INFINITI HPV-QUAD Metodica

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1 INFINITI HPV-QUAD Metodica Per Uso Diagnostico In Vitro Solo per l'esportazione Prodotto da AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA Rappresentante EU Autorizzato: BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Svizzera 1 su 9

2 USO INFINITI HPV-QUAD rileva la presenza di 13 genotipi di HPV ad alto rischio e 2 a basso rischio in donne con Pap test anomalo (i.e. cellule squamose atipiche di significato incerto, ASCUS). Inoltre, INFINITI HPV-QUAD identifica il genotipo dei 5 ceppi ad alto rischio 16, 18, 31, 33 e 45. Le informazioni ottenute da INFINITI HPV-QUAD, insieme al referto citologico, alla valutazione di altri fattori di rischio e alla storia clinica, possono essere utilizzate nella gestione della paziente. I risultati ottenuti con INFINITI HPV QUAD non sostituiscono la colposcopia. INFINITI HPV QUAD è un test qualitativo da eseguirsi in laboratori clinici dietro richiesta del medico curante. INFORMAZIONI GENERALI L infezione genitale da HPV è causata dal papilloma virus umano (HPV), un gruppo di virus che include più di 100 differenti ceppi o tipi. Più del 30% di questi virus sono trasmessi sessualmente e possono infettare i genitali di uomini e donne. Almeno il 50% degli uomini e delle donne sessualmente attivi contraggono prima o poi l infezione genitale da HPV. All età di 50 anni, almeno l 80% delle donne avranno contratto l infezione genitale da HPV. Circa 6,2 milioni di Americani contraggono ogni anno una nuova infezione genitale da HPV. (1) Il papilloma virus umano è composto da una particella virale icosaedrica (virione) contenente molecole di DNA circolare a doppia elica di 8000 paia di basi, circondate da un capside proteico. A seguito dell infezione delle cellule epiteliali, il DNA virale invade l intero spessore dell epitelio, con i virioni intatti solo negli strati più superficiali del tessuto. Secondo il tipo e il grado della lesione, il DNA virale può essere trovato sia nei virioni sia come sequenza di HPV episomiale o integrato. (9,10,11,12) Studi epidemiologici dimostrano che l infezione persistente con alcuni tipi di papilloma virus umano (HPV) è un fattore di rischio necessario per lo sviluppo del carcinoma cervicale invasivo. Sulla base di questi studi, sono stati definiti gruppi di HPV genitale ad alto e a basso rischio, secondo il loro potenziale di indurre un carcinoma invasivo. Si definiscono HPV ad alto rischio quelli associati con neoplasia cervicale intraepiteliale (CIN 2/3), ritenuti responsabili del 70% circa di tutti i carcinomi cervicali invasivi, sebbene la relazione tipo HPV/rischio carcinoma cervicale varia secondo le zone geografiche. (2,3) In Nord America, circa il 90% sono associati con un rischio elevato con i tipi 16, 18, 31, 33 e 45, Oltre al cancro cervicale, i tipi di HPV ad alto rischio possono essere responsabili di carcinoma alla vulva, vagina ed ano. La presenza di determinati genotipi di HPV nel tratto genitale femminile è anche associata con altre patologie, inclusa la papulosi di Bowenoid e neoplasie intraepiteliali di cervice, vagina e vulva. I genotipi HPV a basso rischio 6 e 11 possono essere associati con la presenza di condilomi genitali ma sono stati collegati raramente con lesioni cervicali cancerose o precancerose. (4,5,6,7) Non sono completamente chiariti i meccanismi di evoluzione da infezione HPV a carcinoma. PRINCIPIO DEL TEST INFINITI HPV QUAD utilizza la tecnologia del BioFilmChip microarray brevettata da AutoGenomics combinata a processi di automazione, gestione dei reattivi ed elaborazione software per la rilevazione multiplex dei genotipi HPV eventualmente presenti nel DNA ottenuto da tampone cervicale. 2 su 9

