Leucofiltrazione prestorage: influenza sui livelli delle citochine

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1 Leucofiltrazione prestorage: influenza sui livelli delle citochine Donato Dimonte (1), Luciano Cazzato (1), Giovanni Poliseno (1), Immacolata Silletti (1), Luigi Ciancio (1), Maria Pepe (1), Maria Tursellino (1), Giuseppe Ricciardi (1), Antonio Vaira (2), Annamaria D'Aprile (2), Claudia Citarella (1) (1) U.O.Medicina Trasfusionale - Azienda Ospedaliera Policlinico Bari - C.R.C.C. (2) Laboratorio Ematologia - Azienda Ospedaliera Policlinico - Bari The leucocytes present in red cell and platelet components have been implicated in several important immunological and infective complications of blood transfusion. Cytochines are related to some adverse reactions such as febrile non-haemolytic reaction. The efficiency of prestorage leucodepletion of blood on the production of cytochines was compared in three groups of non filtered and filtered blood. All filters conformed to the current standards for white cell reduction. We have evaluated IL-8,IL-6,IL-1β, TNF-α within platelet at days 0,1,2,3,4,5 and within red cells at days 0,1,3,7,14. The increase of the cytokine level is significant, during storage,only for IL-8. We have dimostrated that accumulation of IL-8 is proportional to the leucocyte content in the platelet and red cell concentrates and that prestorage leucodepletion reduced the cytokine levels in the blood component. The benefits of prestorage leucoreduction include also more consistent quality and, potentially, a diminished risk of alloimmunization for leucocyte fragmentation. Parole chiave: citochine, concentrati piastrinici, globuli rossi concentrati, leucodeplezione in linea Key words: cytochines, platelet concentrates, red cell concentrates, prestorage leucodepletion Introduzione La leucodeplezione è diventata in Medicina Trasfusionale una tecnica ampiamente utilizzata. Le maggiori organizzazioni scientifiche internazionali concordano ormai sulla necessità di una "leucodeplezione totale" in quanto la rimozione dei leucociti apporta vantaggi clinici notevoli ai pazienti 1. L'uso di emocomponenti leucodepleti infatti può: - prevenire l'alloimmunizzazione HLA e conseguente refrattarietà piastrinica, - prevenire la trasmissione di citomegalovirus (CMV), - prevenire l'immunomodulazione, - prevenire la trasmissione di virus (diversi dal CMV), - prevenire la trasmissione della malattia di Creutzfeldt- Jakob (CJD), - prevenire la riattivazione virale, - prevenire la GvHD, - prevenire la Transfusion Related Acute Lung Injury (TRALI), - ridurre la frequenza di reazioni febbrili non emolitiche (FNH) caratterizzate da ipotensione,rush cutaneo, ecc. Quest'ultima reazione è dovuta prevalentemente alle citochine ad attività pirogena e proinfiammatoria, rilasciate dai leucociti durante la conservazione dei globuli rossi o delle piastrine. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare l'efficienza della filtrazione in linea prestorage nella rimozione dei leucociti dal sangue intero o da emazie concentrate e piastrine e verificare se la rimozione degli stessi incide sui livelli di citochine nei suddetti emocomponenti. Questo elaborato è stato oggetto di una comunicazione al XXXIV Convegno Nazionale di Studi di Medicina Trasfusionale (Rimini, giugno 2000) che ha ottenuto il Premio Mazzingo Donati Corrispondenza: Dott. Donato Dimonte I Traversa Leonida Bissolati 1/A Bari Materiali e Metodi In questo studio sono state analizzate n 36 sacche di sangue raccolte da donatori suddivise nei seguenti 3 gruppi. LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 5 settembre - ottobre 2000 ( ) 281

