S. M. Aloj - Università di Napoli Federico II - Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare L. Califano

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3 Biosnthesi (de novo) delle Purine Ribosio-5-Fosfato Una serie di reazioni (non importa se non le ricordate) H O N C C N C C N CH N Inosin-Monofosfato O H N C C H 2 N N C C N CH N ATP Inibizione da Feedback GTP NH 2 N C C C C H N N CH N

4 Degradazione delle Purine Rimozione sequenziale di atomi Prodotto finale: Acido Urico AU specifico per i Primati Altre specie metabolizzano ulteriormente l Acido Urico Escreto nelle Urine Xantina Ossidasi

5 APRT=Adenina Fosforibosil Trasferasi HGPRT=Ipoxantina-Guanina Fosforibosil Trasferasi Cotran: Robbins Pathologic Basis of Disease, 6th ed.,1999

6 Enzimi del ciclo di recupero (salvage pathway) 1. Adenina-Fosfo-Ribosil trasferasi (APRT) 2. Ipoxantina-Guanina-Fosfo-Ribosil trasferasi (HGPRT) 1. Adenina + PRPP AMP + PPi 2. Ipoxantina + PRPP IMP + PPi 2. Guanina + PRPP GMP + PPi

7 Ipoxantina-Guanina fosforibosiltrasferasi (HGPRT, EC ) Enzima citoplasmatico presente in tutti i tessuti, particolarmente attivo nel cervello e nelle gonadi. Catalizza il trasferimento del gruppo fosfo-ribosio del fosfo-ribosil-piro-fosfato (PRPP) alla posizione 9 dell anello purinico delle basi Ipoxantina e Guanina, formando Inosin-mono-fosfato (IMP) e Guanosinmono-fosfato (GMP)

8 Formazione di acido urico da ipoxantina e xantina, catalizzata da xantina ossidasi.

9 Enzimi di maggior rilevanza in patologia umana: Ipoxantina-guanina fosfo-ribosil trasferasi Adenosin deaminasi

10 Rilevanza biologica del HGPRT Controlla l equilibrio tra la via biosintetica ed il ciclo di recupero delle basi. Il difetto di HGPRT comporta super-produzione di urato a causa dell alterato riciclo di ipoxantina e guanina. La mancanza di feed-back negativo sulla sintesi si accompagna ad iperproduzione e catabolismo delle basi ad urato. Il fosfo-ribosil-pirofosfato (PRPP) non utilizzato nel ciclo di recupero rappresenta un ulteriore stimolo alla produzione di urato.

11 Difetto di HGPRT Sindrome di Lesch-Nyhan. Può essere facilmente rilevato negli eritrociti e nei fibroblasti in cultura. La malattia viene trasmessa come carattere recessivo legato al cromosoma X. Il gene di HGPRT é stato localizzato (Xq26). L Allopurinolo, inibitore della xantina ossidasi, riduce la concentrazione di urato.

12 Sindrome di Lesh-Nyhan Malattia genetica caratterizzata da 3 manifestazioni principali: Iperproduzione di urato ed iperuricemia di grado elevato, Danni neurologici, Disordine comportamentale.

13 Sindrome di Lesh Nyan

14 Difetti di: Adenosin De-Aminasi (ADA) e Purin-Nucleoside Fosforilasi (PNP) Difetti genetici del ciclo di recupero delle purine causa di grave immunodefucuenza (SCID). ADA e PNP sono enzimi Housekeeping ubiquitari. Ambedue difetti comportano accumulo di metaboliti tossici, specialmente nei linfociti. Nel difetto di ADA l effetto tossico blocca lo sviluppo di linfociti T e B e dei Natural Killers (NK). Nel difetto di PNP l effetto tossico blocca soprattutto i linfociti T.

15 Deficit di ADA Trasmesso come carattere autosomico recessivo. Oltre 100 casi descritti senza preferenza etnica. Due isoenzimi di massa molecolare diversa, quella minore considerata attiva. Nelle forme più gravi l enzima non é dosabile.

16 ADA: difetto molecolare Gene (32kb, 12 esoni) localizzato a 20q13.2-qter. In pazienti con difetto di ADA mrna in quantità normali o super-normali. Numerose mutazioni puntiformi, in particolare nell esone 11.

17 Deficit di ADA É stata la prima malattia per la quale é stato tentata terapia genica (1990). Per quanto la terapia aumenti la resistenza alle infezioni, il protocollo include la somministrazione di PEG- ADA il che rende difficile la valutazione dei risultati ottenuti.