3 INFINITI HPV-QUAD è basato su cinque processi principali: (a) Amplificazione mediante Polymerase Chain Reaction del DNA purificato (b) Estensione del primer analita specifico con incorporazione del marcato (ASPE) (c) Ibridazione del primer esteso e fluorescente su un microarray (d) Scansione del microarray (e) Rilevazione del segnale (identificazione dei genotipi HPV) I punti da (c) a (f) sono automatizzati mediante l analizzatore INFINITI. Di seguito la procedura schematizzata del test. DESCRIZIONE DEL DISPOSITIVO INFINITI HPV-QUAD è un dispositivo diagnostico in vitro costituito da reagenti e strumentazione per rilevare la presenza di genotipi HPV, 13 ad alto rischio (genotipi 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, e 68) e 2 a basso rischio (genotipo 6 e 11) in campioni cervicali. Inoltre, INFINITI HPV-QUAD identifica il genotipo dei 5 ceppi ad alto rischio 16, 18, 13, 33 e 45. Tipi di campioni cervicali raccomandati Campioni raccolti tramite dispositivo broom type e conservati in Cytyc ThinPrep Pap Test PreserveCyt Solution. INFINITI HPV-QUAD comprende Amplification Mix, BioFilmChip Microarray, Modulo Reagenti Intellipac e ed è automatizzato con l Analizzatore INFINITI - Software Operativo Qmatic. L analizzatore INFINITI è marcato CE. Il BioFilmChip Microarray è formato da una pellicola di poliestere coattata con componenti multi-strato brevettati per ottimizzare l analisi del DNA. Gli strati sono stati progettati per fornire una superficie versatile che aumenti le prestazioni del test. INFINITI HPV QUAD utilizza un microarray con probe di cattura spottati alla superficie del BioFilmChip. Su un microarray possono essere testati 4 campioni. In un magazine sono contenuti 12 microarray. Il Modulo Reagenti Intellipac contiene quattro scomparti che alloggiano i reagenti del test. Il Modulo Reagenti Intellipac ha un chip di memoria integrato; le informazioni sui reagenti quali numero di lotto, data di scadenza, volumi sono archiviate nel chip di memoria e evidenziate quando si compila la lista di lavoro. Ogni Modulo Reagenti Intellipac contiene reagenti per 96 campioni. Il PCR Amplification Mix contiene i reagenti necessari per Amplification Mix contiene 4 flaconi con 500 µl di reattivo. la PCR. Ogni confezione di PCR 3 su 9

4 L Analizzatore INFINITI automatizza il test INFINITI HPV QUAD integrando tutti i singoli processi di gestione dei campioni (PCR amplicon), dei reagenti, l ibridazione, la rilevazione e l analisi dei risultati. I test sono processati automaticamente e gli spot vengono letti dal microscopio confocale interno. I risultati sono analizzati e presentati come positivi o negativi per la presenza di genotipi HPV; è fornita inoltre l identificazione specifica per i tipi ad alto rischio 16, 18, 31, 33 e 45. Per l utilizzo dell Analizzatore INFINITI far riferimento al Manuale dell Operatore fornito con lo strumento. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Requisiti Ad uso diagnostico in vitro. Da utilizzarsi solo a cura di personale di laboratorio qualificato. Questo test deve essere utilizzato solo per campioni cervicali raccolti in soluzione Cytyc ThinPrep Pap Test PreserveCyt. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni crociate, la preparazione del campione, il set up della reazione di PCR e l analisi del prodotto della PCR dovrebbero essere effettuate seguendo linee guida approvate come le CLSI (Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Tutti i campioni dei pazienti sono da considerarsi potenzialmente pericolosi. Prestare attenzione nel trattamento di materiali di origine umana. Nessun metodo può garantire l assenza di HCV, HIV o di altri agenti infettivi. Seguire le Linee Guida CLSI (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3-A). Non costituire pool o miscele di reagenti di lotti diversi. Non usare kit o reagenti oltre la data di scadenza. Conservare kit e reagenti secondo quanto riportato sull etichetta del prodotto. Procedure di Laboratorio Seguire le normali procedure per il trattamento dei reagenti di laboratorio. Seguire le norme di sicurezza del laboratorio: non pipettare con la bocca; indossare indumenti protettivi (ad es., guanti monouso, camici da laboratorio) e protezioni oculari; non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio; lavare le mani accuratamente dopo aver manipolato campioni e reagenti. Manipolazione dei Rifiuti Smaltire reagenti non usati, campioni e rifiuti secondo quanto previsto dalla vigente normativa nazionale. Le Schede di Sicurezza (Material Safety Data Sheets) sono disponibili presso il Customer Service Medical Systems S.p.A. Preparazione dei Campioni Fare riferimento alle istruzioni di sicurezza riportate nella metodica fornita con il kit per l estrazione del DNA. Il prodotto ottenuto dalla PCR non può essere conservato prima di essere caricato nell Analizzatore INFINITI. Usare immediatamente. Analizzatore INFINITI Leggere il Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI prima di utilizzare lo strumento. Fare particolare attenzione alle Note. Seguire le indicazioni relative a Avvertenze e Precauzioni di Sicurezza contenute nel Manuale dell Operatore. Fare riferimento alla Sezione Requisiti di Installazione per l installazione dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Errori quando si riscontrano errori durante l operatività dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Help quando si riscontrano problemi. 4 su 9

5 CONSERVAZIONE/STABILITA BioFilmChip Microarray: Reagente Intellipac: Mix di Amplificazione: 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) Nota: Non usare il Reagente Intellipac oltre quattro settimane dall apertura. 18 mesi dalla data di produzione, congelato (da -30 C a -15 C) Nota: la data di scadenza per ogni singola confezione è stampata sull etichetta RACCOLTA CAMPIONE E STABILITA Per l analisi con INFINITI HPV-QUAD si consiglia di utilizzare campioni cervicali raccolti in ThinPrep (Cytyc Corp.). Campioni raccolti con altri dispositivi o conservati con altri tamponi non sono stati verificati con questo kit. Non è nota l attendibilità del test INFINITI HPV QUAD utilizzando altri tipi di campioni e dispositivi di raccolta. I campioni utilizzati per i vetrini ThinPrep Pap Test dovrebbero essere raccolti con un dispositivo broom-type e messi in Cytyc PreservCyt Fluid. Seguendo questa procedura, i campioni possono essere conservati a temperatura compresa fra 4 e 37 C fino a 3 settimane dal prelievo prima di essere testati con INFINITI HPV QUAD. I campioni PreservCyt Solution non possono essere congelati. MATERIALI FORNITI (SUFFICIENTI PER 192 TEST) AutoGenomics Codice HPV-Q Magazine BioFilmChip Microarray AutoGenomics Codice HPV-Q Intellipac Reagent Module: 96 test per modulo, contenente: dntps Cy5-dCTP Primer analita-specifico Tampone di estensione AutoGenomics Codice HPV-Q Amp Mix: 4 fiali da 500µl di master mix PCR contenente: dntps Multiplex Primer Mix MgCl2 Tampone di reazione Autogenomics Codice Solutione BF2 (Tampone di Ibridazione): 6 flaconi da 30ml. Il buffer di ibridazione è composto da: SSC Sodio Azide Preservativo 0.08% EDTA 10X Blocking Buffer AutoGenomics Codice Solutione BF1 (Tampone di Lavaggio) AutoGenomics Codice HPV Type 16 DNA Template Control AutoGenomics