ETANOLO (ALCOOL ETILICO) SIERICO E/O PLASMATICO in UV Codice Z05810

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1 ETANOLO (ALCOOL ETILICO) SIERICO E/O PLASMATICO in UV Codice Z05810 BIOCHIMICA E METABOLISMO L alcol etilico è un alcool alifatico di PM=46,07. Di solito viene assunto per via orale ed assorbito rapidamente da stomaco, piccolo intestino e colon. Il tempo necessario per completare il processo di assorbimento varia da 2 a 6 ore, in funzione di fattori quali la presenza di cibo e di altri liquidi, il tempo impiegato per l ingestione della bevanda, la variabilità biologica fra individui. L alcol, vista la solubilità in acqua ed il basso peso molecolare, appena assorbito si distribuisce rapidamente in tutti i tessuti e fluidi dell organismo, superando anche la barriera encefalica e quella placentare. L andamento della concentrazione di alcol in alcuni liquidi biologici è stato determinato sperimentalmente da vari autori, anche recentemente (Fig. 1). I risultati mostrano che la massima concentrazione plasmatica viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall assunzione e che saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell alcolemia, mentre nelle urine si raggiunge la massima concentrazione dopo circa due ore dall assunzione. Fig. 1. Alcol etilico: concentrazione nei liquidi biologici Dopo l assorbimento, l Etanolo viene prevalentemente metabolizzato (90-98 %) per via ossidativa, ad una velocità direttamente proporzionale al peso corporeo e costante nel tempo. La prima reazione di ossidazione avviene nel fegato, per azione dell enzima Alcol Deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di Idrogeno con produzione di Acetaldeide; questa viene successivamente ossidata ad Acido acetico, per azione dell enzima Aldeide Deidrogenasi. La cinetica di eliminazione non ha un andamento esponenziale, come la maggior parte delle sostanze esogene, ma pseudolineare; dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione, quando la concentrazione raggiunge il valore massimo C 0, la relazione fra concentrazione ematica C t e tempo t, è data dall equazione: C t = C 0 - kt, con k compresa fra 10 e 25 mg/dl/h (Fig.2). Fig.2. Urine ed aria espirata rappresentano anche le principali vie di eliminazione dell alcol e dei suoi prodotti di ossidazione. La cinetica d eliminazione, complessivamente regolata dall equazione di Michaelis Menten, assume tuttavia un andamento pseudolineare dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione. 1

2 L escrezione di alcol non modificato, di solito, interessa il 2% della quantità assunta ed avviene prevalentemente attraverso reni e polmoni, anche se piccole quantità si ritrovano anche nella saliva ed in altri liquidi organici; può salire fino al 10 % in caso di ingestione massiva. La concentrazione urinaria è di poco superiore a quella ematica; quella alveolare è circa lo 0,05%. La concentrazione nel plasma è superiore a quella del sangue intero di circa il 10%. INTOSSICAZIONE ACUTA L assunzione eccessiva di alcol provoca, in tempi rapidi, situazioni cliniche di varia gravità che possono richiedere l intervento del medico del Pronto Soccorso, sia per gli effetti diretti dell ebbrezza sia per quelli indiretti (incidenti stradali). In tali casi il medico si può rivolgere al Laboratorio con vari obiettivi: - accertare una possibile causa di coma, in paziente senza trauma cranico; - accertare la causa di coma in paziente con trauma cranico (per es. a seguito di incidente stradale); - diagnosticare uno stato di ebbrezza in paziente con sintomatologia dubbia. Esiste, ed ormai è largamente accettata, una relazione tra l alcolemia (Blood Alcool Concentration - BAC) e l ebbrezza di una persona. Ricordiamo soltanto che la Legislazione Italiana non considera reato il consumo di alcol, a meno che il bevitore non debba porsi alla guida di un autoveicolo (Legge 1 Agosto 2003, n Art. 186). Il sospetto di tale reato autorizza gli organi di polizia stradale ad effettuare l accertamento di alterazione psico-fisica dovuta all alcol; accertamento che deve essere effettuato con strumenti e procedure determinati dal regolamento (DPR 16 Dicembre 1992, n Art. 379). Le procedure degli esami dell alcolemia sono dettate dall articolo n 186 del Codice della Strada. Il livello di concentrazione ematica di etanolo a partire dal quale viene dichiarato lo stato di ebbrezza è stato fissato, in Italia, a 0,5 g/l. CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC Il presente metodo determina le concentrazioni sieriche e/o plasmatiche dell Etanolo derivatizzandolo e leggendolo in HPLC a λ=385 nm. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 005 Etanolo sierico in UV Febbraio

