La struttura delle proteine viene suddivisa in quattro livelli di organizzazione:

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1 Luciferasi Emoglobina Cheratina La struttura delle proteine viene suddivisa in quattro livelli di organizzazione: Struttura primaria Struttura secondaria Struttura terziaria Struttura quaternaria Sequenza aminoacidica eliche (foglietti e ripiegamenti) Catena polipeptidica Disposizione subunità 1

2 La funzione delle proteine può essere compresa analizzando la loro struttura. La struttura delle proteine viene suddivisa in quattro livelli di organizzazione: 1) La struttura primaria è la sequenza amminoacidica di una catena polipeptidica determinata quindi dai legami covalenti ammidici tra gli amminoacidi Con le 20 differenti scelte a disposizione si possono costruire un numero elevatissimo di proteine differenti Una proteina composta da n residui le possibili sequenze sono 20 n Proteina di 100 a.a ,27 x Le proteine (polipeptidi) contengono almeno 40 residui Più piccole si parla di peptidi La catena polipeptidica più lunga è la proteina TITINA residui La maggior parte delle proteine da 100 a 1000 residui Le proteine possono essere costituite da più subunità Alcune proteine vengono sintetizzate in un unica catena polipeptidica e poi vengono tagliate rimanendo legate per alcuni legami covalenti (INSULINA) 2

3 Poiché ciascun tipo di proteina ha una specifica sequenza amminoacidica è logico che la sequenza ha un ruolo fondamentale nel determinare la struttura della proteina e quindi anche la sua funzione. Questo è vero ma non del tutto La disposizione spaziale degli atomi di una proteina è detta CONFORMAZIONE. Le proteine possono assumere vari stati di conformazione (quando una qualsiasi molecola (LIGANDO) lega una proteina ne cambia la conformazione). Quando si trovano in uno degli stati conformazionali funzionale le proteine sono dette NATIVE. STRUTTURA PRIMARIA di una proteina rappresenta la sequenza linere degli amminoacidi STRUTTURA SECONDARIA è la conformazione spaziale assunta a livello locale dagli atomi dello scheletro polipeptidico senza tenere in considerazione la disposizione delle sue catene laterali. STRUTTURA TERZIARIA si riferisce alla distribuzione tridimenzionale degli atomi di un intero peptide, compresa quella delle catene laterali STRUTTURA QUATERNARIA, si riferisce a proteine costituite da più subunità, e indica la disposizione spaziale dell insieme di queste subunità 3

4 RIPIEGAMENTO REGOLARE DELLA CATENA POLIPEPTIDICA Il legame planare peptidico determina la STRUTTURA SECONDARIA R = residuo amminoacidico Φ = 180 Ψ = 180 I sei atomi del gruppo peptidico giacciono sullo stesso piano e l atomo di ossigeno del gruppo carbonilico è in posizione trans rispetto all idrogeno dell azoto ammidico. 4

5 Fattori che determinano la struttura secondaria Il gruppo peptidico L ossigeno carbonilico possiede una parziale carica negativa e l azoto ammidico una positiva, generando un piccolo dipolo elettrico. Configurazione trans, cis porterebbe ad interferenze steriche tra catene laterali, a meno che nel legame peptidico non sia impegnata la pro 5

6 Il termine si riferisce alla conformazione locale di alcune parti di un polipeptide ed è determinata da legami specifici : legami idrogeno tra l ossigeno carbonilico di un legame peptidico e l idrogeno legato all azoto di un altro legame peptidico ed è determinata dalla struttura planare dello stesso LEGAME PEPTIDICO. Φ = 180 Ψ = 180 Il gruppo peptidico possiede una struttura rigida, PLANARE, in conseguenza di interazioni di risonanza che conferiscono al legame peptidico circa il 40% di carattere di doppio legame. Con poche eccezioni, i gruppi peptidici assumono la conformazione TRANS. LEGAME PEPTIDICO CIS E TRANS 6

7 La conformazione della catena principale può essere descritta in termini di ANGOLI DI TORSIONE intorno ai due legami del carbonio in α Φ = angolo di rotazione N Cα Ψ = angolo di rotazione Cα C La libertà di conformazione dello scheletro polipeptidico è sottoposta a limitazioni steriche Atomi a stretto contato che non rispettano le distanze di wan der Waals 7