Codice HPV Type 18 DNA Template Control AutoGenomics Codice HPV Type 31 DNA Template Control AutoGenomics Codice HPV Type 33 DNA Template Control AutoGenomics Codice HPV Type 45 DNA Template Control REAGENTI NECESSARI MA NON FORNITI Kit di Estrazione DNA - Può essere utilizzato qualunque kit di estrazione del DNA disponibile in commercio. I campioni di DNA possono essere risospesi in acqua o in TE a ph 8. La concentrazione finale minima del DNA deve essere a 10 ng/µl. Il DNA purificato deve avere A260/ Acqua Distillata (DNAse and RNAse free) Platinum Taq DNA Polimerasi (vedere Autogenomics catalog dei prodotti per formazioni sui rifornitori) 5 su 9

6 ATTREZZATURA Attrezzatura necessaria non fornita con i reagenti: AutoGenomics Codice n : Analizzatore INFINITI con software operativo Qmatic. AutoGenomics Codice n : Puntali INFINITI AutoGenomics Codice n : INFINITI micropiastre da 24 pozzetti/coperchi Pipette Mini Centrifuga Puntali per pipette Racks per provette da Microcentrifuga Thermocycler Vortex Provette a parete sottile per PCR da 0.2 ml Provette per microcentrifuga da 1,5 ml Piastra da 24 pozzetti PROCEDURA DEL TEST Estrazione del DNA Seguire le istruzioni fornite nel kit usato per l estrazione del DNA. i campioni di DNA possono essere risospesi in acqua o TE a ph 8. la concentrazione minima finale del DNA deve essere a 10 ng/µl. Il DNA purificato deve avere A260/ Controlli DNA Per i genotipi HPV 16, 18, 31, 33 e 45 possono essere utilizzati i controlli Autogenomics: prelevare 5 µl (500pg) di controllo e procedere all amplificazione. Nota: è necessario utilizzare una tecnica di PCR adeguata per prevenire la contaminazione dei reagenti da parte dei controlli HPV. Per prevenire contaminazioni, si raccomanda di sigillare la piastra 24WP contenente i campioni di DNA HPV e i campioni "no template control" prima di aggiungere i controlli HPV Per il controllo beta-globina (BG) può essere utilizzato DNA genomico umano (Sigma codice D4642). Risospendere il controllo beta-globina in tampone TE ph8,0 (1X) per avere una concentrazione finale di 10ng/ul e utilizzarne 5 µl (50ng) per la PCR Condizioni per PCR PCR master mix 9.75 µl Platinum Taq DNA polimerasi 0.25 µl Template DNA 5.0 µl Totale 15.0 µl Termocicli per HPV-QUAD INFINITI Step No. Temperatura C Tempo(secondi) No. di Cicli a 2b 2c (-0.8/ciclo) hold su 9

7 Nota: Mantenere in ghiaccio la Platinum Taq DNA polimerasi. Vortexare la provetta PCR Master Mix 2-5 sec per mescolare i reagenti e centrifugare brevemente per portare il contenuto sul fondo della provetta. Includere un controllo negativo (5 µl di acqua DNA free) in ciascun set up della reazione di PCR. Per evitare contaminazioni, si raccomanda di eseguire la PCR in un area separata Assicurarsi che i tubi siano adeguatamente sigillati con il copercho di silicone per evitare l'evaporazione o la fuoriuscita. Dopo il PCR è completa assicurarsi che non vi è anormale evaporazione del prodotto della PCR. Ispezionate il volume per ogni reazione visivamente. Tutti i volumi di reazione della PCR dovrebbe essere di circa 15μl. In caso contrario, non procedere con il test. Questa è una Touchdown PCR. Nel passaggio 2b, la temperatura iniziale è 58 C; ad ogni ciclo, la temperatura si abbassa di 0,8 C. Caricamento Campioni Seguire le istruzioni del Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI (codice N EM-34000). 1. dispensare i 15 µl di prodotto della PCR nella piastra WP24 e caricarla nell Analizzatore INFINITI. 