2 D Dimonte et al. 1 Gruppo Le unità di sangue (n 12 ) sono state prelevate in sacche quadruple Maco Pharma (Maco Pharma Italia, Rho, MI), sottoposte,entro 4 ore dal prelievo,ad una prima centrifugazione a bassa velocità (eseguita con centrifuga refrigerata Cryofuge 8500 Heraeus, (Heraeus Instruments GHBH, Hanau, Germany) per 10' a 22 C e separate mediante estrattore Bagpress (Bioelectronica Srl, Milano) in plasma ricco di piastrine (PRP), buffy-coats e globuli rossi concentrati sospesi in SAG-M. Successivamente dal PRP, mediante una seconda centrifugazione ad alta velocità per 5' a 22 C, sono stati ottenuti i concentrati piastrinici che sono stati conservati,in agitazione continua, ad una temperatura controllata (22 C) per un massimo di 5 giorni (PLT B4100 platelet incubator, BioItalia, Milano). 2 Gruppo Le unità di sangue (n 12) sono state prelevate con sacche (Compoflex Biofil, Medolla, Modena)con filtro in linea NPBI utilizzando il sistema Camposeal per mantenere le sacche ad una temperatura costante di 4 C per almeno 2 ore. Dopo tale tempo sono state filtrate e centrifugate ad alta velocità per 10' a 4 C e separate con estrattore Bagpress (Bioelectronica) in plasma e globuli rossi concentrati in SAG-M. 3 Gruppo Le unità di sangue (n 12 ) sono state prelevate con sacche quadruple con doppio filtro in linea (Leukotrap RCPL Pall, Pall Italia Srl, Milano) centrifugate a bassa velocità per 10' a 22 C e filtrate durante la separazione,che è stata effettuata con estrattore Bagpress (Bioelectronica). Il PRP poi è stato ricentrifugato ad alta velocità per 5' a 22 C per ottenere concentrati piastrinici che sono stati conservati in agitazione continua e a temperatura controllata (22 C) per un massimo di 5 giorni. I globuli rossi concentrati sono stati sospesi in SAG- M. Il campionamento è stato effettuato sterilmente utilizzando sacche satelliti e saldatore sterile (SCD 312 Terumo, Terumo Europe Rome Branch, Roma). I globuli rossi concentrati dei 3 gruppi sono stati campionati al termine della fase di produzione (T0) per il dosaggio delle citochine (IL-8, IL-6, IL-1β, TNF-α) e per la determinazione del numero dei leucociti residui, e, nei giorni successivi (T1, T3, T7, T14), per il solo dosaggio delle citochine. I concentrati piastrinici appartenenti al 1 e 3 gruppo sono stati campionati al termine della fase di produzione (T0) per il dosaggio delle citochine (IL-8, IL-6, IL-1β, TNF-α) e per il dosaggio dei leucociti residui,e a distanza di 24 ore nei 5 giorni successivi (T1, T2, T3, T4, T5) per il dosaggio delle solo citochine. Per il dosaggio delle citochine, i campioni di circa 8 ml sia di globuli rossi che di piastrine concentrate sono stati centrifugati a x g per 15' e il plasma sovranatante è stato raccolto e conservato a -80 C fino al momento dell'analisi. I dosaggi delle citochine sono stati effettuati utilizzando kit Elisa (Qantikine, RD Systems, Wiesbaden, Hortenstadt, Germany). I leucociti residui sono stati analizzati con il Citofluorimetro IMAGN 2000 (Immucor Italia Srl, Noverasco di Opera, MI). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test di Wilcoxon. Risultati Delle quattro citochine dosate, l'unica a mostrare un significativo incremento durante il periodo di conservazione delle unità di sangue è l'il-8 nelle sacche di sangue non filtrate. I risultati relativi al dosaggio della IL-8 nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi di sacche prese in considerazione sono mostrati in figura 1 (i valori, riportati anche in tabella III, sono la media ± ESM di dodici determinazioni per gruppo). I livelli di IL-8 nei concentrati eritrocitari ottenuti da sacche di sangue filtrate (filtri Pall e Biofil) non aumentano durante il periodo di conservazione delle sacche. I concentrati eritrocitari ottenuti da sacche di sangue non filtrate, invece, mostrano un significativo aumento della citochina già al tempo T1 rispetto al T0; questi valori restano, poi, elevati fino al tempo T14 (T1, T3, T7, T14 versus T0 p<0,05). I risultati relativi al dosaggio della IL-8 nei concentrati piastrinici dei due gruppi di sacche prese in considerazione sono mostrati in figura 2 (i valori, riportati anche in tabella IV, sono la media ± ESM di dodici determinazioni per gruppo). Come nei concentrati eritrocitari, anche nei concentrati piastrinici i valori di IL-8 delle sacche