Il controllo delle micosi: gli antifungini

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1 Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico di Catania Laboratorio Centralizzato di Analisi Laboratorio di Micologia Università degli Studi di Catania Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche Il controllo delle micosi: gli antifungini Prof.Salvatore Oliveri oliveri@unict.it Rappresentazione schematica della cellula fungina e principali bersagli dei farmaci antifungini Da: Odds et al., Trends Microbiol., 2003

2 Antifungini attivi sulla membrana cellulare Membrana cellulare Polieni - Amfotericina B - Nistatina (uso topico) Allilamine, tiocarbamati, morfoline Azoli - Miconazolo, clotrimazolo (ed altri per uso topico) - Ketoconazolo - Fluconazolo - Itraconazolo - Voriconazolo - Posaconazolo Polieni L amfotericina B (AmB), prodotta da Streptomyces nodosus, è stata per molti anni il solo poliene somministrabile per via sistemica La modalità di azione è atipica per una molecola antimicrobica, in quanto si lega all ergosterolo presente nella membrana fungina, determinando alterazioni della permeabilità, fuoriuscita di componenti citoplasmatici vitali e la morte dell organismo. Tale meccanismo fa sì che AmB possa agire su un ampio spettro di specie fungine, come pure sia tossica per le cellule dei mammiferi

3 Meccanismo d azione dell Amfotericina B Fosfolipidi Amfotericina B PORO Ergosterolo Membrana cellulare Azoli Imidazoli (ketoconazolo, miconazolo e clotrimazolo) e triazoli (fluconazolo e itraconazolo) costituiscono il più ampio gruppo di farmaci antifungini Il loro effetto principale è quello di inibire la 14α-demetilazione del lanosterolo nella via biosintetica dell ergosterolo, agendo sul citocromo P450, CYP51A1, anche chiamato Erg11p, cioè il prodotto del gene ERG11 In alcune specie fungine tali farmaci possono inibire anche la sterolo 22 - desaturasi, un enzima coinvolto nell ultima tappa della biosintesi dell ergosterolo

4 Azoli (2) Con la deplezione dell ergosterolo, risultano alterate la normale permeabilità e fluidità della membrana fungina, con conseguenze secondarie sugli enzimi di membrana coinvolti nella sintesi della parete Dotati di un ampio spettro di azione, sono attivi nei confronti di dermatofiti, funghi filamentosi, Candida spp., Cryptococcus neoformans e funghi dimorfi come Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis Azole Antifungals for Systemic Infections Ketoconazole Itraconazole Fluconazole Voriconazole Imidazole Triazoles 2nd generation triazole Fluconazole Ketoconazole

5 Allilamine Le allilamine (terbinafina e naftifina) inibiscono l enzima squalene epossidasi, con conseguente deplezione dell egosterolo ed accumulo di squalene. Hanno effetto fungicida nei confronti di dermatofiti e funghi filamentosi, ma sono fungistatici per molti lieviti patogeni. A causadellasuanotevoleefficacianei confronti dei dermatofiti, la terbinafina è il solo farmaco di scelta per il trattamento di micosi superficiali e infezioni ungueali sostenute da tali muffe Allylamines - Mechanism

6 Cell Wall Active Antifungals Cell membrane Polyene antibiotics Azole antifungals DNA/RNA synthesis Pyrimidine analogues -Flucytosine Cell wall Echinocandins -Caspofungin acetate 5-fluorocitosina (5-FC) In origine sviluppato come agente antineoplastico, agisce come antifungino attraverso la sua conversione a 5-fluorouracile (5-FU) nelle cellule target. Il 5-FU viene incorporato nell RNA, determinando la terminazione prematura di catena, ed inibisce la sintesi del DNA attraverso i suoi effetti sulla timidilato sintetasi Ha attività fungicida, tuttavia lo spettro di attività è limitato ai lieviti patogeni (Candida spp. e Cryptococcus neoformans) 5-FC non viene utilizzata nella pratica clinica singolarmente, ma in associazione (ad es. con AmB) a causa del rapido sviluppo di resistenza primaria e secondaria (risultante da difetti negli enzimi permeasi, deaminasi e fosforibosil trasferasi)

7 Flucytosine Fluorinated pyrimidine related to flurouracil. Nuovi farmaci antifungini Echinocandine (1) Le echinocandine sono metaboliti fungini secondari, costituiti da un core ciclico esapeptidico con una catena lipidica laterale responsabile dell attività antifungina. Scoperti negli anni 70 solo alla fine degli anni 90 tre composti della classe echinocandine, anidulafungina, caspofungina e micafungina sono entrati nello sviluppo clinico

