Regolano il metabolismo, sia come enzimi, sia come ormoni (insulina, glucagone, ecc.)

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1 Grazie alla elevata dinamicità delle strutture proteiche (gli atomi sono in continuo movimento fluttuante) e per la capacità che hanno di legarsi in modo selettivo ad altre molecole, le proteine svolgono un numero elevato di funzioni (classificazione): Regolano il metabolismo, sia come enzimi, sia come ormoni (insulina, glucagone, ecc.) Trasportano diverse molecole; Le funzioni di molte proteine richiedono il legame reversibile di altre molecole. Una molecola che si lega reversibilmente ad una proteina è detta LIGANDO q Il sito a cui si lega il ligando è chiamato SITO DI LEGAME è complementare al ligando per dimensione, forma e carica q le proteine sono flessibili e presentano modificazioni conformazionali più o meno elevate e possono essere essenziali per la funzione della proteina q il legame di un LIGANDO alla proteina è spesso accompagnato da MODIFICAZIONE CONFORMAZIONALE q nella struttura quaternaria la modificazione di una subunità può essere trasmessa alle subunità vicine q le interazioni tra proteine e ligandi possono essere REGOLATE di solito attraverso il legame con altri ligandi 1

2 L ossigeno è poco solubile in acqua e non potrebbe essere trasportato a sufficienza ai tessuti se non fosse trasportato legato ad una proteina : l EMOGLOBINA 2

3 In realtà questo ruolo viene svolto da un metallo di transizione: il FERRO. Il ferro è infatti incorporato in un gruppo legato a queste proteine: il gruppo EME PROTOPORFIRINA costituita da quattro anelli pirrolici Il ferro che è nello stato ferroso (Fe +2 ) può fare 6 legami di coordinazione Quattro legami del ferro sono impegnati con l azoto dell anello porfirinico gli altri due sono perpendicolari all anello. Mentre uno dei due legami di coordinazione perpendicolari all anello lega l ossigeno, l altro è impegnato con un di azoto di un residuo di istidina di una catena laterale della proteina che impedisce l ossidazione del metallo in presenza di ossigeno. 3

4 Due catene laterali idrofobiche dal lato dell eme che lega l ossigeno coadiuvano nel mantenere l eme nella posizione corretta. Mentre il Fe +2 lega reversibilmente l ossigeno il Fe +3 non è in grado di legarlo. Quando l EME non è legato a proteine ma è libero in soluzione la presenza di ossigeno ne determina l ossidazione a Fe +3 La componente proteica della mioglobina impedisce l ossidazione del ferro a Fe (III) In determinate condizioni il ferro II dell emoglobine o della mioglobina si ossida a Fe (III) per dare luogo alla METAMIOGLOBINA e alla METAEMOGLOBINA ; a queste proteine si deve il colore marrone scuro della carne esposta all aria d e del sangue secco 4

5 Quando il ferro emico si lega all ossigeno, le proprietà elettroniche si modificano e ciò spiega il diverso colore che ha il sangue venoso (povero di ossigeno) rispetto a quello arterioso (ricco di ossigeno). Alcune molecole come il monossido di carbonio (CO) e il monossido di azoto (NO) si possono coordinare al ferro con un affinità superiore a quella dell ossigeno. Inoltre il legane del monossido di carbonio è irreversibile. Esistono molte proteine con gruppi eme ( citocromi, clorofilla emoglobine e mioglobina) ma solo due proteine legano e trasportano l ossigeno. Mioglobina una catena polipeptidica Emoglobina quattro catene polipeptidiche 5

6 Singola catena polipeptidica di 153 residui amminoacidici lega l ossigeno soprattutto al livello del cuore e del muscolo scheletrico; sembra avere la funzione di tampone per l ossigeno allo scopo di mantenere costante la concentrazione intracellulare in base al livello del metabolismo aerobico. La mioglobina è particolarmente abbondante nel tessuto scheletrico di quei mammiferi marini che devono immagazzinare ossigeno per le loro prolungate immersioni La funzione della mioglobina così come dell emoglobina è quella di legare l ossigeno ma anche di rilasciarlo al momento opportuno L ossigeno è trasportato nell organismo animale legato all emoglobina degli eritrociti. Gli eritrociti sono vestigia di cellule che hanno la durata, almeno negli uomini, di 120 giorni e derivano da cellule staminali dette emocitoblasti. L emoglobina è una proteina tetramerica che contiene due subunità α e due β ognuna delle quali contiene un centro eme che lega l ossigeno. 6

