Platelets. Lifespan in peripheral blood 7-10 days Range x 10 9 /l

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1 Platelets Lifespan in peripheral blood 7-10 days Range x 10 9 /l

2 Contatori Automatici Numero piastrine circolanti Conta manuale al microscopio Valori normali: /mmc Piastrinopenia < VN > Piastrinosi

3 METODI USATI PER IL CONTEGGIO AUTOMATICO DELLE PIASTRINE CITOFLUORIMETRICO IMPEDENZOMETRICO ELETTRO OTTICO

4 Conta piastrinica Conta Ottica PLTo Conta ad impedenza PLTi

5 Metodo impedenziometrico Piastrine : Istogramma volumetrico PL = soglia inferiore, PU = soglia superiore, PDW = platelet distribution width (larghezza della curva tagliata al 20%), P-LCR = platelet large cell ratio (percentuale di grandi piastrine). MPC = Mean PLT Contenent (misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine)

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7 MPV Più alto negli uomini Correlazione inversa non lineare fra MPV e N.ro PLT Aumenta in corso di: corso di: Diabete mellito IMA Arteriopatie Periferiche Malattie mieloproliferative Pre-eclampsia Splenectomia Diminuisce in Leucemia Acuta An. Megaloblastica

8 PDW Indica l'anisocitosi piastrinica. Aumenta in corso di: An. Megaloblastica An. Aplastica AREB (anemia refrattaria con eccesso di blasti) LMC In presenza di crioglobuline e paraproteine

9 MPC E' misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine, fornisce indicazioni su: Morfologia, Attivazione, Screening. Di conseguenza utile per: monitoraggio terapie antiaggreganti monitoraggio terapie antinfiammatorie

10 Classification of Platelet Disorders Quantitative Disorders Qualitative Disorders Abnormal distribution Dilution effect Decreased production Increased destruction Inherited disorders (rare) Acquired disorders Medications Chronic renal failure Cardiopulmonary bypass

11 Quantitative Abnormalities 1 Thrombocytopenia - Decreased count <100 x 10 9 /l - Increasing risk of bleeding in major surgery <50 x 10 9 /l - Increasing risk of bleeding for CID and surgery <10-20 x 10 9 /l - Increasing risk of spontaneous bleeding Causes Immune BM infiltration, chemotherapy etc Inherited defects

12 Quantitative abnormalities 2 Thrombocytosis - Increased count > 450 x 10 9 /l Reactive eg infection inflammation Chronic bleeding Haematological malignancy

13 INTERFERENZA NELLA CONTA PIASTRINICA Frammenti eritrocitari Frammenti di globuli bianchi Parassiti, batteri Ombre eritrocitarie Piastrine giganti Aggregati piastrinici Effetto da anticoagulante

14 Cause più comuni di conta piastrinica erronea nel paziente ematologico AGGREGATI PIASTRINICI CAUSA FREQUENTE DI CONTA SOTTOSTIMATA Sono epressione dell agglutinazione piastrinica in vitro da parte di autoanticorpi IgG EDTA- e temperatura dipendenti Crioagglutinine EDTA dipendenti IgG EDTA- dipendenti e temperatura indipendenti Gli AUTOANTICORPI EDTA DIPENDENTI interagiscono con antigeni criptici della glicoproteina II b, smascherati dalla chelazione del calcio da parte dell EDTA

15 Qualitative defects Count may be normal/low/high May be no apparent abnormality on film May show changes eg size, appearance etc Functionality is variably affected May be inherited or acquired

16 CAUSE PRINCIPALI DI TROMBOCITOPATIE I. DIFETTI DI ADESIONE: Sindrome di Bernard-Soulier Malattia di Von Willebrand II. DIFETTI DI AGGREGAZIONE: Tromboastenia di Glanzmann III. DIFETTI DI SECREZIONE: Difettiva attività di ciclo-ossigenasii (congenita; da assunzione di aspirina e altri FANS) Alterata biogenesi dei granuli ( storage pool defects ; sindrome di Chediack-Higashi) IV. DIFETTI DOVUTI A FARMACI (calcio antagonisti, anestetici, certi antibiotici)

17 PIASTRINOPATIE ACQUISITE PORPORA / EMORRAGIE SENZA PIASTRINOPENIA - FARMACI (ASPIRINA, FANS, ecc) - INSUFFICIENZA RENALE CRONICA - GAMMAPATIE MONOCLONALI

18 FUNZIONALITA PIASTRINICA Tests di laboratorio IN VIVO TEMPO DI EMORRAGIA ANAMNESI OSSERVAZIONE CLINICA IN VITRO AGGREGAZIONE PIASTRINICA utile x monitoraggio terapie antiaggreganti

19 INDAGINI FUNZIONALI NELLE PIASTRINOPATIE: Aggregometrtria Dosaggio VWF Espressione di proteine di superficie

20 Aggregometria ottica

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22 Test di valutazione della cascata coagulativa plasmatica

23 Il plasma (addizionato di sodio citrato) viene ottenuto per centrifugazione ed utilizzato per misurare il tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando al plasma del paziente si aggiungono reattivi differenti per ciascun test.

