METODI ALTERNATIVI PER LA VALUTAZIONE DI : IRRITAZIONE OCULARE, IRRITAZIONE CUTANEA E FOTO-TOSSICITA. Marisa Meloni

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1 METODI ALTERNATIVI PER LA VALUTAZIONE DI : IRRITAZIONE OCULARE, IRRITAZIONE CUTANEA E FOTO-TOSSICITA Marisa Meloni

2 CONTESTO NORMATIVO ed utilizzo delle ALTERNATIVES COSMETICO REACH FARMACEUTICO DISPOSITIVI MEDICI IRRITAZIONE CUTANEA e OCULARE FOTO-TOSSICITA Protocolli Parametri Interpretazioni Sistema di Qualità-GLP SITOX 5 GIUGNO 2012

3 CONTESTO NORMATIVO : COSMETICO DIVIETO DI TEST SU ANIMALI - Prodotti cosmetici finiti - Ingredienti nei casi in cui i Metodi Alternativi sono a) convalidati b) previsti dalla legislazione EU DIVIETO DI TEST SU ANIMALI Tutti gli endpoints di Sicurezza per l uomo per i quali sono disponibili Metodi Alternativi DIVIETO DI COMMERCIALIZZARE - Prodotti cosmetici finiti testati su animali - Ingredienti testati su animali nei casi in cui i Metodi Alternativi sono a) convalidati b) previsti dalla legislazione EU Endpoints di Sicurezza per l uomo con l eccezione di Tossicità ripetuta Carcinogenesi Sensibilizzazione Tossicità riproduttiva Tossico-cinetica

4 CONTESTO NORMATIVO : CHIMICO & " Regolamento REACH :1 Giugno 2008 " Innocuità per uomo ed ambiente " Lista di saggi : Allegati VII-X-XI " Concetto di metodi idonei = Suitables " Elaborati sufficientemente bene secondo criteri per lo sviluppo di test riconosciuti a livello internazionale per l immissione di un saggio nel processo di pre-convalida

5 CONTESTO NORMATIVO : FARMACEUTICO " Nessun obbligo Normativo cogente " Esigenza per Hazard identification e Safety " Pre-clinica : in aumento " Articolo 47, DIRETTIVA 2010/63/UE del " La Commissione e gli Stati membri contribuiscono allo sviluppo e alla convalida di approcci alternativi idonei a fornire lo stesso livello, o un livello più alto d informazione di quello ottenuto nelle procedure che usano animali, ma che non prevedano l uso di animali utilizzino un minor numero di animali o che comportino procedure meno dolorose, e prendono tutte le misure che ritengono opportune per incoraggiare la ricerca in questo settore.

6 I metodi alternativi convalidati : dove non sono applicabili

7 METODO ALTERNATIVO Local Lymph Node Assay for skin sensitization (LLNA) LINEA GUIDA (inclusi in Annex V, Direttiva 67/548/EEC) OECD TG 429 (Luglio 2010) CLASSIFICAZIONE SENSIBILIZZANTE H317 (EU CLP) 3T3 NRU phototoxicity test OECD TG 432 (Aprile 2004) SKIN CORROSIVITY TEST EpiSkin TM / EpiDerm TM / Skinethic OECD TG 431 (Aprile 2004 /Novembre 2006/Giugno 2009) Rat TER skin corrosivity test OECD TG 430 (Aprile 2004) SKIN IRRITATION TEST EpiSkin TM / EpiDerm TM / Skinethic In vitro tests for percutaneous absorption OECD TG 439 (Luglio 2010) OECD TG 428 (Aprile 2004) In vitro Genotoxicity Tests OECD TG 471, 473, 476 etc. In Vitro Mammalian Cell Micronucleus test OECD TG 487 (Luglio 2010) FOTOTOSSICO (PIF!5; MPE! 0,1) CORROSIVO R35 e R34 (EU DSD) H314 (EU CLP) CORROSIVO R35 e R34 (EU DSD) H314 (EU CLP) IRRITANTE CUTANEO R38 (EU DSD) H315 (EU CLP) Bilancio di Massa dell attivo 100% ± 10% GENOTOSSICO GENOTOSSICO EU DSD (European Dangerous Substances Directive)

8 SISTEMI DI CLASSIFICAZIONE EU DSD = EUROPEAN DANGEROUS SUBSTANCES DIRECTIVE EU CLP = EUROPEAN REGULATION 1272/2008 for CLASSIFICATION, LABELLING & PACKAGING

