FUNZIONI BIOLOGICHE DELLE PROTEINE

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1 FUNZIONI BIOLOGICHE DELLE PROTEINE ENZIMI PROTEINE DI TRASPORTO PROTEINE DI RISERVA PROTEINE CONTRATTILI PROTEINE DI DIFESA PROTEINE REGOLATRICI PROTEINE STRUTTURALI

2 ENERGIA LIBERA (G) ΔG = ΔH - TΔS Variazioni di energia libera di un sistema che sta subendo una trasformazione a pressione e temperatura costanti ΔH: variazione di entalpia ΔS: variazione di entropia

3 Il ΔG può essere usato per stabilire se un processo può avvenire spontaneamente (ΔG negativo) ΔG=0 equilibrio Il ΔG dipende dalla differenza di energia libera tra prodotti e reagenti. E indipendente dalla via seguita dalla trasformazione. Il ΔG non indica a che velocità avviene la reazione

4 ΔG variazioni di Energia Libera Standard (in cui i reagenti sono 1M) ΔG variazioni di Energia Libera Standard a ph7

5 Le BIOMOLECOLE sono stabili a ph 7, a 37 C, in ambiente acquoso Difficoltà di una reazione: Formazione di intermedi instabili Collisione tra molecole con un preciso orientamento

6 Un ENZIMA supera questi problemi generando un ambiente specifico in cui una data reazione avviene

7 Le reazioni avvengono in una tasca detta SITO ATTIVO

8 SITO ATTIVO Contiene una regione di specificità che permette il legame del substrato Contiene un sito di reazione in cui il substrato è trasformato

9 ENZIMI Sono nella maggior parte proteine Sono i catalizzatori delle reazioni biologiche Hanno elevata specificità Operano in soluzione acquosa in condizioni blande di temperatura e ph La loro attività dipende dall integrità della conformazione proteica nativa La loro attività può essere regolata (fosforilazione, glicosilazione, ecc )

10 COFATTORI Alcuni enzimi per essere attivi necessitano di cofattori I cofattori possone essere: Ioni inorganici (Fe 2+ ; Mg 2+ ; Mn 2+ ; Zn 2+ ) Molecole organiche o metallo-organiche dette coenzimi Se lo ione inorganico o il coenzima sono legati covalentemente all enzima viene detto gruppo prostetico

11 ENZIMI E SPECIFICITA Catalizzano in genere UNA SOLA reazione chimica perché hanno un sito specifico a cui si lega il substrato Esempio: ENZIMI PROTEOLITICI

12 Alcuni ENZIMI PROTEOLITICI catalizzano reazioni diverse ma correlate TRIPSINA TROMBINA

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15 Il ΔG tra S e P è negativo. L equilibrio favorisce la formazione di P. L enzima non interviene su questo equilibrio. La velocità della reazione non dipende però dal ΔG ma dalla barriera energetica che corrisponde all energia necessaria ad allineare i gruppi reagenti, a riorganizzare legami affinché la reazione possa procedere. Questo punto della reazione è detto STATO DI TRANSIZIONE ΔG = ENERGIA DI ATTIVAZIONE

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17 Un enzima aumenta la velocità di reazione abbassando l energia di attivazione ΔG. L enzima non viene consumato durante il processo e il punto di equilibrio rimane inalterato. La reazione raggiunge l equilibrio più velocemente Gli equilibri di reazioni sono collegati al ΔG, mentre la velocità al ΔG.

18 L energia che si libera dalle interazioni enzima-substrato viene detta ENERGIA DI LEGAME. L energia di legame è la fonte principale di energia libera usata dall enzima per abbassare l energia di attivazione della reazione.

