Loc. Nassar 37, Pedemonte (VR), Italy (2) Fondazione Edmund Mach - Istituto Agrario di S. Michele.Centro Sperimentale

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1 IL PROCESSO DI REIDRATAZIONE COME PRIMO STRUMENTO PER LA VALORIZZAZIONE DEL LIEVITO. E. Bocca (1), A. Cavazza (2), R. Ferrarini (3), (1) Enologica Vason s.r.l. Loc. Nassar 37, Pedemonte (VR), Italy (2) Fondazione Edmund Mach - Istituto Agrario di S. Michele.Centro Sperimentale via Mach, S. Michele all'adige (TN), Italy agostino.cavazza@iasma.it (3) Dipartimento di Scienze, Tecnologie e Mercati della Vite e del Vino Università di Verona Via della Pieve 70, S. Floriano (VR), Italy roberto.ferrarini@univr.it RIASSUNTO Il processo di riattivazione della preparazione dei lieviti secchi attivi (LSA) e l inoculo nel mosto costituiscono una fase critica nel controllo della fermentazione alcolica. Diversi parametri condizionano l efficienza di riattivazione dei LSA per uso enologico: temperatura, composizione del mezzo, metodica di dispersione in acqua e tempi. In questo lavoro si presentano i risultati degli esperimenti condotti per valutare gli effetti dei diversi parametri sul recupero della vitalità del LSA durante la fase di riattivazione. La sperimentazione, eseguita secondo criteri statistici rigorosi, ha evidenziato che le attuali procedure di reidratazione non migliorano la vitalità della preparazione mentre una procedura ottimizzata porta ad un incremento della vitalità del LSA. L applicazione in una cantina ha dimostrato che un efficiente reidratazione garantisce una fermentazione regolare e soprattutto un forte effetto competitivo nei confronti della microflora indigena. ABSTRACT The process of reactivating the yeast preparation and inoculating it into the must can be a critical step in the management of alcoholic fermentation. The efficiency of ADY reactivation is affected by environmental parameters, as temperature, the composition of the medium, the way of dispersion in water and the extent of hydration times. The effects of the following parameters on active dry yeast (ADY) vitality after rehydration were evaluated: stirring, rehydration temperatures, nutrient concentration and extent of rehydration times. The trials, carried out on a broad statistical basis, suggested that the currently proposed rehydration stage, does not assure the highest vitality of the preparation. An efficient stirring of the rehydration medium, an appropriate temperature, and proper yeast feeding, leads to a higher recovery of yeast vitality. The described process, when applied in a winery showed that a more efficient rehydration procedure led to a regular fermentation process and a competitive effect of rehydrated yeast against the indigenous microflora. INTRODUZIONE Il processo di riattivazione della preparazione dei lieviti secchi attivi (LSA) e l inoculo nel mosto costituiscono una fase critica nel controllo della fermentazione alcolica. La bibliografia disponibile al riguardo non sembra fornire risposte certe riguardo le condizioni ottimali di tale processo, e gli stessi produttori di lievito secco non concordano sulla modalità di riattivazione. Diversi parametri condizionano l efficienza di riattivazione dei LSA per uso enologico: temperatura, composizione del mezzo (concentrazione degli zuccheri, azoto prontamente assimilabile

2 ed ossigeno), la metodica di dispersione in acqua ed i tempi di reidratazione. In questo lavoro si presentano i risultati degli esperimenti condotti per valutare gli effetti della modalità di dispersione (con e senza agitazione), della temperatura (partendo da 15 C fino a 50 C), della composizione del mezzo (concentrazione di zuccheri, azoto assimilabile e ossigeno) infine del tempo di reidratazione sul recupero della vitalità del LSA. La sperimentazione condotta con una forte base statistica ha evidenziato che le attuali procedure di reidratazione, in quiete a 38 C con pochi zuccheri non migliora la vitalità della preparazione mentre un efficiente agitazione, controllando la temperatura e alimentando il lievito in maniera appropriata durante il processo, porta ad un incremento della vitalità del LSA e quindi all ottimizzazione della procedura. La procedura applicata in una realtà produttiva industriale ha dimostrato che un efficiente procedura di reidratazione determina una fermentazione regolare e soprattutto un forte effetto competitivo nei confronti della microflora indigena. MATERIALI E METODI Reidratazione del lievito Per ogni esperimento sono stati reidratati 5 kg di lievito Nouveaux Ferments (Enologica Vason). La procedura standard presa come riferimento