18 Difetto di PNP Livelli elevati di desossi-gtp (d-gtp) inibiscono l enzima ribonucleotide-riduttasi e la sintesi di DNA. Il gene PNP mappa sul cromosoma 14 (14q13) e codifica per un trimero di ~90 kd. Molte delle mutazioni identificate sono missenso ma sono state descritte anche delezioni. Tutte le mutazioni omozigoti di PNP sono associate a manifestazioni cliniche.

19 Gotta

20 Gotta Malattia causata dall accumulo di un eccesso di acido urico, prodotto terminale del metabolismo delle purine. Caratterizzata dal ripetersi di episodi di artrite acuta, a volte, associata alla formazione di accumuli di aggregati cristallini detti tofi. Questi sono la conseguenza della formazione di precipitati di cristalli di urato monosodico la cui concentrazione nei liquidi biologici supera la saturazione.

21 Caratteristiche della Gotta: Il paziente manifesta iperuricemia per anni, prima della manifestazione dei sintomi 75% degli attacchi iniziali riguardano gli arti inferiori Non tutte le iperuricemie sfociano nella malattia Il dolore é improvviso ed intenso, ma diventa modesto dopo l attacco

22 Patogenesi della Gotta Purine: apporto dieta Escrezione urinaria Pool di Urato Purine: Biosintesi Endogena Escrezione intest. Super-saturazione & cristallizaz. urato Gotta

23 Assenza di Uricasi nell uomo Homo S.: insorgenza spontanea delle Gotta. In altre specie (anfibi e mammiferi non-primati) l urato è degradato ossidativamente dall enzima Uricasi che da luogo alla formazione di Allantoina, più solubile. In Homo S. il gene uricasi è inattivato da due mutazioni che introducono un segnale di STOP prematuro. Assenza di uricasi e cospicuo riassorbimento renale comportano livelli di urato plasmatico 10 volte superiori rispetto ad altre specie (30-59µmol/L). Urato (?): antiossidante primario (effetto analogo a vitamina C), rimuoverebbe radicali liberi O 2.

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26 Ruolo dell urato nella gotta Acido urico: acido debole (pka 5,8), prevalentemente urato a ph fisiologico. Aumento concentrazione urato>>super-saturazione e cristallizzazione. Associazione positiva tra livelli serici di urato e rischio di gotta. Effetto protettivo di farmaci anti-iperuricemici. Solubilità articolare influenzata da vari fattori: (temperatura, ph, concentrazione cationi, idratazione, proteoglicani).

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28 Come viene classificata la Gotta: Gotta primaria (90% dei casi) Difetto enzimatico ignoto (85-90% dei casi di Gotta primaria) Difetto enzimatico noto (es. Difetto parziale di HGPRT[raro]) Iperuricemia. Escrezione normale di urato (maggioranza dei casi). Aumentata escrezione di urato Ridotta escrezione con produzione normale di urato Iperuricemia. Gotta secondaria (10% dei casi) Aumentato ricambio di Acidi Nucleici (es. Leucemie) Malattie renali croniche Difetto congenito del metabolismo (es. Difetto totale di HGPRT, Sindrome di Lesh-Nyhan) Iperproduzione di Urato con iperescrezione Ridotta escrezione, produzione normale Iperproduzione di Urato con iperescrezione

29 Patogenesi della Gotta Livelli elevati di acido urico nel sangue e nelle urine Iperproduzione di nucleotidi purinici a causa di aumento della sintesi de novo e/o riduzione del salvage pathway e deposito di cristalli di urato di sodio Risposta infiammatoria DOLORE! Nel lungo periodo: distruzione della cartilagine

30 Cotran: Robbins Pathologic Basis of Disease, 6th ed.,1999

31 Difetti biochimici Aumentata attività della PRPP sintetasi: Livelli elevati di PRPP attivazione di Gln-PRPP amidotrasferasi aumento della sintesi di nucleotidi purinici.

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33 Difetti biochimici Aumentata attività della PRPP sintetasi: Livelli elevati di PRPP attivazione di Gln-PRPP amidotrasferasi aumento della sintesi di nucleotidi purinici. Ridotta attività di HGPRT (salvage pathway): 1) PRPP non utilizzato = alti livelli di PRPP attivazione Gln-PRPP amidotrasferasi. 2) Se non vengono formati IMP e GMP via salvage pathway il feedback negativo su Gln-PRPP amidotrasferasi viene rimosso.