8 Gli angoli φ e ψ potrebbero assumere tutti i valori compresi tra 180 e -180 ma in realtà alcuni valori sono proibiti a causa di interferenze steriche I valori permessi possono essere riportati su di un grafico in cui ψ viene analizzato in funzione di φ, indagine che va sotto il nome di GRAFICO DI RAMACHANDRAN Influenza dei gruppi laterali s u l l a conformazione del polipeptide Eccezi oni: Conformazione in CIS Pro -35 <Φ <-85 Gly Minori limitazioni La prolina è il residuo con le maggiori restrizioni conformazionali. La glicina è il residuo con minor impedimento sterico e quindi con maggiori possibilità conformazionali 8

9 C (gradi) α L α (gradi) La più semplice disposizione che una catena polipeptidica può assumere con i legami peptidici rigidi è una struttura elicoidale( avvolgimento a spirale): 9

10 Carbonio Idrogeno Ossigeno Azoto Gruppo R Nell α-elica gli atomi di idrogeno dello scheletro sono disposti in modo tale che ogni ossigeno carbonilico del legame C=O di un dato residuo forma un legame idrogeno con l idrogeno amidico N-H di 4 residui più avanti (ansa di 13 atomi). Tutti i CO e gli NH sono impegnati in un legame idrogeno 3,6 residui per giro di elica Passo pari a 5,4 Å Le α eliche nelle proteine hanno in media una lunghezza di 12 residui corrispondenti a 3 giri d elica e circa 18 Å Le catene laterali dei residui amminoacidici sono proiettate verso l esterno e verso il basso. 10

11 Le ramificazioni del carbonio β della valina treonina e isoleucina tendono a destabilizzare l elica a causa del loro ingombro sterico. Anche la serina l aspartato e l asparagina perché contengono gruppi che possono fare legami idrogeno e competere con i gruppi CO e NH della catena principale. La prolina infine destabilizza l elica in quanto priva del gruppo NH. La conformazione β organizza le catene polipeptidiche in foglietti I l foglietto β Anti parallelo Organizzazione sfalsata Gli stessi legami che caratterizzano la struttura ad α elica ma questa volta tra amminoacidi anche molto lontani nella s e q u e n z a amminoacidica Esistono due tipi di foglietto: Il foglietto β antiparallelo Le catene polipeptidiche adiacenti sono unite da legami idrogeno con direzionalità opposta 11

12 Il foglietto β parallelo Il foglietto β parallelo Le catene unite da legame idrogeno hanno la stesso direzionalità E n t r a m b e presentano un aspetto ondulato e pieghettato Questi foglietti contenuti nelle proteine sono formati da un minimo di 5 a un massimo di 22 filamenti polipeptidici. Ciascun filamento può contenere fino a 15 residui. 12

13 I legami che determinano e stabilizzano le strutture secondarie sono i legami idrogeno tra l idrogeno di un gruppo amminico e l ossigeno del gruppo carbossilico di un altro a.a. della stessa catena polipeptidica Ripiegamenti Le catene polipeptidiche possono invertire la loro direzione mediante ripiegamenti o anse e poichè le anse si trovano di solito sulla superficie delle proteine sono solitamente composte da amminoacidi con gruppi R idrofilici 13

14 Le proteine possono essere classificate come FIBROSE O GLOBULARI Le proteine fibrose costituiscono un supporto strutturale alle cellule. L αcheratina è una proteina di sostegno non reattiva sotto il profilo chimico ed è presente in tutti i vertebrati. È la componente principale dello strato epidermico esterno corneo e delle sue appendici correlate quali peli, corna, unghie e piume. L α-cheratina è formata da due eliche destrorse che si avvolgono tra loro formando una superelica sinistrorsa detta avvolgimento avvolto α Ciascuna catena polipeptidica è costituita da ripetizioni di sette residui alcuni dei quali sono idrofobici. I residui idrofobici si associano con quelli dell altra catena e poiché la ripetizione dei residui idrofobici è inferiore al giro di α elica e due catene si ripiegano a formare un avvolgimento avvolto 14