7 La struttura globale dell emoglobina è α 2 β 2. entrambe le catene sono molto simili così come sono simili alla miogobina. La mioglobina lega una molecola di ossigeno l emoglobina ne lega quattro entrambe legano l o s s i g e n o REVERSIBILMENTE, ma l emoglobina presenta una COOPERATIVITA POSITIVA L emoglobina funziona da trasportatore di ossigeno, la mioglobina da riserva di ossigeno. Questa diversità funzionale è dovuta alla diversa capacità di legare e rilasciare ossigeno La struttura tridimensionale dei due tipi di catene (α e β) dell emoglobina è molto simile alla struttura della mioglobina. Lo stato R (rilasciato) ha un affinità maggiore dello stato T (teso) anche se l ossigeno si lega ad entrambi. L ossigeno che lega T innesca una variazione conformazionale, che converte le subunità nello stato R Nello stato T la forfirina ha una forma a cupola perché il ferro nell eme tende a protrudere verso l istidina prossimale; quando si lega l ossigeno l eme assume una conformazione più planare 7

8 L ossigenazione causa la rotazione di un protomero di 15 rispetto all altro, portando le catene β in stretto contatto reciproco La funzione di queste proteine è quella di legare l ossigeno ma anche di rilasciarlo al momento opportuno. In BIOCHIMICA la funzione delle proteine dipende dalle interazioni LIGANDO-PROTEINA In generale il legame reversibile di un ligando alla proteina può essere descritto da una reazione all equilibrio: P + L PL K a = [PL] [P] [L] Ka = Costante di Associazione La Ka è una misura dell affinità proteina (P) ligando (L) Se la Ka è molto elevata l affinità del ligando per la proteina è molto elevata. 8

9 La costante di dissociazione K d è molto più usata della costante di associazione per esprimere l affinità della proteina per un ligando P L P + L K d = [P] [L] [PL] K a = 1/K d Un valore basso di K d corrisponde ad un elevata affinità Negli esperimenti in cui viene usato ossigeno come ligando è molto più facile misurare la pressione parziale po 2 che non la concentrazione Le curve di dissociazione dell emoglobina e della mioglobina sono diverse ed adeguate ai rispettivi ruoli fisiologici Se riportiamo in un grafico il grado di SATURAZIONE (frazione dei possibili siti a cui è effettivamente legato l ossigeno) rispetto alla pressione di ossigeno otteniamo una curva IPERBOLICA per la mioglobina ed una SIGMOIDE per l emoglobina 9

10 La mioglobina è molto efficiente a richiamare ossigeno dai capillari alle cellule muscolari ALTA AFFINITA PER L OSSIGENO Nell emoglobina occorre più ossigeno per arrivare allo stesso grado di saturazione ( 50%) L emoglobina deve legare in modo efficiente l ossigeno nei polmoni e rilasciarlo nei tessuti : LEGAME COOPERATIVO DELL OSSIGENO CINETICA SIGMOIDE 10

11 Capillari polmonari: 100 mm Hg muscolo in attività: 20 mm Hg Nei tessuti: 40 mm Hg La curva sigmoide c può essere pensata come una curva ibrida che riflette la presenza di forma a bassa affinità e forma ad alta affinità. Il legame cooperativo dell ossigeno rende l emoglobina più sensibile alle variazioni della concentrazione di ossigeno. 11