19 L energia di legame viene utilizzata per superare le barriere fisiche e termodinamiche di una reazione: 1. RIDUZIONE ENTROPICA L energia di legame mantiene i substrati nella posizione corretta 2. DESOLVATAZIONE La formazione di legami tra E e S portano alla rimozione di H2O del substrato

20 3. STIRAMENTO O DISTORSIONE DEL SUBSTRATO La somma delle interazioni deboli tra E e S compensano le modifiche termodinamicamente sfavorite del substrato che nello stato di transizione può subire distorsioni sia elettroniche che strutturali 4. ADATTAMENTO DELL ENZIMA L enzima può subire cambi conformazionali, adattandosi al substrato. La nuova conformazione esalta le proprietà catalitiche dell enzima

21 IL SITO ATTIVO: Promuove la prossimità dei reagenti Destabilizza lo stato fondamentale (stabile) con attivazione di alcuni gruppi che diventano più reattivi Stabilizza lo stato di transizione evitando la formazione di prodotti secondari

22 TIPI DI REAZIONI CATALIZZATE: Ossido-riduzioni Addizione/sottrazione di gruppi Idrolisi Decarbossilazioni

23 Per poter catalizzare una reazione un enzima deve essere complementare allo stato di transizione

24 1. Nel complesso enzima-substrato si formano alcune interazioni deboli che rappresentano la forza trainante della catalisi 2. Nel complesso enzima-substrato nello stato di transizione si formano tutte le interazioni possibile che contribuiscono alla catalisi

25 Modello ESOCHINASI: variazione conformazionale indotta dal legame con il substrato (glucosio)

26 CINETICA ENZIMATICA

27 1 = V 0 K m V max 1 [S] + 1 V max y = mx + q 1 V 0 Pendenza = K m V max 1 V max - 1 K m 1 [S]

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29 Valori di K m di alcuni enzimi Enzima Substrato K m (mm) Catalasi H 2 O 2 25 Esochinasi (cervello) ATP D-Glucosio D-Fruttosio 0,4 0,05 1,5 Anidrasi carbonica HCO Chimotripsina Gliciltirosinilglicina N-Benzoiltirosinamide 108 2,5 β-galattosidasi D-Lattosio 4,0 Treonina deidradasi L-Treonina Numero di turnover di alcuni enzimi 5,0 Enzima Catalasi Anidrasi carbonica Acetilcolinesterasi β-lattamasi Fumarasi Proteina RecA (ATPasi) Substrato H 2 O 2 HCO - 3 Acetilcolina Benzilpenicillina Fumarato ATP K cat ,4

30 Inibizione enzimatica

31 GLI ENZIMI POSSONO ESSERE INIBITI Gli INIBITORI enzimatici possono essere REVERSIBILI IRREVERSIBILI Hanno importanti applicazioni in campo farmaceutico

32 Gli inibitori reversibili possono essere competitivi e non competitivi

33 INIBIZIONE COMPETITIVA

34 EFFETTO DELL INIBIZIONE COMPETITIVA SULLA CINETICA ENZIMATICA

35 INIBIZIONE NON COMPETITIVA

36 EFFETTO DELL INIBIZIONE NON COMPETITIVA SULLA CINETICA ENZIMATICA

37 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA ENZIMATICA

38 ENZIMI REGOLATORI 1. ENZIMI ALLOSTERICI Questi enzimi esistono in più di una forma. La molecola regolatrice può cambiare la conformazione dell enzima. Questo gruppo di enzimi può essere regolato finemente. 2. ENZIMI REGOLATI DA MODIFICAZIONI COVALENTI REVERSIBILI Questo gruppi di enzimi o è attivo o inattivo (tutto o nulla) Tutte e due le classi di enzimi regolatori hanno più subunità e i siti regolatori e siti catalitici sono su subunità diverse

39 ENZIMI Allosterici Sono un gruppo di enzimi che non seguono a cinetica di Michaelis-Menten La loro attività è aumentata o diminuita da piccole molecole o cofattori Regolano importanti vie metaboliche A B C D E E 1 E 2 E 3 E 4

