 glycoproteina acida -1 antitripsina Aptoglobina Gamma Beta-2 Transferrina, Emopessina, Β lipoproteina Complemento C3, Beta-1 Aptoglobina, α2 macroglobulina, Α lipoproteina Alpha-2 2 Alpha-1 1 α1- glicoproteina acida, 1 antitripsina Albumine Albumina Complemento C3 Transferrina Emopessina -2 macroglobulina

14 AGAROSIO: Alb CAPILLARE: Alb Evidenza Evidenza di di varianti varianti genetiche genetiche dell albumina dell albumina (alloalbuminemia) (alloalbuminemia) oo di di varianti varianti indotte indotte (bisalbuminemia) (bisalbuminemia)

15 Messa in evidenza di varianti genetiche dell alfa1 antitripsina (alto valore diagnostico per malattie polmonari ed epatiche associate a deficienza di AAT) AGAROSIO CAPILLARE Alb L elettroforesi proteica è in grado di escludere il deficit di α-1-antitripsina, ma la sua conferma necessita della misura immunochimica della proteina.

16 AGAROSIO: CAPILLARE HPT AAT+ AAG globuline C3 Alb Alb L elettroforesi proteica evidenzia alcune proteine di fase acuta. Può essere accompagnato da una variazione policlonale o oligoclonale della zona gamma

17 AGAROSIO: CAPILLARE globuline Alb C3 Alb Il ponte beta gamma è causato da un marcato aumento policlonale delle IgA che migrano in questa regione, concomitante ad un aumento delle IgM e IgG, che si riscontra nella cirrosi epatica.

18 AGAROSIO CAPILLARE L elettroforesi L elettroforesi sieroproteica sieroproteica èè in in grado grado di di evidenziare evidenziare deficit deficit oo aumenti aumenti policlonali policlonali di di immunoglobuline immunoglobuline IgG IgG (in (in misura misura minore minore IgA IgA ee IgM) IgM)

19 AGAROSIO CAPILLARE Frequente Frequente in in infezioni infezioni virali, virali, malattie malattie autoimmuni, autoimmuni, trattamento trattamento immunosoppressore immunosoppressore

20 Profilo oligoclonale IgG kappa e lambda

21 In capillare, la C.M. si presenta come un picco a base stretta Su gel d agarosio la C.M. si presenta come una banda stretta

22 (Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammapatie monoclonali (Biochimica clinica Vol.38, n 1)

23 La produzione di una singola componente monoclonale (CM) è una caratteristica specifica delle gammopatie monoclonali. Indicazioni per il corretto impiego delle indagini biochimiche nelle gammopatie monoclonali Alberto Dolci, Ilenia Infusino, Roberta Mozzi, Mauro Panteghini

24

25 Visipaque, Omnipaque, Xénétix inducono un picco verso la fine della frazione Alfa2 L Héxabrix provoca un doppio picco in Alfa 2 Lo Ioméron induce un picco in zona Beta1

26

27

28 Il Il Sulfaméthoxazole Sulfaméthoxazole può può indurre indurre un un picco picco in in zona zona pre-albumina pre-albumina Clinical Chemistry 49, No 2, 2003 Effect of Sulfamethoxazole on Clinical Capllary Zone Electrophoresis of Serum Proteins Xavier Bossuyt, Jan Verhaegen, Godelieve Mariën and Norbert Blanckaert

29 Beta lipoproteine

30 AGAROSIO CAPILLARE

31 CRIOGLOBULIN A M-PROTEINE TRANSFERINA

32 Ig M kappa fortemente polimerizzata a temperatura ambiente Stessa componente, processata in tecnica capillare Crioglobuline Crioglobuline

33

34

35

36

37

38 Anche una C.M. di piccole dimensioni (es.iga/lambda), che spesso richiede l immunofissazione del siero per la sua identificazione, può associarsi ad una sindrome complessa,come quella definita dall acronimo POEMS polyneuropathy,organomegaly, endocrinopaty,m protein,skin changes

39

40

41

42

43 Scopo del documento è fornire indicazioni sul corretto percorso da adottare in laboratorio al momento del primo riscontro di una CM e durante il successivo monitoraggio assicurando al contempo l esecuzione di tutte le indagini necessarie alla gestione ottimale del paziente con GM. Questo documento esamina i test di laboratorio che possono/devono esser eseguiti per la gestione delle gammopatie monoclonali in differenti contesti clinici (screening, monitoraggio e valutazione risposta alla terapia)