12 L ossigenazione dell emoglobina innesca cambiamenti conformazionali nella componente proteica Una molecola di ossigeno si lega più facilmente ad una emoglobina che ha legato altro ossigeno (legame cooperativo) COOPERATIVITA Proprietà esclusiva delle proteine multimeriche In qualunque tipo di legame, una curva sigmoide è indicativa di un interazione cooperativa tra i siti di legame Oltre a trasportare l O 2 dai polmoni ai tessuti l emoglobina trasporta la CO 2 dai tessuti ai polmoni. La CO 2 è trasportata come CARBAMMATO legato al gruppo amminico terminale di una catena di emoglobina CO 2 + Hb-NH 3 + 2H + + Hb-N-C-O - I carbammati cambiano la carica delle proteine favorendo la formazione di ponti salini tra le catene α e β. La CO 2 legata all emoglobina è il 15% del totale nel sangue venoso. La restante parte di CO 2 è trasportata come BICARBONATO che si forma negli eritrociti per idratazione dell acido carbonico in presenza di un enzima : l ANIDRASI CARBONICA H O 12

13 Anidrasi carbonica CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO H + Per ogni 2 molecole di O 2 rilasciate la deossiemoglobina lega un H + contribuendo in maniera significativa al potere tamponante del sangue. L effetto Bohr costituisce inoltre un meccanismo grazie al quale è possibile rifornire un ulteriore quantità di ossigeno ai muscoli in elevata attività metabolica dove la pressione di ossigeno può essere inferiore a 20 Torr. Questi muscoli generano acido lattico così velocemente che portano ad un abbassamento del ph da 7,4 a 7,2 del sangue che vi passa attraverso. 13

14 L emoglobina purificata mostra un affinità per l ossigeno altamente superiore rispetto a quella nel sangue intero. Il D-2,3-bisfosfoglicerato (BPG) si lega saldamente alla desossiemolobina ma debolmente alla forma ossigenata. La presenza di BPG determina perciò una diminuzione dell affinità dell emoglobina per l O 2, favorendo la conformazione deossigenata I gruppi anionici del BPG sono legati in una tasca della proteina con residui istidinici carichi positivamente ed i gruppi amminici terminali di entrambe le subunità β. Quando non è legato l ossigeno le due eliche tendono ad avvicinarsi restringendo la cavità centrale determinando l espulsione del DPG dalla cavità centrale. 14

15 Quando la concentrazione di H + diventa più alta (ph più basso al livello polmonare) la curva di dissociazione dell emoglobina è più stesa determinando un rilascio maggiore di ossigeno 15

16 L associazione di più catene in un tetramero determina un rilascio di ossigeno molto più elevato di quanto sarebbe possibile con una singola catena la curva spiega sia l efficienza di legame che di rilascio dell ossigeno ma come si può spiegare dal punto di vista MOLECOLARE questa COOPERATIVITA Tutti questi effetti sono il risultato di Gli effetti allosterici, nei quali il legame di un ligando ad un sito modifica il legame di un altro ligando ad un altro sito, richiedono la presenza di interazioni tra le subunità delle proteine oligomeriche Per spiegare il legame cooperativo di un ligando sono stati elaborati due modelli. MODELLI MOLECOLARI DELL ALLOSTERISMO il modello simmetrico dell allosterismo, sviluppato nel 1965 da J. Monod, J. Whyman e J.P. Changeaux, è catatterizzato dalle seguenti regole: 16

17 Una proteina allosterica è un oligomero 1. Ciascun oligomero esiste in due stati conformazionali R ( relaxed) e T (tensed) in equilibrio tra di loro 2. Il ligando può legare una subunità di una o dell altra conformazione 3. il legame del ligando sposta l equilibrio in favore di R 4. Durante la modificazione conformazionale la simmetria molecolare della proteina è conservata. La variazione delle subunità varia quindi in maniera CONCERTATA. E difficile credere che la simmetria oligomerica sia invariabilmente conservata in tutte le proteine a seguito del legame del ligando; 17

18 Koshland, Nemethy e Filmer nel 1966 proposero un secondo modello modello Nel modello sequenziale il legame del substrato induce una modificazione conformazionale in un protomero (subunità); le interazioni cooperative derivano dagli effetti che queste variazioni conformazionali hanno sulle subunità vicine. L affinità dell enzima per il legame del substrato varia con il numero di molecole di substrato legate, passando attraverso una serie di forme intermedie ad affinità diversa 18

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