non filtrate aumentano significativamente a partire da T2 ( T2, T3, T4, T5 versus T0, p<0,05),con un picco al giorno 5, mentre nelle sacche filtrate (filtri Pall) non si evidenzia un significativo aumento. Nelle figure 3, 4, 5, 6, 7, 8 sono mostrati i livelli, durante la conservazione, delle altre citochine (Il-6, IL-1β, TNF-α) sia nei concentrati eritrocitari che nei concentrati piastrinici. Non c'è differenza significativa dei valori delle citochine ai vari tempi considerati rispetto al T0. (Tabelle V-VI-VII-VIII-IX-X). Nelle tabella I sono mostrate le medie ± ESM dei valori ottenuti dalla conta dei leucociti nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi. I valori indicano che mentre le unità non filtrate,prive di buffy-coat, mantengono livelli di leucociti elevati, le sacche filtrate (sia con filtri Pall che con filtri Biofil) hanno, dopo filtrazione, una quantità di leucociti molto ridotta (< 0,55µL). La tabella II riporta, invece, i 282

3 Leucofiltrazione prestorage e citochine Tabella III: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-8 nei concentrati eritrocitari T0 T1 T3 T7 T14 non filtrate 3,37 ±1,64 20,76 ± 5,9* 146,35 ± 81,3* 109,27 ± 26,36* 119,69 ± 44,22* filtro singolo 10,859 ± 10,82 1,69 ± 1,65 1,134 ± 1,13 0,736 ± 0,31 5,826 ± 2,54 filtro doppio 2,08 ± 0,98 3,12 ± 2,13 1,41 ± 0,7 3,84 ± 1,46 10,31 ± 6,31 * p<0,05 vs T0 V.N. <31,12 pg/ml Figura 1: livelli di IL-8 nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi di sacche prese in esame valutati dopo uno, tre, sette e quattordici giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo * p<0,05 vs T0 Figura 2: livelli di IL-8 nei concentrati piastrinici dei due gruppi di sacche prese in esame valutati a distanza di 24 ore per cinque giorni dalla donazione. I valori sono la Media ± ESM di dodici determinazioni per gruppo * p<0,05 vs T0 283

4 D Dimonte et al. Figura 3: livelli di IL-6 nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi di sacche prese in esame valutati dopo uno, tre, sette e quattordici giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo Figura 4: livelli di IL-6 nei concentrati piastrinici dei due gruppi di sacche prese in esame valutati a distanza di 24 ore per cinque giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo Figura 5: livelli di IL-1β nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi di sacche prese in esame valutati dopo uno, tre, sette e quattordici giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo 284

5 Leucofiltrazione prestorage e citochine Figura 6: livelli di IL-1β nei concentrati piastrinici dei due gruppi di sacche prese in esame valutati a distanza di 24 ore per cinque giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo Figura 7: livelli di TNFα nei concentrati eritrocitari dei tre gruppi di sacche prese in esame valutati dopo uno, tre, sette e quattordici giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo Figura 8: livelli di TNFα nei concentrati piastrinici dei due gruppi di sacche prese in esame valutati a distanza di 24 ore per cinque giorni dalla donazione. I valori sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo 285

6 D Dimonte et al. Tabella IV: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-8 nei concentrati piastrinici T0 T1 T2 T3 T4 T5 non filtrate 1,95±1,47 9,33±1,7 26,06±4,42* 133,49±40,53* 286,56±69,63* 418,44±137,85* filtro doppio 2,02±0,84 5,48±3,1 4,66±2,85 5,86±3,18 5,23±2,87 10,54±8,4 * p<0,05 vs T0 V.N. <31,12 pg/ml Tabella V: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-6 nei concentrati eritrocitari T0 T1 T3 T7 T14 non filtrate 0,45 ± 0,14 0,53 ± 0,3 0,79 ± 0,37 0,28 ± 0,13 0,38 ± 0,21 filtro singolo 2,07 ± 1,88 0,52 ± 0,27 0,53 ± 0,23 0,1 ± 0,06 0,06 ± 0,06 filtro doppio 0,93 ± 0,53 0,51 ± 0,18 0,78 ± 0,28 0,22 ± 0,08 0,13 ± 0,1 V.N. <3,13 pg/ml Tabella VI: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-6 nei concentrati piastrinici T0 T1 T2 T3 T4 T5 non filtrate 0,8 ± 0,34 1,34 ± 0,45 1,81 ± 0,42 4,63 ± 1,6 5,24 ± 1,73 