per tutti i test come procedura usuale ha previsto la reidratazione del lievito in una soluzione zuccherina (15 g/l di saccarosio) a 38 C. Il volume di soluzione di reidratazione era 10 volte la massa del lievito da reidratare. La durata complessiva della reidratazione usuale è stata di 30 minuti, di cui i primi 10 in quiete. Agitazione Per lo studio dell agitazione, condotta a temperatura costante di 38 C in soluzione zuccherina a 15 g/l, sono stati allestiti due sistemi: Reidratazione idraulica realizzata attraverso una pompa centrifuga (a). Reidratazione meccanica: realizzata attraverso un agitatore a pale (b). Zuccheri L effetto della concentrazione di zucchero nella soluzione di reidratazione è stato condotto in condizioni isoterme a 38 C, in soluzioni zuccherine con dodici diverse concentrazioni comprese tra 0 e 200 g/l di saccarosio (0, 01, 0,5, 1, 2, 4, 9, 15, 30, 100, 150, 200 g/l). Azoto Fig. 1: Schema dei sistemi di dispersione attraverso agitazione idraulica (a) e meccanica (b): (a) P= Pompa Centrifuga (rpm =1450, portata 150 l min -1 ), V= tubo Venturi, R= circuito di ricircolo (b) S=pale per agitazione (pale=0,15 m, rpm=1000) L effetto della concentrazione di azoto in reidratazione è stato studiato con concentrazioni di diammonio fosfato (DAP) di 0,1, 1, 14 e 55 g/l. In questa prova oltre alla valutazione della popolazione vitale è stata valutata l evoluzione dell azoto durante la reidratazione e la produzione di acido acetico.

3 Temperatura L effetto della temperatura è stato studiato eseguendo reidratazioni isoterme in serbatoi coibentati appositamente predisposti per il controllo della temperatura. Sono state considerate otto temperature comprese tra 15 e 50 C. La soluzione conteneva in ogni caso 15 g/l di saccarosio. Effetto combinazione zuccheri, azoto e agitazione sulla cinetica di fermentazione L effetto combinato di diversi nutrienti in fase di reidratazione è stato allestito confrontando diverse concentrazioni di zucchero (0, 15 e 50 g/l) e diverse fonti azotate secondo la matrice riportata in Tab. 1. In questo caso sono state scelte due fonti azotate: DAP e V-Activ Premium, Enologica Vason (attivante complesso con sali ammoniacali 30%, scorze di lievito selezionate 40%, cellulosa micrometrica 30% e tiamina). In particolare, con il secondo attivante, si è voluto valutare l effetto combinato della fonte ammoniacale con piccole quantità di scorze di lievito opportunamente selezionate. Ossigeno Tab. 1: Disegno sperimentale per lo studio combinato zucchero e nutrienti Concentrazione zucchero Tipologia attivante 0 Nessuno 0 0 DAP 0,1 0 V- Activ Premium 4 15 Nessuno 0 15 DAP 0,1 15 V- Activ Premium 4 50 Nessuno 0 50 DAP 0,1 50 V- Activ Premium 4 Concentraizone attivante (g/l) La velocità di dissoluzione dell ossigeno in reidratazione è stata misurata eliminando inizialmente l ossigeno saturando il liquido con azoto gassoso, quindi è stato monitorato l arricchimento di ossigeno La velocità di consumo dell ossigeno in reidratazione è stato misurata mettendo a confronto due cicli automatici, con e senza lievito. La concentrazione di ossigeno è stata misurata mediante metodo polarografico utilizzando lo strumento Micrologger mod.3650/113, Orbisphere Laboratories, CH. Raccolta ed elaborazione dati I dati sono stati elaborati mediante analisi ANOVA Statsoft, Tulsa, OK (US). Fermentazioni di Laboratorio Le prove di fermentazione sono state condotte in mosto bianco chiarificato (100 NTU) e pastorizzato (Zuccheri riducenti 200 g/l, ph 3,41, Acidità Titolabile 5,8 g/l, APA 208 mg/l). La cinetica fermentativa è stata seguita mediante il calo in peso dei campioni. Fermentazioni in cantina Per le prove di reidratazione in realtà produttive industriali è stato costruito un prototipo in grado di controllare i parametri emersi come determinanti nella prima parte della sperimentazione (Easyferm, JUCLAS). Il sistema prevedeva un serbatoio dotato di: un circuito per il controllo della temperatura, un sistema per il dosaggio di nutrienti, un sistema per l arricchimento di ossigeno ed un circuito dotato di pompa centrifuga per mantenere in costante agitazione la soluzione. Sono state monitorate quattro fermentazioni: due masse da 400 hl sono state ripartite per ottenere 4 serbatoi di mosto Sangiovese da 200 hl uguali a due a due, (APA 130 e 138 mg/l). All inoculo è stato aggiunto 15 g/hl di V Activ Premium (Enologica Vason) ed al terzo giorno di fermentazione 20 g/hl di DAP ad integrazione del APA di partenza. Analisi Le analisi sono state condotte utilizzando le metodiche d analisi Comunitarie (CEE, 1990) o quelle suggerite dall OIV (OIV, 2007).