9 IRRITAZIONE CUTANEA :OECD TG439 ALTERNATIVA DI SOSTITUZIONE DEL DRAIZE RABBIT TEST: OECD TG404 ACUTE DERMAL IRRITATION

10 DESCRIZIONE OBIETTIVO STATO MODELLO BIOLOGICO ENDPOINT IN VIVO ENDPOINT IN VITRO CAMPO DI APPLICAZIONE IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA Alterazioni reversibili della pelle in seguito ad applicazione acuta Alternativa di sostituzione convalidata OECD 439 EPIDERMIDE RICOSTRUITA (3 diversi protocolli) ALTERAZIONE DELLA FUNZIONE BARRIERA, ROSSORE, EDEMA VITALITA CELLULARE con test MTT TUTTI INGREDIENTI ECCETTO AEROSOL /GAS HAZARD IDENTIFICATION R38 (EU DSD) / H315 (EU CLP)

11 METODO MODELLO BIOLOGICO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA EPISKIN CONTROLLO POSITIVO CONTROLLO NEGATIVO TEMPO DI CONTATTO ENDPOINT IN VITRO SDS 5% con RIDUZIONE 80 % VITALITA DS < 18% PBS 15MIN + 42 H POST INCUBAZIONE VITALITA CELLULARE -MTT TEST MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI) In caso di valori borderline e se 50% IL-1! RILASCIATA < 50 pg/ml (NI)

12 METODO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA MODELLO BIOLOGICO RHE SKINETHIC CONTROLLO POSITIVO SDS 5% CONTROLLO NEGATIVO PROTOCOLLO ENDPOINT IN VITRO PBS 42 min + 42H POST INCUBAZIONE VITALITA CELLULARE- MTT TEST MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)

13 METODO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA MODELLO BIOLOGICO EPIDERM CONTROLLO POSITIVO TRITON 1% CONTROLLO NEGATIVO PROTOCOLLO PBS 60 min + 42H POST INCUBAZIONE ENDPOINT IN VITRO VITALITA CELLULARE MTT - ET 50 MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)

14 3 METODI A CONFRONTO ESAC Replacement of Draize test for skin irritation: Cat2/No cat (EU TM B.46 & OECD TG 439)

15 CORROSIVITA CUTANEA: OECD TG 431 OECD TG 430.

16 DESCRIZIONE CORROSIVITA CUTANEA OBIETTIVO Alterazione irreversibile conseguente all applicazione acuta STATO Alternativa di sostituzione OECD 431 MODELLO BIOLOGICO ENDPOINT IN VIVO ENDPOINT IN VITRO EPIDERMIDE RICOSTRUITA PELLE RATTO Perdita FUNZIONE BARRIERA VITALITA CELLULARE /TEER CAMPO DI APPLICAZIONE INGREDIENTI (specifiche) IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE HAZARD IDENTIFICATION R35 E R34 (EU DSD) / H314 (EU CLP)

17 IRRITAZIONE OCULARE TG OECD 405 IN VIVO DRAIZE TEST (RABBIT) Eye irritation: is the production of changes in the eye following the application of a test substance to the anterior surface of the eye, which are fully reversible within 21 days of application. EU classification: NI = non-irritant R36 (EU DSD)/ CAT 2 (EU CLP) = irritating to eyes R41 (EU DSD)/ CAT 1 (EU CLP) = risk of serious damage to eyes

18 Replacement Alternatives: ESAC statement April 2007 and ICCVAM retrospective validation Classification!"!Severe (R41)/ Irritants (R36)!! BCOP : BOVINE CORNEAL OPACITY and PERMEABILITY ICE : ISOLATED CHICKEN EYE!&

19 Irritazione oculare BCOP ed IRE applicabili solo per classificazione R41: distinzione tra fortemente irritanti ed irritanti Pre-convalida su Human Corneal Epithelium sponsorizzata da Colipa per discriminare tra irritanti e non irritanti (dal 2008).

20 IRRITAZIONE OCULARE :HCE MODEL

21 METODO MODELLO BIOLOGICO CONTROLLO POSITIVO IRRITAZIONE OCULARE HCE HUMAN CORNEAL EPITHELIUM COLIPA ECVAM PRE-VALIDATION ETANOLO CONTROLLO NEGATIVO SOLUZIONE SALINA PROTOCOLLO 1H +16H POST INCUBAZIONE ENDPOINT IN VITRO VITALITA CELLULARE MODELLO PREDITTIVO >50% NON IRRITANTE