40 INTERAZIONI TRA SUBUNITA DI UN ENZIMA ALLOSTERICO

41 CURVA DI SATURAZIONE DA SUBSTRATO DI UN ENZIMA ALLOSTERICO

42 ENZIMI REGOLATI DA MODIFICAZIONI COVALENTI

43 REGOLAZIONE ALLOSTERICA Controlla enzimi che lavorano in maniera continua. REGOLAZIONE COVALENTE Controlla enzimi che o funzionano o sono spenti. Alcune modificazioni sono reversibili, altre no. Spesso è sotto il controllo ormonale

44 fine

45 REGOLAZIONE DI ACTasi Lega i substrati in modo cooperativo (effettori omotropici positivi) CTP inibisce l enzima (effettore eterotropico negativo) ATP è un attivatore allosterico L ATP si lega nello stesso sito del CTP Elevato ATP: la cellula ha energia sufficiente per dividersi. Eccesso di purine

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47 ASPARTATO TRANSCARBAMMILASI (ACTasi) Enzima allosterico che catalizza la prima tappa nella biosintesi delle pirimidine

48 ENZIMI ALLOSTERICI ETEROTROPICI E CINETICA 1. Un modulatore può aumentare o diminuire la K Un modulatore può aumentare o diminuire la V max

49 ORGANIZZAZIONE DELL ENZIMA E un eteromultimero del tipo α 6 β 6. Questo enzima può essere dissociato dal paraidrossimercurilbenzoato che abolisce le proprietà allosteriche dell enzima ACTasi (α6β6) Catena C + phmb Catena R Ogni subunità è costituita da 3 catene C; possiede 3 siti per aspartato e 3 siti per carbamilfosfato. Ogni singola catena è inattiva ognuna contribuisce ai siti 2 subunità C 3 subunità R Ogni subunità R puö legare 2 ATP o 2 CTP e contiene uno Zn 2+ la cui rimozione fa perdere l attivitä regolatoria.

50 MODIFICAZIONI COVALENTI

51 Gli enzimi possono utilizzare diversi tipi di catalisi per facilitare la rottura o la formazione di legami. I più caratterizzati sono: 1.CATALISI ACIDO-BASICA 2.CATALISI COVALENTE 3.CATALISI DA IONI METALLICI, legati a gruppi prostetici tipo EME o con legami di coordinazione ad aminoacidi

52 PROTEASI A SERINA TRIPSINA CHIMOTRIPSINA ELASTASI Enzimi digestivi sintetizzati nel pancreas e secreti come proenzimi nel tratto digerente TROMBINA PLASMINA Deriva dal plasminogeno Rompe i polimeri di fibrina dei coaguli

53 PROENZIMA O ZIMOGENO taglio (tripsinogeno chimotripsinogeno elastasi) ENZIMA ATTIVO ACETILCOLINESTERASI Non è una proteasi ma è una serina esterasi che degrada l acetilcolina a livello dello spazio sinaptico. Stesso meccanismo d azione.

54 SPECIFICITA DI TAGLIO TRIPSINA ARG, LYS CHIMOTRIPSINA PHE, TYR ELASTASI piccoli residui neutri Sono enzimi strutturalmente simili: residui idrofobici e aromatici all interno; residui carichi sono esposti sulla superficie Tre residui polari formano la TRIADE CATALITICA in corrispondenza del sito attivo: HIS 57, ASP 102, SER 195

55 CHIMOTRIPSINA E una proteasi specifica per legami peptidici adiacenti a residui aminoacidici aromatici o idrofobici La reazione enzimatica illustra il principio della stabilizzazione dello stato di transizione da parte dell enzima ed è un esempio di catalisi acido-basica e di catalisi covalente

56 MECCANISMO DI CATALISI DELLA CHIMOTRIPSINA

57 MECCANISMO DI CATALISI DELLA CHIMOTRIPSINA 1. Posizionamento del substrato 2. Attacco nucleofilo della serina 195. L istidina 57 agisce come base, si ha la formazione di un ossianione 3. Rottura del legame peptidico e formazione di un acilenzima. L istidina 57 cede il protone (catalisi acida) 4. L istidina 57 prende un protone dall H 2 O (catalisi basica). Intermedio tetraedrico. 5. L istidina 57 cede un protone alla serina 195. Si ottiene enzima libero e prodotto