4 Analisi Microbiologica La conta vitale nelle diverse prove è stata condotta in triplo su terreno agarizzato (WL Nutrient Agar, Millipore ) dopo incubazione per 7 giorni a 27±2 C. Il risultato è espresso in UFC/g di lievito secco. Per l identificazione della microflora indigena è stato utilizzato, seguendo le indicazioni di Cavazza (1992), il terreno WLd Nutrient Agar (Millipore ). L identificazione presuntiva è stata fatta dopo incubazione per 7 giorni a 27±2 C. RISULTATI E DISCUSSIONE Agitazione È stata condotta una prova preliminare per verificare l effetto dell agitazione sul numero di cellule dopo la reidratazione Fig. 2. L agitazione ha avuto un effetto positivo sul numero di ufc/ml misurate al termine della reidratazione. In particolar modo l agitazione effettuata attraverso una pompa centrifuga (agitazione idraulica) ha portato a contare un numero di ufc/ml significativamente più alto. Per quanto riguarda l evoluzione del numero di cellule in funzione di due diversi tipi di reidratazione, appare evidente dalla Fig. 3 che l agitazione continua determina che il numero di cellule vitali contate in reidratazione è progressivamente maggiore già dopo 30, e soprattutto dopo 60 e 120 minuti. Zuccheri La concentrazione di zucchero non ha influenzato in maniera statisticamente significativa la concentrazione di cellule vitali nel corso della reidratazione. Evoluzione dell azoto e produzione di acido acetico in reidratazione L effetto dell azoto in reidratazione è stato valutato in condizioni isoterme (38 C) aggiungendo diverse quantità di DAP. I dati raccolti non hanno evidenziato differenze statisticamente significative tra le tesi, tranne che per i primi momenti della reidratazione, in cui la concentrazione di DAP 55 g/l, ha causato una forte riduzione (50%) del numero di cellule vitali (Fig. 4). Le prove condotte con basse Fig. 2: Effetto delle diverse modalità di agitazione sul numero di cellule vitali a fine processo Fig. 3: Confronto nel tempo di due differenti modalità di agitazione Fig. 4: Effetto della concentrazione di azoto all'inizio della reidratazione (A=0, B=0,1, C=1, D=14, E=55 g DAP/L )

5 concentrazioni di DAP (0,1 e 1 g/l) hanno evidenziato che il lievito era già in grado di utilizzare la fonte azotata dall inizio della reidratazione. I dati raccolti (Fig. 5) hanno consentito di valutare la velocità di consumo di azoto che è risultata di circa 195mg/L in 30 minuti. Nelle prove in cui erano stati aggiunti 14 e 55 g/l di DAP, la concentrazione di ammonio è rimasta invariata, quindi si può concludere che il lievito non è in grado di utilizzare questo quantitivo di azoto. Durante queste reidratazioni è stata inoltre determinata la concentrazione di acido acetico nel mezzo. Alle concentrazioni più basse di DAP le produzioni di acido acetico sono state limitate e, al termine della reidratazione erano comprese tra 0,03 e 0,07 g/l. Concentrazioni elevate di azoto hanno determinato invece la produzione di quantitativi elevati di acido acetico. La Fig.6 evidenzia come concetrazioni di 14 e 55 g/l di DAP abbiano portato a fine reidratazione ad una concentrazione di acido acetico rispettivamente pari a 1,25 e 1,75 g/l. Si presume che questi elevati quantitativi di acido acetico siano prodotti dal lievito in risposta a sbilanciamenti nel potenziale redox che questi elevati quantitivi di ammonio determinano. Effetto combinazione zuccheri e azoto in reidratazione Le prove condotte per definire l effetto della concentrazione di zuccheri in reidratazione non ha consentito di determinazione quale sia la concentrazione ottimale di azoto e zucchero nel mezzo di reidratazione. Si è Fig. 5: Consumo di azoto ammoniacale in reidratazione Fig. 6: Produzione di acido acetico in reidratazione con diverse concentrazioni di azoto ammoniacale Fig. 7: Effetto della combinazione di zucchero e fonti nutritive in reidratazione sulla cinetica fermentativa deciso pertanto di verificare l effetto di zuccheri e attivante in maniera indiretta, attraverso reidratazioni effettuate in presenza di diverse fonti azotate (DAP e V-Activ Premium, Enologica Vason) e diverse concentrazioni di zucchero, e monitorando la cinetica di fermentazione (Tab. 1).

