MBS HACCP&ACQUE Easy Test Analisi microbiologiche degli alimenti Facili, Rapide ed Affidabili. Prof. Giovanni Antonini, MD, PhD

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1 MBS HACCP&ACQUE Easy Test Analisi microbiologiche degli alimenti Facili, Rapide ed Affidabili Prof. Giovanni Antonini, MD, PhD

2 MBS Srl Costituita nel 2007 per lo sviluppo industriale del metodo analitico sviluppato nell Università Roma Tre di cui ha rappresentato il primo spin-off accademico. Il Managment aziendale è rappresentato da: Ing. Alberto Mari Amministratore Delegato Esperto in ingegneria elettronica Collabora allo sviluppo del metodo MBS dal 2003 Sig. Giuseppe Beducci Responsabile Commerciale Sales Specialist Settore Agri-Food Prof. Giovanni Antonini Responsabile Scientifico Professore Ordinario di Biologia Molecolare (Univ. Roma Tre) Inventore del metodo MBS

3 Prodotti MBS: Fiale Monouso Pronte all uso Non necessitano di: Pretrattamento del campione Presenza di un laboratorio Alcun altro reagente La presenza di batteri causa un cambiamento di colore Optional MBS-Multireader Conta automatica dei batteri

4 METODO MBS CONFRONTO I step: inoculo i step I step: omogenizzazione METODO TRADIZIONALE SU PIASTRA Ii II step: diluizioni seriali II step: incubazione III step: IiI step inoculo IV step: IV step incubazione V step: V step lettura dei delle risultati (conta piastre delle CFU sulle piastre) Il file PDF fornisce direttamente il numero dei batteri presenti III step: lettura dei risultati MBS PIASTRA (file PDF) Consumabili 1 vial Attrezzature Lavoro MR 3 step 6 piastre selettive, 6 provette, 1 beuta, pipette, acqua peptonata Omogenizzatore, cappa a flusso laminare, autoclave, termostato 5 step e 10 differenti operazioni

5 PARAGONE TRA I METODI TRADIZIONALE BIOCHIMICI GENETICI IMMUNOLOGICI Caratteristica MBS Selettivo Sensibile Quantitativo Veloce Facile Affidabile Autonomo Automatico +/- +/- +/-

6 REATTIVI SELETTIVI PER : Carica batterica totale Coliformi E. coli (compreso E. coli 0157) Enterobatteriacee Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella spp Listeria spp Lattobacilli Bacillus cereus Enterococcus (Streptococcus) faecalis Sulphite-reducing Clostridia Clostridium perfrigens Funghi (e.g. Aspergillus spp.) Lieviti (e.g. Saccharomyces spp.)

7 VALIDAZIONE: RISULTATI STATISTICI (RISPETTO AL METODO DI RIFERIMENTO DI CONTA SU PIASTRA SECONDO LA ISO13843 E LA ISO16140) Accuratezza Analisi della varianza: Analisi della varianza ad una via: F (1.28) = (limite 1% = 4.17) Analisi della varianza a due vie: F (4.20) = 0264 (limite 1% = 2.87) La accuratezza del metodo colorimetrico MBS è paragonabile a quella ottenuta con il metodo della conta su piastra Stima dell incertezza Analisi statistica della deviazione quadratica media (RDS): metodo della conta su piastra = ; Metodo colorimetrico MBS = La incertezza dell analisi effettuata con il metodo MBS è inferiore a quella effettuata con il metodo della conta su piastra Limiti operativi affidabili Limite inferiore e superiore della corrispondenza fra i due metodi di analisi Il metodo colorimetrico MBS mostra una risposta lineare a concentrazioni batteriche fra 1 X10 6 e <10 CFU/ml

8 GRAFICI PER LA VALIDAZIONE (SECONDO ISO 16140:2003) GRAFICO DI CORRELAZIONE Il grafico mostra una buona correlazione (r=0.977) tra le ore richieste per il cambiamento di colore e la concentrazione di batteri. GRAFICO LINEARITA DELLA RISPOSTA La risposta del metodo MBS è lineare (con pendenza uguale a 1.04, simile a quella teorica di 1.00) su un grande intervallo di concentrazioni ( ). GRAFICO COMPARATIVO Il grafico mette in relazione il risultato ottenuto con il metodo MBS con il risultato ottenuto con il metodo di riferimento, su un grande intervallo di concentrazioni ( ). La linea continua con pendenza = 1.00, rappresenta la perfetta corrispondenza fra i risultati ottenuti con i due metodi.