2. Caricare il BioFilmChip Magazine, il Modulo Intellipac, i puntali e il tampone di lavaggio specifici. Operatività dell Analizzatore INFINITI Fare riferimento al Manuale dell Operatore dell Analizzatore (Codice N EM-34000) CONTROLLO DI QUALITA Si raccomanda di eseguire controlli per ogni blocco di amplificazione, in simultanea con i campioni. In ogni seduta di PCR deve essere inserito un controllo negativo. Nota: Il thermocycler usato deve essere regolarmente sottoposto a manutenzione e calibrato con uno standard esterno di temperatura, secondo le norme del laboratorio ed i requisiti del CQ. LIMITAZIONI I risultati ottenuti con INFINITI HPV QUAD dovrebbero essere usati ed interpretati soltanto in un contesto globale di diagnosi clinica. AutoGenomics non è responsabile di qualsiasi decisione clinica venga presa. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I risultati ottenuti con INFINITI HPV QUAD sono refertati come Positivo o Negativo per la presenza di DNA di genotipi ad alto rischio di HPV. Inoltre, nel referto INFINITI HPV QUAD è eventualmente riportata la presenza dei genotipi 16, 18, 31, 33 e 45. Se non vengono visualizzati risultati, e c e` un messaggio di errore nell'angolo in basso a destra della pagina dei risultati, allora il test deve essere ripetuto per quel campione. Un eventuale messaggio di errore come "Error # 125 non template control equivalent" indica uno o più dei analiti non potevano essere genotipizati. Tutti gli errori vengono catturati nel log degli errori del INFINITI. Per ulteriori informazioni su errori si prega di consultare la sezione Risoluzione dei problemi del INFINITI Analyzer del manuale di istruzioni. Per ulteriori chiarimenti e la risoluzione dell' errore si prega di contattare il supporto tecnico a AutoGenomics. 7 su 9

8 SMALTIMENTO I materiali di rifiuto del test INFINITI HPV-QUAD sono comuni rifiuti di laboratorio, e devono essere manipolati/smaltiti secondo quanto previsto dalle procedure di laboratorio e dalla normativa nazionale vigente. PRESTAZIONI DEL TEST Specificità Analitica Durante lo sviluppo di questo test sono stati condotti relativi studi di specificità. La specificità dei primer della PCR è stata determinata dalla dimensione della banda del frammento amplificato su gel e dalla sequenza del frammento amplificato. La specificità del primer ASPE stata confermata ottenendo risultati corretti da campioni genomici noti. La specificità delle sonde di cattura è stata determinata per ibridazione con diversi oligonucleotidi e dimostrando che l oligo corretto ibridizza lo spot noto. Sensibilità analitica (Livello di Rilevazione) Per stabilire il livello rilevazione di INFINITI HPV-QUAD sono stati testati plasmidi contenenti DNA genomico di HPV per i genotipi 16, 18, 31, 33 e 45. Di seguito la tabella con i risultati dello studio. Genotipi HPV Numero più basso di coppie di Numero più alto di coppie di DNA plamidico rilevabili DNA plamidico rilevabili Tipo ,000 2,000,000 Tipo ,000 2,000,000 Tipo ,000 2,000,000 Tipo ,000 2,000,000 Tipo ,000 2,000,000 Nota: nei campioni clinici, l HPV 16 è presente con il più alto numero di coppie. Più del 55% dei campioni clinici HPV 16 positivi contengono più di 10 8 coppie/μg per DNA estratto. Nella normale citologia per il genotipo 16 si hanno 2.2 x 10 7 coppie/μg. La mediana del numero delle coppie di DNA varia del 10 4 secondo i genotipi. (15) Carry-over Gli studi di carry-over fra del campioni dimostrano che non c è carry-over utilizzando INFINITI HPV- QUAD. Sono stati utilizzati due campioni di DNA plasmidico (tipo 16 e tipo 18). Non è stato rilevato carry-over eseguendo per sei volte una serie costituita da: un campione di 25pg/rxn di Tipo 16, seguito da 0.025pg/rxn di Tipo 18, seguito da 25pg/rxn di Tipo 16, seguito da un Controllo No Template o acqua Potenziale Interferenza da Sangue o altre Sostenze E stato valutato