24 Test 1 : 9 (4,5 ml) PT (%) Rapporto Anticoagulante (0,5 ml) : sangue 90 (12,7 sec.) 1 : 8 (4,0 ml) 83 (13,3 sec.) 1 : 7 (3,5 ml) 64 (15,7 sec.) 1 : 3 (1,5 ml) 5 (148,7 sec.) PTT (sec.) 19,5 20,2 22,2 87,3 FIBRINOGENO (mg/dl)

25 Metodi di studio globali per il sistema della coagulazione (I) Il Tempo di Protrombina o Attività Protrombinica (PT) e il Tempo di Tromboplastina Parziale Attivato (aptt) indagano rispettivamente la Via Estrinseca (PT) e la Via Intrinseca (aptt) e ambedue indagano la Via comune della coagulazione (FV, FX, FII e fibrinogeno). Dosaggio del Fibrinogeno Tempo di Trombina (TT)

26 Metodi di studio globali per il sistema della coagulazione (II) La contemporanea esecuzione di PT e aptt permettera di escludere o di confermare la presenza di un alterazione del sistema di coagulazione e di orientare le successive indagini verso l identificazione di uno o più fattori della coagulazione che potrebbero essere carenti. Dosaggio del Fibrinogeno L esecuzione del TT risulta necessaria per indagare il sistema della coagulazione in presenza di fibrinogeno con concentrazione inferiore a 100 mg/dl.

27 Tempo di Protrombina (TP) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato e trattato con tromboplastina a 37 C. Refertazione: % = TP controllo normale / TP paziente x 100 RATIO = TP paziente/ TP controllo normale INR

28 Tempo di protrombina (PT) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II) e fibrinogeno (I). Monitoraggio della terapia anticoagulante orale con dicumarolici (INR) I dicumarolici inibiscono l attivita dei fattori VII, IX, X e della protrombina. PT corto --> - privo di significato patologico PT lungo --> - epatopatia. - deficit vitamina K - CID - sindrome nefrotica - farmaci

29 Poiché il PT viene comunemente utilizzato per il monitoraggio della terapia anticoagulante orale, si è reso necessario individuare un sistema di espressione che consentisse di interpretare il risultato del PT in maniera univoca, minimizzando le differenze dovute alla diversa sensibilità dei diversi reagenti commerciali utilizzati per l effettuazione di questo test: International Normalized Ratio (INR) INR = ( PT del paziente in secondi PT del Pool di plasmi normali in sec ) ISI ISI = International Sensitivity Index

30 How Different Thromboplastins Influence the PT Ratio and INR Thromboplastin reagent Patient s PT (Seconds) Mean Normal (Seconds) PTR ISI INR A B C D E

31 PT si allunga per livelli di fattore Fatt. VII < 50% Fatt. V < 50% Fatt. X < 50% Fatt.II < 30% Fibrinogeno Paraproteine Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina < 100 mg/dl Cause di errore Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

32 Test COAGULATIVI (II) aptt - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di sostituti del fattore piastrinico 3 (cefalina) associati ad attivatori della fase di contatto (ac.ellagico, silice micronizzata, caolino) studia la via intrinseca e la via comune della coagulazione. Misurato in secondi o come ratio

33 aptt: espressione dei risultati aptt paziente Ratio = aptt plasma di controllo Plasma di controllo Plasma di controllo Plasma liofilo o pool di plasmi normali Media del range di riferimento Limite superiore del range di riferimento Mediana di 20 soggetti normali Valore basale

34 TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (aptt) Deficit congeniti o acquisiti dei fattori della via intrinseca (VIII/IX/XI) o della fase di contatto (XII) Con minor sensibilita del PT, indaga i deficit dei fattori della via comune (X,V,della protrombina e del fibrinogeno) Monitoraggio della terapia con eparina standard Presenza di Lupus Anticoagulant (LAC)

35 aptt si allunga per livelli di fattore VIII < 50% XI < 50% IX < 30% XII < 30% Fibrinogeno Livelli di eparina < 100 mg/dl U/mL Cause di errore Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

36 TEMPO DI TROMBINA TT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di concentrazioni ottimali di trombina studia la fibrino-formazione

37 IMPIEGO DEI TEST DI SCREENING NELL ESPLORAZIONE DELL EMOSTASI PT APTT TT IPOTESI DIAGNOSTICA Normale Allungato Normale Deficit di FXII, FXI, FIX, FVIII Allungato Normale Normale Deficit di FVII Allungato Allungato Normale Deficit di fibrinogeno, protrombina, FV, FX Allungato Allungato Allungato Deficit di fibrinogeno, FDP, antitrombinici

38 Meccanismi di controllo della coagulazione Come tutti i sistemi che vanno incontro ad un meccanismo di attivazione, anche il sistema della coagulazione necessita di un sistema di controllo. Tale sistema è rappresentato da proteine dotate di attività inibitoria, fra le quali: Antitrombina (AT) Proteina C (PC) Proteina S (PS) Deficit di queste proteine rappresentano un fattore di rischio per l insorgenza della malattia trombotica