6 Come appare evidente dalla Fig. 7, l effetto più significativo sulla cinetica è derivato dall aggiunta, durante la reidratazione, di piccole dosi di una fonte azotata costituita di sali ammoniacali e scorze di lievito opportunamente selezionate. La concentrazione di zucchero in reidratazione invece non ha influenzato in maniera significativa la cinetica fermentativa. Temperatura La temperatura di reidratazione è già stata oggetto di studi che ne hanno evidenziato gli effetti. In particolare Kraus (1981) e Poirer (1998) hanno riportato che temperature superiori a 40 C determinano un maggior recupero di cellule dal preparato secco. La Fig. 8 riporta la relazione tra tempo e temperatura di reidratazione e conta vitale. Lo studio statistico dei dati per gruppi omogenei ha individuato come gruppi di eccellenza le temperature: A tempo 0 di 40,45 e 50 C Dopo 30 minuti tra 35 e 50 C Dopo 90 minuti tra 30, 35 e 40 C. Fig. 8: Effetto della temperatura sul numero di cellule vitali nel tempo I dati raccolti, oltre a confermare quanto già riportato da altri autori, evidenziano che, al crescere del tempo di reidratazione, la temperatura ottimale si avvicina alla temperatura fisiologica del lievito. Questo effetto può trovare giustificazione nel fatto che alte temperature iniziali favoriscono la bagnatura rapida del lievito, ma, trascorsi i primi 30 minuti, la temperatura deve essere riportata in range ottimali per la corretta esecuzione dei cicli metabolici. Ossigeno La cinetica di dissoluzione di ossigeno evidenzia come differenti modalità di agitazione determinino differenti velocità di dissoluzione dell ossigeno in acqua. In particolare, la modalità di agitazione continua idraulica consente una dissoluzione di ossigeno pari a 1,182 mg L -1 min -1, mentre l agitazione meccanica una pari a 0,270 mg L -1 min -1. Tempo Tutte le prove condotte hanno indicato una crescita progressiva nel tempo del numero di cellule vitali contabili. Dopo 30 minuti si ha il 17% in più di cellule rispetto a tempo 0, un ulteriore 8% è stato osservato dopo altri 30 minuti, ed infine un altro 4% dopo i successivi 30 minuti. Verifiche di processo in reidratazione In base alle indicazioni emerse dallo studio dei singoli fattori, è stata elaborata una nuova procedura: - Profilo termico: il ciclo inizia a 45 C, quindi il sistema è raffreddato di 1 C ogni 3 minuti fino a 28 C - Nutrienti: la soluzione viene integrata all inizio di 15 g/l di saccarosio e 4 g/l di una miscela di azoto ammoniacale e scorze di lievito. Si eseguono quindi due integrazioni dopo 30 e dopo 60 minuti della medesima miscela. - Ossigeno: viene fornito mediante effetto Venturi per tutta la durata del ciclo. - Durata del ciclo: 90 minuti.

