Valutazione della esposizione della popolazione italiana alla ocratossina A nel cacao e nel cioccolato. Carlo Brera

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1 3 Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica Valutazione della esposizione della popolazione italiana alla ocratossina A nel cacao e nel cioccolato Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Reparto OGM e Micotossine ISS, Roma settembre 2009

2 Presupposti Richiesta di parere da parte del Ministero della Salute (19 maggio 2007) Orientamenti comunitari Legislazione nazionale

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4 Il bivio Garantire la sicurezza del consumatore Consentire gli scambi commerciali

5 Attività intraprese Sviluppo di un progetto di ricerca in collaborazione con l AIDI per la valutazione della esposizione del consumatore italiano alla OTA derivante dal consumo di cacao e cioccolato

6 Cacao OTA Da un punto di vista sanitario era necessario un aggiornamento della valutazione del rischio Da un punto di vista commerciale era in essere una situazione anomala in quanto l Italia era l unico Paese ad avere dei limiti massimi tollerabili

7 1. Ricognizione delle tipologie di campioni da sottoporre a valutazione. Per questa fase si è adottato il criterio di selezionare le matrici da sottoporre ad analisi così come descritte dal D. Lgs. n.178 del 12 giugno 2003 che riporta la classificazione delle denominazioni dei prodotti. Sulla base di una rilevazione delle quote di mercato corrispondenti ai prodotti sopracitati e considerando quei prodotti per i quali è possibile poter disporre di un dato di consumo, si è ritenuto di prendere in considerazione i prodotti di cui ai punti 2, 3, 4, 7, 10 dell allegato I del D. Lgs. indicato.

8 2. Individuazione dei punti vendita Al fine di garantire la massima rappresentatività dei campioni da sottoporre ad analisi si è adottato il criterio di campionare i prodotti indicati nella fase 1 in punti vendita della Grande Distribuzione. I punti vendita interessati sono stati sei, selezionati nelle regioni Lazio e Lombardia.

9 3. Analisi dei campioni I campioni prelevati (N= 300) sono stati analizzati per il loro livello in OTA sulla base di un metodo di analisi precedentemente pubblicato. (Brera et al. Journal of liquid chromatography and related technologies. 2003; 26(4):

10 4. Stima dei consumi Al fine di effettuare una stima della esposizione del consumatore si è reso necessario acquisire i dati di consumo ricavandoli o da fonti ufficiali o da altre fonti purchè ritenute attendibili. Non essendo attualmente disponibile una fonte di dati ufficiali aggiornata si è ricorsi ai dati forniti da una Società privata, la GfK-IHA Italia (2005). Dai dati forniti, si rileva che per i campioni presi in considerazione nello studio, i consumi medi annui oscillano tra i 100 grammi ed i 500 grammi a seconda della tipologia del prodotto e del gruppo di consumatori. Dall esame dei dati si evince inoltre che per la categoria tavolette, quelle al latte sono maggiormente consumate dai bambini di età compresa tra 0 e 10 anni mentre le tavolette fondenti dagli adulti di età maggiore di 19 anni; relativamente alle zone geografiche, il Centro Italia è l area in cui si registrano i maggiori consumi.

11 Stima dell esposizione Dalla correlazione tra dati di consumo e dati di contaminazione si rileva che l esposizione media del consumatore oscilla, per categoria di prodotto, tra i valori riportati nella tabella di seguito riportata Assunzione = Concentrazione media (ug/kg) x Consumo medio (g) Peso corporeo (kg)

12 Prodotto Livello medio di contaminazione (A) (ug/kg) Età (anni) Consumo medio annuo nazionale procapite (grammi) (B) Assunzione media settimanale (ng/kg pc/sett) AxB/PCx365 Tavolette al latte ,7 235, , >19 241, Tavolette fondenti ,8 138, , >19 244, Cioccolatini , , , >19 335, Uova Pasquali ,5 309,4 232, % >19 296, PC= peso corporeo; bambini 0-10 anni, 25 kg adolescenti anni, 45 kg, adolescenti anni, 60 kg, adulti 65 kg