39 INIBITORI PLASMATICI DELLA COAGULAZIONE ANTITROMBINA: serpina, serin protease inhibition, è sintetizzata dal fegato ed è dotata di un effetto inibitore dei fattori serin proteasici, FIIa, FXa, FIXa, FXIa, FXIIa. Le eparine, tramite il loro legame con la AT sono in grado di accelerare grandemente le reazioni di inibizione dell AT sui fattori. COFATTORE EPARINICO II: in presenza di eparina ha azione anti-trombinica non legata all AT. PROTEINA C: prodotta dal fegato, è K-dipendente. In presenza di trombina, ioni Ca e trombomodulina, viene attivata. L APC inibisce il FVa ed il FVIIIa, stimola la fibrinolisi e protegge l attivatore tessutale del plasminogeno. PROTEINA S: glicoproteina K-dipendente sintetizzata dal fegato, dll endotelio e dai megacariociti. Circa il 40% della PS funge da cofattore della APC ed è in grado di degradare il FVa e FVIIa

40 inibitore sede di sintesi target AT-III fegato trombina, Xa Proteina C fegato Va, VIIIa Proteina S fegato proteina C

41 VALUTAZIONE DEGLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE Metodi immunologici e funzionali Dosaggio ATIII Test di resistenza alla proteina C Variazione fisiologiche ( gravidanza) Influenze farmacologiche (es: estroprogestinici, antivitamine k) Fattori genetici (trombofilia eredofamiliare)

42 Lo studio trombofilico: ESAMI DI I LIVELLO ESAMI DI II LIVELLO ESAMI DI III LIVELLO

43 ESAMI DI I LIVELLO: PT aptt FIBRINOGENO AT TT

44 ESAMI DI II LIVELLO LAC PROTEINA C TEST DI RESISTENZA ALLA PC ATTIVATA PROTEINA S

45 ESAMI DI III LIVELLO Test molecolare per l identificazione di mutazioni

46 HEREDITARY THROMBOTIC RISK FACTORS Factor V Leiden mutation Prothrombin mutation Protein C deficiency Protein S deficiency Antithrombin deficiency

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48 Real time PCR apparatus

49 Frequenze di due comuni polimorfismi di fattori della coagulazione nella nostra popolazione di controllo (Area metropolitana di Palermo)

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51 La coagulazione Intravascolare disseminata (CID) Sequenza degli eventi: Attivazione incongrua della cascata coagulativa Consumo massivo di fattori della coagulazione Formazione di microtrombi e microemboli Sindrome emorragica

52 Coagulazione Intravascolare Disseminata (CID) 1. all emocromo avremo calo continuo delle piastrine, anche nel giro di minuti!! 2. fibrinogeno ed ANTI TROMBINA III che si consumano e si riducono velocemente; 3. dimostrazione di monomeri di fibrina; 4. Prodotti di degradazione del Fibrinogeno 5. D-Dimero 6. Tempo di Quick che si riduce; 7. PTT che aumenta 8. Riduzione dei fattori V = Trombina 9. Riduzione del fattore VIII

53 Meccanismi di attivazione dell emostasi La fibrinogenolisi (fdp) I prodotti di degradazione del fibrinogeno derivanti dall azione della plasmina Attivazione della fibrinolisi Per azione della plasmina sul fibrinogeno, si formano i prodotti di degradazione X, Y, D ed E (fibrinogenolisi). Questi possiedono attività inibente la trasformazione del fibrinogeno in fibrina. La loro presenza è indice di iperfibrinolisi (es. CID) Plasmina Fibrinogeno Fibrina s Fibrina I (coagulo) fdp X, Y, D, E

54 Meccanismi di attivazione dell emostasi La fibrinogenolisi (fdp) I prodotti di degradazione della fibrina derivanti dall azione della plasmina Attivazione della fibrinolisi Per azione della plasmina sulla fibrina, si formano diversi prodotti, fra i quali il più importante è il D-Dimero. La sua presenza segnala depositi di fibrina e quindi è indice di possibile stato trombotico ed ischemico. L attività fibrinolitica evidenziata tramite la determinazione del DD è un fenomeno riscontrabile molto precocemente, quando altri indici sono ancora compensati. E l unico parametro che evidenzi la formazione di fibrina. Plasmina Fibrinogeno Fibrina s Fibrina I (coagulo) fdp (D-Dimero)

55 Reasons for elevated D-dimer Fibrinogen Fibrin D-dimer Increased fibrin formation Increased fibrinolysis Decreased clearance

56 Uso del D-Dimero nella diagnosi della trombosi venosa profonda e dell embolia polmonare I metodi per il dosaggio del D-Dimero hanno un elevata sensibilità ma bassa specificità e vengono utilizzati per il loro ELEVATO VALORE PREDITTIVO NEGATIVO. Un valore elevato di D-Dimero non è diagnostico per la trombosi venosa o l embolia polmonare, mentre un risultato normale esclude il sospetto di tali patologie