22 FOTOTOSSICITA : OECD 432

23 DESCRIZIONE OBIETTIVO FOTOTOSSICITA 3T3 NRU Identificare composti foto-tossici in seguito ad esposizione a una dose non citotossica di radiazione UVA: 5J /cm 2 STATO Alternativa di sostituzione OECD 432 MODELLO BIOLOGICO ENDPOINT IN VITRO CAMPO DI APPLICAZIONE IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE BALB 3T3 - fibroblasti murini Vitalità cellulare tramite Neutral Red Uptake SOSTANZE CHIMICHE IDROSOLUBILI O OPPORTUNAMENTE SOLUBILIZZATE Potenziale fototossico: PIF >2 (Photo Irritation Factor)

24 PROCEDURA

25 Confronta l effetto di una sostanza in presenza ed in assenza di UVA AD UNA SINGOLA CONCENTRAZIONE quella che determina citotossicità nel 50% delle cellule = EC 50. PIF = EC50 ( UVA) / EC50 (+UVA) SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO: PIF = > 5.0 SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO: PIF > 2.0 e < 5.0 CONTROLLO POSITIVO: CLORPROMAZINA - PIF > 6

26 SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO MPE > SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO MPE > e < SOSTANZA NON FOTOSSICA MPE < 0,1 Tale modello sopperisce ai limiti del modello PIF nei casi in cui sia impossibile ottenere una EC50. Il modello utilizza il Mean Photo Effect (MPE), una misura basata sul confronto delle curve complete concentrazione-risposta. = MAGGIORE SENSIBILITA Per l applicazione di tale modello si utilizza il Photo Prediction software versione 2.0* *(Holzhutter, 2002) In Vitro Phototoxicity Testing: Development and Validation of a New Concentration Response Analysis Software and Biostatistical Analyses Related to the Use of Various Prediction Models"

27 LIMITI DEL METODO OECD 432 OECD TG 432 : 3T3BALB NRU-PHOTOTOXICITY ASSAY su monostrato di fibroblasti murini ha alcune riconosciute non è adatto a valutare concentrazioni superiori a 1000 µg /ml non è adatto a valutare miscele complesse di ingredienti o formulazioni a causa della loro non solubilità nel mezzo acquoso che porterebbe ad artefatti e/ o precipitazione della sostanza e quindi risultati non attendibili è un sistema biologico eccessivamente semplificato rispetto alla complessità della reazione fototossica epidermica e non permette di tenere conto della distribuzione ed assorbimento della sostanza applicata topicamente. La linea guida OECD TG 432 indica chiaramente che : in casi di risultati di potenziale fototossico discordanti ed in generale per la valutazione di prodotti finiti sia necessario confermare il dato ottenuto con il 3T3-NRU utilizzando un modello biologico diverso.

28 FOTOTOSSICITA Il metodo Episkin Phototoxicity Assay utilizza epidermide umana ricostruita in vitro Medina et al.2001 : Assessment of the Phototoxic Potential of Compounds and Finished Topical Products Using a Human Reconstructed Epidermis In vitro molecular toxicology, vol 14 N 3 Liebsch et al : 2005 Alternative Methods for Cosmetic testing ( Editors Chantra Esckes and Valerie Zuang ) chapter 3.8 Uv-induced effects ATLA 33 Suppl Lelievre et al Toxicology in vitro The Episkin phototoxicity assay (EPA): Development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency Una riduzione della vitalità cellulare > 25% nei tessuti irradiati classifica il prodotto come foto-tossico.

29 GLP LA COMPLIANCE GLP E SEMPRE RICHIESTA QUANDO IL METODO ALTERNATIVO CONVALIDATO O IN CORSO DI CONVALIDA VENGA UTILIZZATO IN STUDI PER LA CLASSIFICAZIONE REGOLATORIA O PER LA REGISTRAZIONE

30 IMPLEMENTAZIONE DELLE OECD TG Organization for Economic Cooperation and Development 1. INTRODUCTION 2. INITIAL CONSIDERATIONS 3. PRINCIPLE OF THE TEST METHOD 4. DESCRIPTION OF THE METHOD 5. PROCEDURE 6. DATA AND REPORTING 7. LITERATURE 8. DEFINITIONS IMPLEMENTAZIONE LINEE GUIDA NEL CENTRO DI SAGGIO > SOP

31 PROCEDURE OPERATIVE STANDARD DIREZIONE DEL CENTRO DI SAGGIO ESPERIENZA AZIENDALE Aggiornamento continuo Capitalizzare esperienza aziendale Creazione di competenze e responsabilità Ruolo del QA: - integrità dei dati - compliance TECNICI SOP Strumento di training Standardizzazione Monitoraggio CN e CP Tracciabilità degli studi Successo della convalida interna

32 I metodi alternativi anche nella Ricerca QUID MENSURA MENSURATUR UT QUOD NON MENSURATUR Galileo Galilei, Misura quello che è misurabile e rendi misurabile ciò che non lo è

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