3,86 ± 3,45 filtro doppio 0,87 ± 0,43 1,44 ± 0,28 0,99 ± 0,13 1 ± 0,28 1,11 ± 0,27 0,77 ± 0,27 V.N. <3,13 pg/ml Tabella VII: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-1β nei concentrati eritrocitari T0 T1 T3 T7 T14 non filtrate 2,63± 1,25 1,23± 0,54 1,26± 0,42 3,14± 1,55 3,1± 1,5 filtro singolo 2,38± 1 1,44± 0,39 2,17± 0,36 1,59± 1,26 1,28± 1,2 filtro doppio 2,03± 0,52 1,89± 0,62 2,27± 0,66 1,58± 0,92 2± 0,8 V.N. <3,9 pg/ml Tabella VIII: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo IL-1β nei concentrati piastrinici T0 T1 T2 T3 T4 T5 non filtrate 0,14 ± 0,09 0,36 ± 0,12 0,54 ± 0,21 1,63 ± 0,41 3,09 ± 1,1 5,01 ± 2,45 filtro doppio 0,12 ± 0,06 0,57 ± 0,1 0,75 ± 0,3 0,62 ± 0,21 0,6 ± 0,23 2,21 ± 0,91 V.N. <3,9 pg/ml 286

7 Leucofiltrazione prestorage e citochine Tabella IX: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo TNF-α nei concentrati eritrocitari T0 T1 T3 T7 T14 non filtrate 2,06±0,87 0,9±0,38 0,98±0,59 0,18±0,08 0,99±0,1 filtro singolo 1,54±1 0,81±0,67 0,91±0,5 1,63±1,46 2,1±1,3 filtro doppio 4,38±2,6 2,13±0,86 0,58±0,22 0,55±0,09 1±0,1 V.N. <15,6 pg/ml Tabella X: i valori sono la media±esm di dodici determinazioni per gruppo TNF-α nei concentrati piastrinici T0 T1 T2 T3 T4 T5 non filtrate 0,37± 0,72 1,17± 1,97 3,76± 2,11 6,92± 2,11 6,73± 2,41 5,27± 1,39 filtro doppio 0,8± 0,56 4,83± 1,35 2,39± 0,88 3,03± 1,55 2,65± 1,26 1,83± 0,59 V.N. <15,6 pg/ml Tabella I: numero di leucociti nelle sacche di sangue subito dopo la donazione (pre-filtrazione) e sui concentrati eritrocitari dei tre gruppi (post-filtrate). I valori, espressi come numero di cell/µl, sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo WBC nei concentrati eritrocitari pre-filtrazione post-filtrazione non filtrate 6.552±405, ±648,9 filtro singolo 6.870±556,5 0,55±0,05 filtro doppio 7.359±481,2 0,37±0,11 Tabella II: numero di leucociti nelle sacche di sangue subito dopo la donazione (pre-filtrazione) e sui concentrati piastrinici dei tre gruppi (postfiltrate). I valori, espressi come numero di cell/ µl, sono la Media±ESM di dodici determinazioni per gruppo WBC nei concentrati piastrinici pre-filtrazione post-filtrazione non filtrate 6.573±731,9 26,2±8,4 filtro doppio 7.227±462,2 0,21±0,04 risultati relativi alla conta dei leucociti nei concentrati piastrinici dei due gruppi. In queste sacche è stata rilevata una netta diminuzione di leucociti con valori però nettamente più bassi (<0,21µL) nelle piastrine filtrate rispetto a quelle non filtrate. Discussione La leucodeplezione degli emocomponenti può essere effettuta in 3 modi: prestorage (subito dopo il prelievo), post-storage (in laboratorio, prima della assegnazione delle unità ) e bedside (al letto del malato durante la trasfusione). La riduzione leucocitaria prestorage è la metodica più costosa, mentre quella bedside è la più economica. Il maggior costo sarebbe dovuto principalmente alle unità filtrate e non utilizzate. Questo fenomeno, che potrebbe avere il suo peso in altre nazioni, in Italia ha scarso valore essendo relativamente basso il numero di unità che giungono a scadenza. In ogni caso, per gli innegabili vantaggi delle leucodeplezione, l'american Association of Blood Banks e tutte le società internazionali di Medicina Trasfusionale che identificano nella sicurezza del sangue la priorità principale della materia, hanno focalizzato la loro attenzione sulla leucodeplezione totale promulgando leggi o, semplicemente, consigliandola 1,2. In questo contesto si inserisce il nostro studio teso a dimostrare il miglior tipo di filtrazione per il paziente. È stata dimostrata l'efficacia dei filtri in linea. Tutte le unità filtrate avevano un numero di leucociti residui < 0,55 cellule/µl corrispondenti ad un numero di leucociti dell'ordine di Si è rilevata una stretta correlazione tra leucociti e livelli di citochine: non si è notato nessun aumento delle citochine nelle unità filtrate, mentre in quelle non filtrate con elevato numero di globuli bianchi (1-3 x 10 9 ), si è osservato un incremento significativo 287

