LA PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA

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1 numero 21 maggio 2011 LA PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA CONSERVAZIONE DEI TERRENI DISIDRATATI I terreni di coltura disidratati devono essere conservati in un ambiente asciutto a temperatura controllata, di solito C, lontano da fonti di calore e di luce diretta. Una volta aperti per prelevare il quantitativo necessario alla preparazione, i barattoli devono essere subito ben richiusi, al fine di evitare che la polvere igroscopica assorba umidità. I terreni correttamente conservati possono durare fino a scadenza. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA Ricostituzione del terreno disidratato Per la preparazione dei terreni di coltura è necessario impiegare acqua deionizzata/distillata sterile preparata di recente, priva di sostanze inibenti. Occorre sciacquare con la stessa acqua anche tutta la vetreria, per assicurarsi che i materiali che vengono a contatto con il terreno non contengano sostanze chimiche tossiche (es. sali biliari, tellurite, selenite ). L acqua deionizzata/distillata deve essere analizzata periodicamente al fine di valutarne la qualità (conducibilità, contenuto di cloruri, crescita microbiologica ). I terreni disidratati necessitano di una rapida dispersione tramite mescolamento seguito, se necessario, da riscaldamento a circa 50 C: i terreni privi di agar si disciolgono con la semplice agitazione mentre quelli agarizzati di solito devono essere lasciati a bagno per alcuni minuti prima di procedere con riscaldamento e mescolamento. Per garantire una adeguata miscelazione, è necessario utilizzare contenitori con volume doppio rispetto al volume di terreno che si vuole preparare. Dopo aver mescolato con attenzione terreno in polvere e acqua, si porta delicatamente ad ebollizione. I terreni di coltura e gli ingredienti possono essere sterilizzati mediante sterilizzazione in autoclave o sterilizzazione per filtrazione. Il ph del terreno va controllato solo ad avvenuto raffreddamento del terreno. STERILIZZAZIONE IN AUTOCLAVE Per molti terreni di coltura è indicata la sterilizzazione finale in autoclave a 121 C per 15 minuti o, nel caso di volumi superiori a 1 litro, per una durata maggiore che dipende dal volume di KAIROSafe review n. 21, maggio /5

2 terreno. Alcuni componenti sensibili al calore possono essere sterilizzati a 110 C per 15 minuti (es. glucosio). I terreni di coltura contengono una quantità di composti, quali peptidi, zuccheri, sali minerali e metalli che, oltre a venire danneggiati dal calore, possono reagire tra loro in modo inaspettato dando origine a derivati tossici. Per questo è così importante riuscire ad ottimizzare il processo di sterilizzazione, in modo da ottenere terreni che siano sterili ma che al contempo abbiano subito il minimo danno possibile. Il problema principale è dato dal volume di liquido sottoposto a sterilizzazione, in particolare dalla difficoltà di raggiungere la corretta temperatura di sterilizzazione all interno dei volumi più grandi, senza compromettere le caratteristiche del terreno. Per garantire l adeguata penetrazione dal vapore, è consigliato di non sovraccaricare l autoclave e, durante il ciclo, di utilizzare tappi di cotone o simili per chiudere le provette e tappi a vite non serrati per chiudere i flaconi. Il surriscaldamento è una causa molto comune di alterazioni del ph, di brunitura del colore, di precipitazione, di scarsa forza gelificante e di ridotte performance microbiologiche. Questi problemi si rendono evidenti ad esempio quando si sterilizza un terreno in cui gli ingredienti non sono disciolti in modo ottimale e si sono depositati sul fondo del contenitore: interviene la cosiddetta reazione di Maillard, con la conseguente brunitura del terreno. Gli effetti del surriscaldamento si vedono anche quando la sterilizzazione è prolungata, quando i terreni agarizzati vengono fatti gelificare in bottiglia e poi sciolti troppo a lungo col vapore, o quando i terreni sono lasciati a 50 C per più di 3 ore prima dell uso. Particolarmente sensibili al surriscaldamento sono i terreni con ph inferiore a 5.0, poiché l agar viene idrolizzato e la forza dell agar viene meno. I terreni con ph minore di 5.0 andrebbero sottoposti a sterilizzazione separata. C è da dire che non poche difficoltà si verificano quando la sterilizzazione riguarda volumi maggiori ai 2 litri, in questi casi è possibile utilizzare dei preparatori di terreno che rimescolano il liquido nella fase di riscaldamento del ciclo di sterilizzazione. STERILIZZAZIONE PER FILTRAZIONE La sterilizzazione mediante filtrazione può essere eseguita sotto vuoto o in condizioni pressurizzate. La metodica è fortemente consigliata per le formulazioni che contengono sostanze termolabili (es. vitamine). Le membrane o gli elementi dei filtri devono avere pori con diametro 0,22 µm e devono essere sterili, così come tutta l attrezzatura necessaria alla filtrazione. ALLESTIMENTO DEI TERRENI DOPO LA STERILIZZAZIONE I terreni liquidi sterilizzati nel loro contenitore finale dovrebbero essere portati a temperatura ambiente il più rapidamente possibile. Ad avvenuto raffreddamento i tappi a vite vanno serrati. KAIROSafe review n. 21, maggio /5