15 La cheratina è ricca di cisteine che formano ponti di-solfuro che consentono di legare catene polipeptidiche adiacenti. CHERATINE DURE più ricche in cisteine (peli, corna unghie) meno flessibili CHERATINE MORBIDE nella cute e nei calli neno ricche in cisteine, più flessibili I ponti disolfuro possono essere scissi per via riduttiva quando vengono trattati con mercaptani. Il collagene è la proteina più abbondante nei mammiferi contiene tre catene polipeptidiche di circa 1000 a.a. dove la GLICINA ricorre ogni tre residui. L interno della superelica formato da tre catene polipeptidiche è molto compatto grazie alla presenza della GLICINA l unico amminoacido che può essere presente all interno di una superelica. Gli altri residui sono : prolina, 4-idrossiprolina (Hyp) ma anche se in quantità minore 3-idrossiprolina e 5-idrossilisina(Hyl) Questi residui si formano dopo la sintesi proteica per azione della prolina idrossilasi enzima che richiede acido ascorbico per la sua attività. SCORBUTO malattia dovuta all assenza di vitamina C nella dieta colpisce il collagene dei tessuti connettivi 15

16 Il grande numero di proline impediscono la formazione dell α-elica. Il polipeptide del collagene assume una struttura ad elica sinistrorsa con circa 3 residui per giro. Tre catene si avvolgono in una avvolgimento destrorso per dare origine alla struttura a tripla elica del collagene 16

17 SINGOLA CATENA POLIPEPTIDICA La struttura terziaria di una proteina descrive il ripiegamento dei suoi elementi strutturali secondari (α eliche e β foglietti ripiegati) e specifica la posizione nello spazio di ogni atomo della molecola proteica. 17

18 Nelle proteine globulari le catene laterali degli a.a. sono distribuite spazialmente in base alla loro polarità: Residui non polari (Val, Leu, Ile, Met e Fhe : si trovano prevalentemente nella parte interna della proteina al di fuori del contatto con il solvente acquoso I residui polari carichi (Arg, His, Lys, Asp e Glu): sono localizzati sulla superficie della proteina in contatto con il solvente acquoso Residui polari non carichi (Ser, Thr, Asp, Gln e Tyr) solitamente si trovano sulla superficie proteica ma anche nella parte interna a formare legami idrogeno con altri gruppi. La struttura terziaria è stabilizzata da forze elettrostatiche tra residui amminoacidici, anche molto lontani nella sequenza amminoacidica. Le interazioni tra le catene laterali amminoacidiche indirizzano il ripiegamento del polipeptide e la conseguente formazione di una struttura compatta Gli ioni metallici Zinco Interazioni idrofobiche Legami ad idrogeno Interazioni ioniche Interazioni elettrostatiche Legami disolfuro 18

19 Un ulteriore legame che determina la struttura terziaria è IL LEGAME DISOLFURO che avviene tra due cisteine. REAZIONE REDOX Denaturazione e ripiegamento delle proteine Un ulteriore legame che determina la struttura terziaria è IL LEGAME DISOLFURO che avviene tra due cisteine. REAZIONE REDOX 19

20 La struttura terziaria è f o r m a t a d a l l e combinazioni degli elementi secondari strutturali. L ordine con cui sono organizzate le strutture secondarie determina il criterio di classificazione delle proteine globulari βαβ Forcina β αα In numerose proteine globulari si riscontrano determinati raggruppamenti di elementi strutturali secondari denominati STRUTTURE SUPERSECONDARIE O MOTIVI 20

21 Citocromo b 562 Immunoglobulina Lattato Deidrogenasi α proteine β proteine α/β proteine I polipeptidi di grandi dimensioni, contenenti più di 200 residui, solitamente formano strutture supersecondarie o DOMINI che conferiscono a queste strutture un aspetto bi o plurilobato I domini sono le unità fondamentali e funzionali della struttura terziaria. Unità strutturalmente indipendenti che possiedono le caratteristiche di piccole proteine globulari 21

22 Molte proteine, con massa superiore a 100 KD, sono costituite da più catene polipeptidiche, chiamate SUBUNITA. La struttura quaternaria definisce la disposizione spaziale di queste subunità che sono unite attraverso quelli stessi legami che definiscono la struttura terziaria. L aumento della grandezza di una proteina attraverso l associazione di subunità identiche è un procedimento più efficiente rispetto all aumento della lunghezza della catena polipeptidica, poiché ciascuna subunità possiede un propria attività. Ancora più rilevante è il fatto che la presenza di più subunità in numerose proteine pone le basi strutturali per la regolazione della loro attività. 22