9 CARATTERISTICHE DEL METODO MBS Nessun altro metodo concorrente possiede contemporaneamente tutte le seguenti caratteristiche: Rapidità: tempi 2 5 volte inferiori ai metodi tradizionali; Semplicità d uso: chiunque e dovunque può effettuare le analisi senza bisogno di altri reattivi o strumentazione; Sensibilità: fino al limite teorico di un solo microrganismo presente nel campione; Selettività: fino al limite sperimentale del % verso altre specie batteriche; Economicità: il costo di ogni singola analisi risulta essere molto inferiore rispetto ai metodi tradizionali che debbono essere effettuati da personale specializzato operante in laboratori di analisi attrezzati con apparecchiature specifiche.

10 Pubblicazioni scientifiche sulla validazione del metodo MBS (scaricabili gratuitamente da AJFT) G. Bottini, F. Losito, A. De Ascentis, F.R. Priolisi, A. Mari and G. Antonini Validation of the Micro Biological Survey Method for Total Viable Count and E. coli in Food Samples American Journal of Food Technology, 6: , 2011 DOI: /ajft F. Losito, G. Bottini, A. De Ascentis, F.R. Priolisi, A. Mari, G. Tarsitani and G. Antonini Qualitative and Quantitative Validation of MBS methods for Listeria spp., Salmonella spp., Enterobactericeae and Staphylococcus aureus in Food Samples American Journal of Food Technology, 7: , 2012 DOI: /ajft

11 STUDIO COMPARATIVO Controllo microbiologico su prodotti carnei ed altre matrici alimentari con il sistema MBS HACCP&ACQUE Easy Test Esperienza del lab. CQ Milano, 3 Ottobre 2013

12 I controlli microbiologici Materie prime: 40 (agar-agar; aromi, spezie, vegetali, miele, vino, oli, etc.) Su 15 di quelle si eseguono analisi microbiologiche (CBT, coli, lieviti e muffe) nel laboratorio interno per ogni lotto in arrivo Materie prime carnee: 7 (carne bovina, pollo, trippa, tonno, etc.) Su tutte si eseguono analisi microbiologiche quali CBT, Coliformi ed E. coli nel laboratorio interno per ogni lotto in arrivo. Es. sulla carne bovina su ca. 100 partite/anno eseguiamo 600 analisi Prodotti finiti: test di sterilità (37 C e 55 C) per tutti i lotti con Dextrose tryptone broth per le colture in aerobiosi e Thioglycollate medium U.S.P. per le colture in anaerobiosi incubazione alle 2 T per 48h Utilities: acque potabili, acque autoclavi, controllo superfici con tamponi per verifica pulizie, acque depuratore (analisi esterna) NO ANALISI DI PATOGENI

13 Analisi microbiologiche della carne: materiali e tempi CAMPIONE Il campione + diluente sterile (acqua peptonata) nella misura di 9 volte il peso di campione introdotto nel sacchetto: diluizione Usiamo diluizioni fino a -4 o -5 a seconda della contaminazione iniziale. Carica batterica totale mesofila aerobia (CBT) REAGENTI Plate Count Medium (Tryptone-Glucose-Yeast-Extract-Agar) (Difco Bacto Plate Count Agar ; Oxoid Plate Count Agar CMB 325 B o altri equivalenti) Petrifilm per conta totale Incubazione a 30 C ±1 C per 72h ± 3h Per l acqua incubazione a 22 C ± 2 C per 72h ± 3h ed a 36 C ± 1 C per 48h ± 3h Terminato tale periodo le petri ed i petrifilm si possono porre in frigorifero per 24/48h Coliformi totali ed E. coli REAGENTI Le Enterobatteriacee si sviluppano a 37 C su Violet Red Bile Agar in 48 ore Petrifilm per E.coli (per determinare sia i coliformi totali che gli E. coli) Petrifilm per Coliformi Incubazione dei petrifilm a 37 C ±1 C per 48h ±3h Terminato tale periodo i petrifilm si possono porre in frigorifero per 24/48h