3 I flaconi contenenti terreno agarizzato dovrebbero invece essere posti in un bagno termostatato a 47 C ± 0,2 C. Quando il terreno ha raggiunto questa temperatura, e comunque al massimo entro 3 ore, è possibile procedere con la distribuzione. E ora il momento di aggiungere i supplementi termolabili preventivamente portati a temperatura ambiente. L aggiunta di supplementi troppo freddi porta alla gelificazione dell agar o alla formazione di flocculi ben visibili all interno del terreno. Quando si tratta di aggiungere sangue occorre che esso sia portato a circa 35 C e che il terreno sia raffreddato a C, inoltre il terreno va rimescolato in un contenitore con apertura larga in modo da garantire al sangue adeguata ossigenazione. E preferibile utilizzare sangue defibrinato piuttosto che trattato con anticoagulanti. Dopo aver rimescolato con attenzione, evitando la formazione di bolle, si dispensa il terreno asetticamente in piastre sterili. Per fondere un terreno agarizzato (al massimo una volta), lo si pone in bagno di acqua bollente o sotto un getto di vapore o si applica qualunque altro procedimento che fornisca identico risultato. L importante è evitare il surriscaldamento. Se occorre disaerare il terreno, è possibile tenerlo per 15 minuti in acqua bollente o sotto getto di vapore con le chiusure allentate. Poi, si richiudono le chiusure e si porta alla temperatura di lavoro 47 C ± 0,2 C. CONTROLLO QUALITÀ DEI TERRENI PRONTI Ogni lotto di terreno preparato in laboratorio è sottoposto a test di controllo per assicurarne la qualità, cioè la capacità di garantire l adeguata crescita del microrganismo target. I test includono la verifica del ph, delle caratteristiche fisiche, test di sterilità, fertilità, selettività e stabilità. Controllo qualità Verifica del ph Verifica delle caratteristiche fisiche Sterilità Fertilità Selettività Stabilità Dettagli Verifica che il valore di ph, determinato dopo il raffreddamento del terreno a C, sia compreso nel range indicato in etichetta Quantità riempita e/o spessore dello strato di agar Colore/omogeneità Chiarezza/presenza di difetti ottici Stabilità/consistenza/umidità del gel Un campione rappresentativo del lotto viene incubato alle condizioni e per il tempo appropriato. Potrebbe rendersi necessaria la sub cultura del terreno liquido per evidenziare una contaminazione non visibile. Non ci deve essere traccia di crescita batterica Verifica dell idoneità del terreno a far crescere il microrganismo target. Il terreno viene inoculato con il ceppo puro di riferimento e, dopo opportuna incubazione, si valuta la crescita delle colonie Verifica dell inibizione della crescita di un microrganismo opportunamente scelto. Il terreno viene inoculato con il ceppo puro di riferimento e, dopo opportuna incubazione, si valuta l inibizione della crescita Si tratta di eseguire periodicamente le procedure suddette sui terreni immagazzinati per verificare se le condizioni di stoccaggio sono ottimali KAIROSafe review n. 21, maggio /5

4 Difetto individuato ph errato Torbidità, precipitazione Colore bruno Possibili cause ph misurato alla temperatura non corretta Contaminazione chimica ph errato Alterazione del ph Presenza di fosfato + zuccheri + agar Contaminazione estranea Gel troppo morbido Agar non disciolto, scarso rimescolamento, tempo prolungato a 50 C durante la preparazione, soprattutto a ph bassi Errore di pesata o di diluizione ph troppo basso causato da idrolisi acida Scarsa crescita batterica Scarsa selettività Presenza di sostanze inibenti nell acqua o nei contenitori Colore scuro o alterazione del ph Errata formulazione o errata aggiunta di supplementi Errata formulazione o errata aggiunta di supplementi CONSERVAZIONE DEI TERRENI PREPARATI La durata della conservazione dei terreni pronti deve essere convalidata in laboratorio. Generalmente i terreni si conservano in frigorifero, eccezion fatta per i flaconi e le provette ben chiusi, che possono essere tenuti a temperatura ambiente lontano da fonti di calore e luce. I terreni agarizzati possono essere sciolti solo una volta prima dell uso. KAIROSafe review n. 21, maggio /5

5 Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: KAIROSafe review n. 21, maggio /5