23 Interazioni tra domini, subunità, formazione di complessi Le subunità si associano attraverso legami non covalenti. Le regioni di contatto tra subunità ricordano la porzione interna di una proteina costituita da una singola subunità. Le proteine sono stabilizzate da diverse forze: Effetto idrofobico Questo effetto fa si che le sostanze non polari riducano al minimo i loro contati con l acqua e rappresenta l elemento preponderante per la stabilità della struttura nativa di una proteina. Interazioni elettrostatiche Forze di wan der Waals Legami idrogeno Associazione di gruppi ionici (ponte salino) Legami disolfuro tra cisteine 23

24 1) effetto idrofobico 2) legami idrogeno 3) forze di van der Walls 4) Interazioni elettrostatiche Forze che stabilizzano la struttura delle proteine Molecola non polare Molecola non polare Molecola non polare Molecola non polare Molecola non polare Fattori chimico-fisici che influenzano la struttura delle proteine LA SERIE DI HOFMEISTER cosmotropici stabilizzanti destabilizzanti caotrop (salting out) (salting in) La stabilità conformazionale delle proteine dipende dai seguenti fattori: 1) Temperatura; 2) Variazioni di ph, 3) Presenza di detergenti; 4) Presenza di agenti caotropici o cosmotropici. Anioni: Cationi: SOLUTI INTRACELLULARI CHE HANNO EFFETTO SULLA STABILIZZANTI STRUTTURA N-ossido-trimetilamina Betaina Sarcosina Aminoacidi Taurina Glicerolo (TMAO) Ottopina DESTABILIZZANTI Urea Arginina Guanidino 24

25 Denaturazione e ripiegamento delle proteine [Proteina denaturata], % nativa denaturata Rottura dei legami deboli che determinano la struttura proteica [denaturante] Perdita delle strutture secondarie, terziarie e quaternarie, se esistono, mediante un agente denaturante Denaturazione e ripiegamento delle proteine % F Temperatura (C ) % proteina denaturata [urea], M Quando una soluzione di Ribonucleasi A viene trattata con urea 8M la proteina denatura: si rompono tutti i legami elettrostatici rimangono solo i 4 ponti disolfuro intracatena 25

26 Denaturazione e ripiegamento delle proteine Quando la stessa proteina viene trattata con urea 8M i presenza di β- mercaptoetanolo si rompono ossidativamente anche i 4 ponti disolfuro. In entrambi i casi la proteina DENATURATA non è più funzionante. La ribonucleasi A perde la sua attività catalitica. Se dalla soluzione vengono allontanati attraverso dialisi i due denaturanti la proteina ripiega spontaneamente nella sua forma cataliticamente ATTIVA. RINATURAZIONE - Strutturali - Di trasporto - Di protezione e difesa - Di controllo e regolazione - Di movimento - Di riserva - Catalitiche: ENZIMI 26

27 1) Le proteine fibrose, di origine animale, con prevalente funzione meccanica: cheratina, collageno, elastina, fibroina, actina, miosina, ovomucina; 2) Proteine globulari, tutte le altre; 1) Proteine semplici, se dalla loro idrolisi si ottengono solo amminoacidi. La composizione elementare di queste proteine è abbastanza regolare: C 50%, O 23%, N 16%, H 7%, S max 3%; 2) Proteine coniugate, oltre alle catene polipeptidiche contengono COFATTORI, legati covalentemente o non. Cofattori 27

28 Nelle cellule le proteine costituiscono oltre il 50% della sostanza secca. Esse rappresentano il 14-18% dell'organismo animale. Grazie alla elevata dinamicità delle strutture proteiche (gli atomi sono in continuo movimento fluttuante) e per la capacità che hanno di legarsi in modo selettivo ad altre molecole, le proteine svolgono un numero elevato di funzioni (classificazione): Modulazione dell'espressione genica e intervengono nella duplicazione, trascrizione e traduzione del DNA; Regolano il metabolismo, sia come enzimi, sia come ormoni (insulina, glucagone, ecc.) Trasportano diverse molecole; Proteggono l'organismo dalle infezioni (anticorpi); Danno luogo a strutture contrattili (actina, miosina, ecc.); Sono coinvolte nella trasmissione degli impulsi nervosi (recettori dell'acetilcolina, ecc.); Intervengono nella coagulazione del sangue; Costituiscono la struttura dei tessuti di sostegno animali (collageno, cheratina, elastina, ecc.) Sono forme di deposito di principi nutritivi a cui attingono l'embrione animale o vegetale (ovoalbumina, caseina, gliadina, ecc.) 28