7 Raccolta dati Per valutare l efficacia di questo ciclo, sono state eseguite una serie di reidratazioni. Nei grafici sono riportate le concentrazioni di ossigeno (Fig. 9), ammonio e zuccheri (Fig. 10). L aggiunta del lievito, evidenziata nel grafico da una freccia, determina dopo soli 5 minuti il completo consumo dell ossigeno disponibile (Fig. 9). Nonostante il sistema sia in grado di arricchire la soluzione di reidratazione con una velocità pari a 1,182 mg/l min la concentrazione di ossigeno rimane comunque non determinabile fino alla fine del ciclo. Per quanto riguarda il consumo di azoto e zuccheri il profilo riportato in Fig. 10 indica che l attività metabolica del lievito è già attiva pochi secondi dopo l inizio della reidratazione, e che il lievito consuma circa 10 g/l di zuccheri ogni 30 minuti. Inoltre si confermano i dati raccolti in precedenza circa il consumo di azoto ammoniacale Verifiche di processo: applicazione in cantina Due mosti, di uve Sangiovese sono stati suddivisi ciascuno in due serbatoi da 200 hl ed inoculato con 15 g/hl di Premium Rouge, (Enologica Vason) reidratato con la metodica tradizionale e con Easyferm. In totale sono state seguite quattro vinificazioni. Non si sono registrate differenze significative nella fermentazione: tutti i mosti hanno avuto un decorso fermentativo regolare e completo,e la composizione finale del vino era simile (14,2 % alcol vol. svolto; acidità volatile <0,3 g/l). Nelle due tesi reidratate con Fig. 9: Consumo di ossigeno in reidratazione Fig. 10: Consumo di zucchero e azoto ammoniacale in reidratazione Fig. 11: Evoluzione della popolazione di S. cerevisiae durante la fermentazione Easyferm si è osservato un anticipo nella partenza della fermentazione, che si è conclusa negli stessi tempi del testimone reidratato nel modo tradizionale. Dal punto di vista microbiologico, durante la fermentazione si è osservata una crescita più veloce del numero di cellule di lievito nella prova reidratata con Easyferm (Fig. 11), nella quale lo sviluppo della microflora indigena è risultato fortemente inibito (Fig. 12).

8 CONCLUSIONI In questo lavoro sono stati presi in considerazione diversi fattori che possono influenzare la resa, in termini di cellule vitali, della reidratazione. In primo luogo è stato dimostrato che l agitazione, in reidratazione, non solo non è dannosa per la vitalità delle cellule, ma anzi consente di incrementarla rispetto alla reidratazione statica. Per quanto riguarda la concentrazione di zuccheri e di ammonio si è evidenziato che un opportuno dosaggio durante la reidratazione determina un notevole Fig. 12: Evoluzione della popolazione non S. cerevisiae durante la fermentazione vantaggio in termini fermentativi. Lo studio dell influenza della temperatura ha confermato alcuni studi pregressi secondo i quali, all inizio della reidratazione, le elevate temperature determinano un maggior numero di cellule nel mezzo, e ha consentito di definire un profilo di temperatura ottimale per la reidratazione: all inizio C per poi raggiungere gradatamente la temperatura più fisiologica di 30 C. Per l applicazione pratica di questo profilo termico, in cantina, sarà importante però tener conto anche della temperatura del mosto al momento dell inoculo, allo scopo di evitare shock termici, soprattutto nei mosti bianchi. RINGRAZIAMENTI Si ringraziano Enologica Vason s.r.l. per il supporto tecnico ed analitico, JU.CLA.S per la costruzione del prototipo ed il supporto logistico. BIBLIOGRAFIA Bavaresco S., Tesi di Laurea Cavazza, A., et al Rilevazione della flora microbica di mosti e vini. Vignevini, 9: Ferrarini R., et al Mechanical dispesion procedures improve the rehydration of active dry yeast. Enzyme and Microbial Technology 40: Kraus, J. K., et al Effect of rehydration on dry wine yeast activity. Am. J. Enol. Vitic., 32: Poier I., et al Saccharomyces cereviasie viability is strongly dependent on rehydration kinetics and the temperature of dried cells. Journal of Applied Microbiology 86: CEE, Regolamento n. 2676/90 del 17 settembre 1990, L 272. Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea. OIV, Recueil des methodes internationales d analyse des vins et des mouts.