14 Il sistema MBS MBS-HACCP&ACQUE Easy test è un metodo colorimetrico rapido di analisi microbiologica sviluppato da MBS, in collaborazione con l Università degli Studi Roma Tre, per la rilevazione e conta selettiva dei microrganismi in prodotti agroalimentari solidi o liquidi (anche acque) e su superfici, le cui caratteristiche principali sono: Misurare l attività catalitica di enzimi ossidoreduttasici del metabolismo primario permettendo quindi di stabilire una corrispondenza univoca tra attività enzimatica misurata e carica microbica presente nel campione Permettere una sensibile riduzione dei tempi di analisi, a parità di selettività rispetto alle metodiche tradizionali di riferimento basate sulla replicazione cellulare. Permettere determinazioni quantitative anche su campioni solidi senza ricorrere alla omogeneizzazione o alla determinazione dell MPN (Most Probable Number) Di facile esecuzione

15 L esperienza con il metodo MBS Dall inizio del 2013 il lab. QA sta conducendo test microbiologici in doppio con il metodo MBS e con le metodiche prima esposte per mettere a punto un sistema rapido di risposta microbiologica per le analisi sulla carne (materia prima). E stato acquistato un multilettore automatico a lettura ottica, con software incluso. Riusciamo a analizzare contemporaneamente 8 campioni. Il sistema permette la regolazione automatica della temperatura differenziale per ogni postazione. L incubatore è interfacciato ad un pc (XP, Windows 7). I report, in formato pdf, sono stampabili ed archiviabili anche sul pc ma non è possibile estrarre i dati per una valutazione statistica.

16 L esperienza con il metodo MBS Riduzione dei tempi di risposta: CBT a 30 C: 32h invece di 72h Coliformi a 37 C: 32h invece di 48h E.coli a 44 C: 40h invece di 48h

17 Dati sperimentali Analisi di materie prime vs metodo STD: 45 partite di carne: 135 analisi MBS (CBT, Coliformi totali ed Escherichia coli); 117 analisi (39 CBT, 39 Coliformi totali e 39 Escherichia coli) ovvero l 86.67% con risultato coincidente tra i due metodi; 2 analisi (CBT) ovvero 1.48% con risultato diverso tra i due metodi solo di 1 unità log; 3 analisi (2 CBT e 1 Coliformi) ovvero 2.22% con risultato diverso tra i due metodi di 3 unità log; 1 analisi (CBT) ovvero 0.74% con risultati non determinabili perché petrifilm illegibile mentre MBS dava carica 8000 ufc/g. Non tutte le analisi sono state replicate per i due metodi

18 Altre matrici analizzate Analisi di materie prime paragonate a quelle STD: 4 partite di trippa: 8 analisi MBS (CBT ed Escherichia coli): 3 analisi di E.coli con risultati corrispondenti fra i due metodi; 3 partite di tonno: 9 analisi MBS (CBT, Coliformi totali ed Escherichia coli): 3 analisi corrispondenti e le altre con 1 unità log di differenza tra i due metodi; 1 partita di prosciutto: 2 analisi MBS (CBT, Coliformi totali): 2 analisi corrispondenti tra i due metodi. Su altre matrici quali farine e spezie abbiamo eseguito poche analisi (n 2). Test sulle acque hanno dato buone performance: 12 analisi con risultato coincidente tra i metodi e 2 analisi con la differenza di 1 unità log ma le provette non contengono la quantità di campione richiesta dal metodo ufficiale.

19 Conclusioni I test sulla carne bovina hanno dati buoni risultati per facilità di campionamento, rapidità di risposta ed attendibilità del dato. I risultati (ancora preliminari) di due ring test confermano la concordanza del metodo MBS con i metodi di riferimento. Sono promettenti i risultati ottenuti nei test delle acque. Per le altre materie prime vi è la necessità di aumentare nel 2014 il numero di verifiche prima di poter dare una valutazione conclusiva. L attuale criticità è relativa alla necessità di aumentare il numero di analisi effettuate con il metodo MBS, aumentando il numero dei dispositivi ed utilizzando un nuovo software che permetta di gestire più Multilettori con un singolo PC.

20 Ringraziamo per l attenzione