44 CM VISIBILE ALLA SPE IL LABORATORIO PUÒ PROCEDERE AUTONOMAMENTE Eseguire Quantificazione CM Eseguire Immunotipizzazione sierica e urinaria IL LABORATORIO NON PUÒ PROCEDERE AUTONOMAMENTE

45 CM CM VISIBILE VISIBILE ALLA ALLA SPE SPE IL LABORATORIO NON PUÒ PROCEDERE AUTONOMAMENTE le le modalità modalità di di refertazione refertazione della della S-EF S-EF devono devono essere essere tali tali da da trasmettere trasmettere al al clinico clinico le le informazioni informazioni necessarie necessarie in in forma forma chiara chiara ed ed esaustiva. esaustiva.

46 La quantificazione delle CM deve essere effettuata Quando dall'ispezione visiva non si rilevino anomalie alla prima e sistematicamente riferibili a rilevazione CM, i tracciati devono esseredurante sempreil accompagnati un commento specifico che indichi monitoraggio, da deve essere sempre espressa in con chiarezza che la SPE non evidenzia CM (con il concentrazione metodo utilizzato)calcolata come percentuale delle proteine totali misurate e deve essere accompagnata Si deve invece indicare la presenza (se è stata dalla tipizzazione alla primao larilevazione e ogni immunologicamente tipizzata) sospetta presenza di CM (qualora non sia stata ancora qualvolta dalla valutazione ispettiva del eseguita tracciato la si tipizzazione), evitando descrizioni poco comprensibili cambiamenti rispetto al osospettino equivoche possibili della morfologia del tracciato (picco omogeneo, ecc.) precedente asimmetria, profilo di immunofissazione. Indagine sulle modalità di refertazione dell'elettroforesi sieroproteica Anna Caldini1, Maria Stella Graziani2, Doc. SIBIOC 2009

47 La quantificazione della C.M. è un indice della massa tumorale in tutte le malattie secernenti Il modo più corretto di misurare la CM sierica è per proporzione diretta con la concentrazione delle proteine totali sieriche dopo delimitazione del picco monoclonale nel tracciato elettroforetico.

48 La misura immunochimica della C.M. è inaccurata Qualora però la CM non è quantificabile dal tracciato S-EF, perché poco rappresentata o non ben separata da altre proteine sieriche, come quelle in zona beta, può essere utilizzata la misura immunochimica. Il singolo paziente deve essere monitorato per quanto possibile sempre con lo stesso metodo.

49 Diagnostica differenziale Stratificazione del rischio Valutazione della risposta alla terapia

50 PERCORSO DI LABORATORIO

51 Una volta accertata la presenza di una CM occorre inquadrare correttamente il tipo di discrasia plasmacellulare:

52 Mieloma multiplo marcatori citogenetici classe della catena pesante della Ig coinvolta( IgA>IgG) Albumina sierica LDH β2 microglobulina MGUS misura della CM Tipizzazione della CM S-FLC

53

54 Conclusioni Anche Anche piccole piccole CM CM vanno vanno segnalate segnalate perche perche possono possono essere essere causa causa di di malattie malattie gravi gravi IlIl laboratorio laboratorio al al primo primo riscontro riscontro di di una una CM CM puo puo procedere procedere con con esami esami aa cascata cascata per per l inquadramento l inquadramento del del paziente paziente oo segnalarli segnalarli nel nel referto referto al al clinico clinico Si Si rende rende necessaria, necessaria, quindi, quindi, una una stretta stretta interazione interazione tra tra Laboratorista Laboratorista ee Clinico Clinico al al fine fine di di condividere condividere pannelli pannelli definiti definiti di di esami esami da da eseguire eseguire nei nei diversi diversi contesti contesti (( diagnostica diagnostica differenziale, differenziale, stratificazione stratificazione del del rischio, rischio, ecc..), ecc..), con con l obiettivo l obiettivo di di evitare evitare la la duplicazione duplicazione di di esami esami ridondanti, ridondanti, assicurando assicurando al al contempo contempo la la gestione gestione ottimale ottimale del del paziente paziente con con GM. GM.

55 per L