l effetto del sangue e di altre sostenze potenzialmente interferenti. Ai campioni è stato aggiunto sangue intero, materiale per irrigazione vaginale, creme anti-micotiche e gel contraccettivi (sostanze che possono essere facilmente reperite nei campioni cervicali) a concentrazioni simili a quelle rilevabili nei campioni cervicali. per lo studio sono stati utilizzati due campioni di HPV plasmidico, tipo 16 e tipo 18. Lo studio ha dimostrato che la presenza di queste sostanze non interferisce con INFINITI HPV- QUAD. Interferenza dei Altri Test E stata valutata l eventuale interferenza da altri test eseguiti contemporaneamente sull Analizzatore INFINITI. Gli studi hanno dimostrato che eseguire INFINITI HPV-QUAD e INFINITI FII/FV/MTHFR contemporaneamente sullo stesso strumento non interferisce sui risultati di ogni test, i.e. un test non interferisce con i risultati di un altro. 8 su 9

9 Attendibilità Clinica INFINITI HPV-QUAD è stato valutato, seguendo le istruzioni standard, da un laboratorio clinico di riferimento indipendente per validarel impiego del test nella pratica clinica. Gli studi di attendibilità clinica dimostrano che INFINITI HPV QUAD può essere eseguito in un contesto clinico (indipendente da Autogenomics) seguendo la procedura standard del test. La valutazione, utilizzando linee cellulari, ha anche fornito informazioni sui limiti di rilevazione e sulla riproducibilità di INFINITI HPV-QUAD. Il DNA è stato estratto utilizzando il Qiagen s QIAmp MiniElute Media Kit. La PCR è stata eseguita utilizzando HPV Ampl. Mix, seguendo le condizioni specificate per INFINITI HPV-QUAD. I prodotti della PCR sono stati posizionati nell Analizzatore INFINITI per l estensione dei primer, ibridizzazione al microarray, lavaggi e rilevazione del segnale utilizzando BioFilmChip e HPV-QUAD Intellipac. La riproducibilità del test,valutata tramite controlli cellulari CaSki e HeLa, è risultata 100%intraassay; n=3 su 3 differenti chip utilizzando HeLa (HPV18) e 3 campioni clinici 100% interassay(n=3); utilizzati 4 campioni clinici REFERENCES 1. Kulasingam, S; Hughes, J et al. Evaluation of Human Papillomavirus Testing in primary Screening for Cervical Abnormalities. JAMA October 2002 Vol 288 p Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S et al., CJLM Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med 348: G.M. Clifford, J.S. Smith, M. Plummer, N. Munoz and S. Franceschi, Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta-analysis, Br. J. Cancer 88 (2003) pp Jenson AB, Kurman RJ, Lancaster WD. Human Papillomaviruses. In: Belshe RB, editor. Textbook of Human Virology. Littleton, MA: PSG-Wright; p Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJLM, Shah KV. The casual relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 2002 Apr; 55(4): J. Walboomers, M. Jacobs, M.m. Manos et al., Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide, J Pathol 189 (1999) pp Doorbar, J. The papillomavirus life cycle. Journal of Clinical Virology, Volume 32 March 2005 p Klug, S, Molijn, A et al. Comparison of the Performance of Different HPV Genotyping Methods for Detecting Genital HPV Types. Journal of Medical Virology 80: (2008). 9. Pfister H. Biology and biochemistry of papillomaviruses Rev Physiol Biochem Pharmacol 1983;. 10. Broker TR. Structure and genetic expression of human papillomaviruses. Obstet Gynecol Clin North Am 1987:14: Delius H, Hofman B. Primer-directed sequencing of human papillomavirus types. Curr Top Microbiol Immunol 1994;186: Delius H, Hofman B. Primer-directed sequencing of human papillomavirus types. Curr Top Microbiol Immunol 1994;186: su 9

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