58 1. POSIZINAMENTO DEL SUBSTRATO NEL SITO ATTIVO Legami idrogeno con serina 195 e glicina 193 (sito attivo) Inserimento dell anello aromatico nell incavo idrofobico (adiacente al sito attivo)

59 2. FORMAZIONE DI UN INTERMEDIO TETRAEDRICO PER ATTACCO NUCLEOFILO DELL OH DELLA SERINA AL C CARBONILICO DEL PEPTIDE L -OH della serina 195 diventa reattivo (nucleofilo) L isitidina 57 può accettare un protone della serina 195. L aspartato 102 stabilizza l istidina carica, che agisce come base.

60 L ossianione è stabilizzato da legami idrogeno con Serina 195 Glicina 193 OSSIANIONE: INTERMEDIO TETRAEDRICO CARICO ROTTURA LEGAME PEPTIDICO ACIL-ENZIMA

61 DEACILAZIONE CON INTERVENTO DI UNA MOLECOLA DI ACQUA La rete Asp 102 e His 57 strappa in protone all acqua L OH- attacca immediatamente il C carbossilico del gruppo acilico legato alla serina 195. Intermedio tetraedrico temporaneo.

62 L istidina 57 dona poi un protone alla serina 195 che rilascia il substrato modificato

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64 CATALISI DA IONI METALLICI Il metallo dell enzima può fare legami ionici con il substrato I metalli possono anche mediare reazioni di ossido-riduzione variando reversibilmente il loro stato di ossidazione

65 CARBOSSIPEPTIDASI A: un metallo enzima

66 CINETICA ENZIMATICA La concentrazione del substrato modifica la velocità di reazione. Per semplicità si studia la velocità iniziale V 0 in condizioni in cui [S]>>[E] K 1 E + S ES E + P K -1 K 2 K -2 Quando si raggiunge V max tutto l enzima è saturato e si trova nella forma ES. Aggiunte di substrato non modificano la V max A basse concentrazioni si S, l enzima si trova nella forma libera E. Aumentando la [S] aumenta la forma ES e la V 0

67 K 1 E + S ES E + P K -1 K 2 K -2

68 La relazione tra concentrazione del substrato e velocità della reazione enzimatica può essere espressa in modo quantitativo dell equazione di MICHAELIS-MENTEN Vmax [S] V 0 = K m + [S] K m = K 2 + K -1 K 1

69 TRASFORMAZIONE DELL EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN Facendo il reciproco di entrambi i termini dell equazione V 0 = V max [S] K m + [S] 1 = V 0 K m + [S] V max [S] 1 = V 0 K m V max [S] + [S] V max [S] 1 = V 0 K m V max 1 [S] + 1 V max y = mx + q

70 K2 è la costante che limita la velocità. Se K 2 << K -1 K m = K 2 + K -1 K 1 K m = K -1 K 1 che rappresenta la costante di dissociazione del complesso ES. Solo in queste condizioni K m rappresenta l affinità dell enzima per il substrato.

71 K cat Le reazioni enzimatiche possono avvenire a 2 o più tappe. K cat descrive la tappa che limita la velocità di una reazione enzimatica in condizioni di saturazione. K cat = K2 K cat = K3 reazione a 2 tappe reazione a 3 tappe Se le tappe limitanti sono più di una K cat diventa una funzione complessa contenente le costanti di velocità delle varie tappe della reazione K cat è una costante espressa in S -1 e viene detta numero di turnover (molecole di substrato convertite in prodotto nell unità di tempo da una singola molecola di enzima)

72 Il modo migliore per confrontare l efficienza catalitica di un enzima per diversi substrati o di enzimi diversi è di paragonare il rapporto K cat K m detto COSTANTE DI SPECIFICITA

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