8 D Dimonte et al. dell'il-8. I valori maggiori si sono registrati nelle piastrine con un picco di 779,35 pg/ml probabilmente per la modalità di conservazione a temperatura ambiente. Questi dati potrebbero suggerire il monitoraggio dell'il-8 come indicatore di qualità di un Servizio Trasfusionale in quanto sembrerebbe la citochina che più risente di variazioni procedurali nella preparazione degli emocomponenti 3. Per le altre citochine si sono registrati sempre dosaggi bassi e comunque le variazioni non sono state significative, diversamente da quanto segnalato in altri lavori apparsi in letteratura che attribuiscono all'il-6 la maggiore responsabilità delle reazioni febbrili post-trasfusionali 4 (nel nostro studio si è registrato un modesto incremento, ma non significativo, solo nei concentrati piastrinici) o suggeriscono l'impiego alternativo all'il-8 del TNF come indicatore di qualità per la produzione di concentrati piastrinici 3. I dati riportati confermano che la filtrazione prestorage previene il rilascio delle citochine e, conseguentemente, le reazioni ad essa dovute riducendo fino a 4-5 volte, rispetto alla leucodeplezione prestorage, le reazioni febbrili 2. Queste positive conclusioni si aggiungono ad altri ormai consolidati vantaggi del prestorage: - evita che frammenti di leucociti,portatori di molecole di HLA, che si formano durante la conservazione, passino attraverso il filtro e raggiungano il paziente provocando alloimmunizzazione 5,6 ; - non risente della temperatura del sangue che invece influenza quella bedside, che diviene meno efficiente se la trasfusione dura molto e il sangue si riscalda durante la trasfusione; - riduce l'emolisi che si verifica durante il periodo di conservazione ad opera di enzimi leucocitari 7 ; - non viene influenzata dall'indice di flusso: minore è la velocità di filtrazione minore è l'efficienza del filtro; - riduce il rischio di contaminazione batterica perché una rapida rimozione dei bianchi riduce la proliferazione batterica 8 ; - permette, infine, un migliore controllo della qualità dei prodotti filtrati perché è possibile eseguire una conta dei bianchi, non è legata alla capacità dell'operatore (infermiere di reparto o tecnico di laboratorio), non risente di fattori ambientali (temperatura). Riassunto Le citochine rilasciate dai leucociti,durante il periodo di conservazione degli emocomponenti, possono provocare reazioni febbrili, rush cutanei, ipotensione nel paziente trasfuso. Per prevenire tali effetti indesiderati si ricorre alla filtrazione prestorage eseguita, cioè, subito dopo il prelievo. Scopo del nostro lavoro è stato quello di verificare l'efficacia di tale tipo di filtrazione e se vi è una correlazione tra leucociti residui e livelli di citochine. A tal fine, sono state valutate 36 sacche di sangue distinte in 3 gruppi di 12. Il primo gruppo era costituito da unità di sangue prelevate in sacche quadruple e frazionate senza filtrazione, il secondo e il terzo gruppo da unità di sangue prelevate con sacche munite rispettivamente di filtro singolo e filtro doppio per la filtrazione prestorage. In ciascun emocomponente sono stati valutati a vari intervalli di tempo durante la conservazione, le citochine (IL-8, IL-6, IL-1β, TNF-α) e i leucociti sia prima che dopo filtrazione. I dati ottenuti hanno dimostrato una correlazione tra leucociti residui e livelli di citochine. Infatti, solo negli emocomponenti non filtrati con elevato numero di globuli bianchi si è evidenziato, durante la conservazione, un progressivo incremento dell'il-8. La filtrazione prestorage, pertanto, rappresenta un efficace metodo per rimuovere subito i globuli bianchi ed impedire che sostanze ad attività proinfiammatoria da essi rilasciate e frammenti leucocitari portanti molecole di HLA vengano trasfuse al paziente con conseguenti reazioni avverse o fenomeni di alloimmunizzazione. Bibliografia 1) AABB Bullettin: Leukocyte reduction, pag. 99. 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