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35 Difetti biochimici Aumentata attività della PRPP sintetasi: Livelli elevati di PRPP attivazione di Gln-PRPP amidotrasferasi aumento della sintesi di nucleotidi purinici. Ridotta attività di HGPRTase (salvage pathway): PRPP non utilizzato = alti livelli di PRPP attivazione Gln-PRPP amidotrasferasi. Se non vengono formati IMP e GMP via salvage pathway il feedback negativo su Gln- PRPP amidotrasferasi viene rimosso. Difetto di Glucosio 6-fosfatasi (Glicogenosi Tipo I, malattia di von Gierke): Aumenta il glucosio 6-fosfato più glucosio 6-fosfato é shuntato alla via dei pentosi aumentala il ribosio 5- fosfato aumenta il livello di PRPP attiva la Gln-PRPP amidotrasferasi.

36 Cristalli di Urato in luce polarizzata (a) e non polarizzata (b) a b Alti livelli ematici di acido urico formano depositi nelle articolazioni. Superata la soglia di solubilità dell urato precipitano cristalli aghiformi. Depositi si formano anche nella cute e nelle vie urinarie

37 Cristalli di Acido Urico Scarsamente solubili in acqua. Cristallizzano nel liquido sinoviale delle articolazioni: Chemiotassi per leucociti Reazioni immuni Attivazione inflammasoma Intensificazione della risposta infiammatoria DOLORE. Distruzione cartilagine. Goldman: Cecil Textbook of Medicine, 21st ed.

38 Cotran: Robbins Pathologic Basis of Disease, 6th ed.,1999 Drenth J and van der Meer J. N Engl J Med 2006;355:

39 Difetti del Metabolismo delle Pirimidine

40 Pyrimidine Synthesis O 2 ATP + HCO Glutamine + H 2 O 2 ADP + Glutamate + P i O NH 2 C O PO 3-2 Carbamoyl Phosphate Aspartate P i Carbamoyl Phosphate Synthetase II Aspartate Transcarbamoylase (ATCase) O HN C Reduced Quinone Quinone O C N H Orotate CH C COO Dihydroorotate Dehydrogenase PRPP PP i Orotate Phosphoribosyl Transferase 1 2- O3 P O 1+2 = UMP Synthase CH 2 H 2 H OH O O HN C H C N H OH CH C Orotidine-5'-monophosphate (OMP) CO 2! OMP Decarboxylase O COO O O HN C CH O HO NH 2 C C N H CH 2 CH COO Carbamoyl Aspartate H 2 O Dihydroorotase O HN C C N H CH 2 CH Dihydroorotate COO 2- O3 P O CH 2 H H OH O O C H N H OH! Uridine Monophosphate (UMP) CH

41 Orotico-aciduria difetto di UMPsintasi (UMPS) UMPS: complesso di due enzimi: orotico-fosforibosiltrasferasi (OPRT) ed orotidina-5-mono-fosfato decarbossilasi (ODC). Catalizza le ultime due tappe della sintesi de novo delle pirimidine formando UMP.

42 Difetto di UMPS Aumento notevole di acido orotico nelle urine (2g/24h vs 2 mg/24h del normale). Deplezione dei pool di Citidil-Difosfoetanolamina e Citidil-Difosfo-colina necessari per la sintesi dei fosfolipidi. Difetto di UDP-glucosio necessario per la sintesi di glicogeno

43 Struttura a domini di UMPS A Batteri, lieviti: Pyr E Pyr F B Organismi multicellulari: OPRTasi Pyr 5 ODCasi Orotato + OMP + PRPP PPi OMP UMP + CO2 Monomero inattivo Effettori allosterici

44 Difetto molecolare nell Orotico-aciduria Attività OPRT ed ODC risiedono in domini separati di una singola proteina codificata da un singolo gene (3q13). Cellule da pazienti esprimono il gene UMPS a livelli normali e trascrivono mrna stabile. Il difetto é attribuito ad un alterazione della sequenza aminoacidica che altera la conformazione dell enzima e riduce l attività ODC.

45 Difetto di Di-idropirimidina deidrogenasi (DHPD) e di Di-idropirimidina amidoidrolasi (DHPA) Il difetto di DHPD comporta accumulo di uracile e timina. Neurotossicità grave con iper-piridinemia in pazienti trattati con 5 -FU per cancro della mammella Il difetto di DHPA comporta modesto accumulo di uracile e timina ed accumulo notevole di diidroderivati.

46 Difetto di CDP-colina fosfotrasferasi L enzima catalizza l ultima tappa nella sintesi di fosfatidilcolina. Il difetto dell enzima é proposto come base molecolare per l accumulo selettivo di CDP-colina eritrocitaria in una forma rara di anemia emolitica.