13 MATRICE: CACAO IN POLVERE E CIOCCOLATO VALIDAZIONE: INTERNA ESTRAZIONE: Pesare 5 g di campione in una beuta con tappo a smeriglio da 250 ml, aggiungere 100 ml di una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio(0.1%) e PEG (0.3%). Applicare del parafilm sull imboccatura tappo-collo della beuta e miscelare con agitatore a braccia per minuti. Filtrare l estratto attraverso carta da filtro.pralevare 20 ml di filtrato e diluire con 20 ml di PBS. Applicare il campione diluito alla colonna di immunoaffinita. CLEAN- UP: Le colonnine di immunoaffinita OCHRAPREP (IAC- R-Biopharm Rhone) devono essere portate a temperatura ambiente prima del condizionamento. Condizionare la colonnina con 5 ml di PBS ad una velocita di 2-3ml/min.Passare in colonnina ad un flusso di 1-2 gocce/ secondo, 30 ml dell esratto.lavare la colonna di immunoaffinita con 10 ml di PBS e successivamente con 10 ml di acqua deionizzata ad un flusso di 1-2 gocce/secondo.passare aria nella IAC in modo da eliminare l acqua residua. Eluire l OTA seguendo una procedura in due fasi: 1. Applicare 0.50 ml di metanolo sulla colonna e lasciare fluire per gravita. 2. Aspettare 1 minuto ed applicare una seconda porzione di 0.75 ml di metanolo. Passare aria attraverso le colonnine per raccogliere il solvente residuo. Aggiungere 0.50 ml di acqua bidistillata, miscelare tramite Vortex e conservare il campione a 4 C. ELISA Competititvo P24 CONDIZIONI STRUMENTALI Determinazione in HPLC con rivelazione spettrofluorimetrica. Colonna : C18 in fase inversa mm, 4µm,( phenomenex), termostatata a 40 C. Fase mobile: acqua acidulata al 2% con acido acetico: acetonitrile: metanolo( 40:35:40). Flusso (in colonna) : 1.0 ml/min Rivelazione in fluorescenza, λ emissione: 460 nm λ eccitazione: 333nm Volume di iniezione: 150 µl.

14 Risultati La percentuale di campioni positivi è risultata essere pari al 30%. La concentrazione media di OTA nei campioni di cioccolato (N=260) è risultata pari a 0,18 µg/kg mentre quella derivante dai soli campioni che hanno mostrato un livello di contaminazione superiore al limite di quantificazione (0,08 µg/kg) è risultata pari a 0,37 µg/kg con un valore massimo di 0.74 µg/kg. Si ricorda che il limite massimo tollerabile previsto dalla Circolare del Ministero della Salute n. 10 del 9 giugno 1999 è pari a 0,50 µg/kg. Per quanto concerne i campioni di cacao in polvere (N=40) tutti i campioni sono risultati positivi, ma i livelli di contaminazione media sono risultati pari a 0,55 µg/kg, con un valore massimo di 1.82 µg/kg, risultando pertanto ampiamente al di sotto del limite massimo tollerabile, fissato dalla Circolare a 2,0 µg/kg. Sulla base di questo studio di monitoraggio nessuno dei 300 campioni esaminati ha mostrato livelli di contaminazione superiori a quelli previsti dalla normativa vigente.

15 Conclusioni - I Sulla base dei valori relativi alla assunzione giornaliera, si possono trarre le seguenti considerazioni. Con riferimento al recente valore di dose tollerabile giornaliera, così come fissata nell aprile 2006 dal parere dell EFSA (17 ng/kg pc/giorno) risulta che i valori di assunzione media rappresentano nel caso peggiore (uova pasquali) lo 0.08% della nuova TDI. Considerando il 99%ile, che di fatto corrisponde ad un livello di contaminazione (0,52 ug/kg) sovrapponibile al limite di legge (0,5 ug/kg), si ha un contributo alla esposizione da parte del cioccolato pari allo 0.2% della TDI. Per il cacao in polvere, sulla base del livello di contaminazione medio (0,55 ug/kg) (valore massimo 1.82 ug/kg) ottenuto sui 40 campioni analizzati e del consumo stimato a 72 g annuo pro-capite si ottiene un contributo che oscilla tra lo 0,01% e lo 0,02% della TDI a seconda della fascia di consumatori presi in esame. Inoltre, applicando il valore di legge (2,0 ug/kg) si ha un contributo pari allo 0,035% ed allo 0,09% della TDI per gli adulti ed i bambini tra 0 e 10 anni, rispettivamente. In generale, dallo studio è risultato che la categoria di consumatori maggiormente esposta è risultata quella dei bambini da 0 a 10 anni, anche se a livelli di molto inferiori alla TDI.

16 Conclusioni - II In conclusione lo studio effettuato costituisce il necessario aggiornamento delle conoscenze sul livello di esposizione per i prodotti in esame, rispetto a quelle prese in considerazione per l emanazione della circolare del Tale aggiornamento risulta particolarmente rilevante anche alla luce dei cambiamenti verificatisi negli ultimi anni, quali la revisione della TDI da parte dell EFSA, l affinamento dei metodi di analisi e la sensibilizzazione dei produttori al problema della OTA. Sulla base della valutazione del rischio effettuata da questo Istituto mediante lo studio riportato si può concludere che, per quanto riguarda l esposizione alla OTA, NON sussistono rischi per la salute del consumatore italiano derivante dal consumo di prodotti a base di cacao e cioccolato. Pertanto, i dati derivanti dallo studio sono attualmente al vaglio del Consiglio Superiore della Sanità al fine di orientare la gestione del rischio da OTA nei prodotti di cui trattasi ed in particolare per valutare l opportunità di allinearsi con la posizione comunitaria secondo cui non è previsto alcun limite di legge per gli stessi prodotti.