3 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Il campione viene diluito e trattato a 40 C per 30 minuti. Dopo raffreddamento, viene aggiunto il deproteinizzante e al surnatante viene aggiunto il derivatizzante. La soluzione viene posta a 70 C per 15 minuti. Dopo raffreddamento la soluzione viene diluita e iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : < 0,02 g/l Range dinamico del metodo : 0,02-3,16 g/l Valori di riferimento del tasso alcolemico: Rif. Articolo n 186 del Codice della Strada: Guida in stato di ebrezza Valore eccedente gli 0,5 g/l e non superiore agli 0,8 g/l: ammenda da 500,00 a 2.000,00 euro e arresto fino a un mese - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 3 a 6 mesi; valore eccedente gli 0,8 g/l e non superiore a 1,5 g/l: ammenda da 800,00 a 3.200,00 euro e arresto fino a tre mesi - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 6 mesi ad 1 anno; Valore superiore a 1,5 g/l: ammenda da 1.500,00 a 6.000,00 euro e arresto fino a 6 mesi - sanzione amministrativa accessoria della sospensione della patente da 1 a 2 anni. Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 20 ml Reagente B Reagente B, 1 x 5 ml Reagente C - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml Reagente D - Soluzione Deproteinizzante, 1 x 10 ml Reagente E - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml Reagente F - Soluzione Test/Std Chimico, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente G - Soluzione Diluente, 1 x 100 ml Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 o 100 µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=385 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore Computer e software gestionale Modalità per il prelievo ematico : Non devono essere usati disinfettanti alcolici. Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con K 3 EDTA+NaF come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a 20 C. Stabile 4 settimane. La provetta deve essere conservata ben tappata. 3

4 PROCEDURA PREANALITICA Diluizione della Soluzione Test 3,16 g/l In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare : 800 µl di H 2 O di grado HPLC 200 µl di Reagente F Soluzione Test In una provetta da 1,5 ml con tappo pipettare nell ordine: 200 µl di Reagente A - Sol. Tampone 1 50 µl di Reagente B 50 µl di Sol. Test precedentemente diluita Incubare a 40 C per 30 minuti Aggiungere nell ordine: 100 µl di Reagente C Sol. Tampone µl di Reagente D Sol. Deproteinizzante 100 µl di Reagente E Sol. Derivatizzante Al vortex per 10 secondi Raffreddare Incubare a 70 C per 15 minuti Al vortex per 10 secondi Raffreddare e agitare al vortex per 10 secondi Trasferire 100 µl del derivatizzato in una provetta e aggiungere 900 µl del Reagente G - Soluzione Diluente. Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 3. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Release N 005 Etanolo sierico in UV Febbraio

5 PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Diluizione dei Campioni, del Calibratore e degli eventuali Controlli Campione Standard di Controllo calibrazione Acqua di grado HPLC 800 µl 800 µl 800 µl Campione 200 µl Reagente F Std di Calibrazione 200 µl Controllo 200 µl IMPORTANTE : La soluzione standard di calibrazione va preparata di volta in volta FASE 2 : Preparazione dei Campioni, del Calibratore e dei Controlli Dispensare in provette da 1,5 ml con tappo: Bianco Campione Standard Controllo Reagente A Sol. Tampone µl 200 µl 200 µl 200 µl Reagente B 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Acqua di grado HPLC 50 µl Campione 50 µl Standard chimico 50 µl Controllo 50 µl Al vortex per 10 secondi FASE 3 : Porre la serie di provette a 40 C per 30 minuti Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi FASE 4 : Procedura di deproteinizzazione Aggiungere in ciascuna provetta nell ordine: 100 µl di Reagente C Sol. Tampone µl di Reagente D Sol. Deproteinizzante Agitare vortex per 10 secondi e centrifugare a 5000 rpm per 5 minuti FASE 5 : Trasferire 400 µl di surnatante in provette da 1,5 ml con tappo e aggiungere: 100 µl di Reagente E Sol. Derivatizzante FASE 6 : Porre la serie di provette in stufa a 70 C per 15 minuti Release N 005 Etanolo sierico in UV Febbraio

6 Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi FASE 7 : Procedura di diluizione In una provetta idonea pipettare nell ordine: 900 µl di Reagente G Sol. Diluente 100 µl di campione precedentemente derivatizzato. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 005 Etanolo sierico in UV Febbraio

7 ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO - Avvertenze REAGENTE F : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST Etanolo 3,16 g/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 385 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ), è tassativo l uso del Metaguard Guard Column, cod. ZA600MG (1 x 3 pz) e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ). Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl o 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 80 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7 o 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z05820 Standard chimico per Etanolo sierico e/o plasmatico 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 7

8 ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 : Soluzione Test Fig. 4 : Campione di plasma di soggetto sobrio R.T Etanolo 3,16 g/l 8

9 ETANOLO SIERICO E/O PLASMATICO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 5 : Campione di plasma di medio bevitore Fig. 6 : Campione di plasma di forte bevitore R.T Etanolo 0,79 g/l R.T Etanolo 3,16 g/l 9

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