8 Nuovi farmaci antifungini in sviluppo clinico Echinocandine (2) Il bersaglio delle echinocandine è il complesso delle proteine responsabili della sintesi dei β-1,3 glucani della parete, sebbene il preciso meccanismo d azione rimanga sconosciuto Resistenza ai farmaci antifungini La resistenza ai farmaci antifungini ha componenti cliniche e microbiologiche Per resistenza clinica si intende il fallimento del trattamento e la persistenza dell infezione nonostante la terapia antifungina appropriata. Una risposta clinica adeguata è a sua volta dipendente non solo dalla sensibilità del microrganismo patogeno ma anche da vari fattori, quali il sistema immune, la penetrazione e distribuzione del farmaco, la compliance del paziente e l assenza di un focolaio di infezione protetto o persistente (es. catetere o ascesso)

9 Resistenza ai farmaci antifungini La resistenza microbiologica di un dato patogeno fungino deve essere ritenuta come una variabile quantificabile, determinata mediante la misurazione della sensibilità al farmaco (es. MIC), e deve essere definita rispetto ad una popolazione di riferimento. Un fungo patogeno resistente ad un dato farmaco è perciò un microrganismo che ha una minimal inhibitory concentration (MIC) più alta del valore medio calcolato nella popolazione totale Pertanto la resistenza microbiologica o in vitro di un dato patogeno è basata sulla determinazione delle MIC In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with head-to-head comparison to voriconazole n of isolates MIC (mcg/ml) AMB VOR Sutton et al., JCM, 1999, 37:

10 Resistenza ai farmaci antifungini La resistenza microbiologica può essere distinta in: i) resistenza primaria, anche definita come resistenza intrinseca, che si osserva prima dell esposizione in vitro o in vivo al farmaco ii) resistenza secondaria (o resistenza acquisita) che compare dopo l esposizione ad un agente antifungino e può essere reversibile o acquisita stabilmente Meccanismi di resistenza ai polieni La resistenza microbiologica ad AmB può essere intrinseca o acquisita La resistenza intrinseca è comune ad alcune specie di Candida (C. lusitaniae) e atrichosporon beigelii La resistenza acquisita è spesso associata con alterazioni nel contenuto dei lipidi di membrana e specialmente dell ergosterolo Sono stati descritti ceppi clinici di C. albicans resistenti a AmB che mancavano di ergosterolo e accumulavano altri steroli a causa di un difetto dell enzima sterolo 5,6 -desaturasi Un altro meccanismo alla base della resistenza sarebbe mediato da un incrementata attività della catalasi, che potrebbe contribuire a diminuire il danno ossidativo prodotto da AmB

11 Mechanisms of resistance to polyenes Low ergosterol content in the cell membrane of Aspergillus spp. decreases the activity of AMB Walsh et al., JID, 2003, 188: Meccanismi di resistenza alla 5-FC Anche nei confronti di tale farmaco la resistenza può essere intrinseca o acquisita La resistenza intrinseca può presentarsi per un difetto della citosina permeasi, mentre quella acquisita deriva dall incapacità di metabolizzare 5-FC a 5-FUTP e 5-dUMP oppure può essere dovuta alla perdita di un feedback di controllo della biosintesi della pirimidina A causa dell elevata resistenza intrinseca a 5-FC, tale composto è di gran lunga utilizzato in associazione con altri agenti antifungini, per esempio, con AmB

12 Meccanismi di resistenza agli azoli I meccanismi di resistenza agli azoli possono essere così suddivisi: 1. alterazioni nel trasporto del farmaco o ridotto accumulo di azoli nella cellula dovuto alla upregolazione di geni multidrug trasporter (MDR1, CDR1 e CDR2). 2. alterazioni del target cellulare: i. diminuzione dell affinità di Erg11p (per insorgenza di mutazioni) ii. aumento del contenuto cellulare di Erg11p (per upregolazione genica 3. alterazioni della via biosintetica dell ergosterolo, mediante inattivazione della sterolo 5,6 -desaturasi Types of multidrug efflux transporters in yeast Plasma membrane NH 2 A B A B COOH NH 2 COOH ATP ADP ATP ADP ATP-binding cassette (ABC)-transporters C. albicans CDR1, CDR2 (Candida drug resistance), 170 kda - 2 x 6 transmembrane domains (TM) - 2 nucleotide binding folds in Walker A and B domains - Efflux a large variety of drugs Major Facilitators C. albicans CaMDR1 (Multidrug resistance), 63 kda - 2x6 transmembrane domains (TM) - Effluxes a large variety of drugs Sanglard et al. (1995), AAC 39: ; (1997), Microbiology 143:

13 Azole resistance mechanisms: enhanced efflux by upregulation of multidrug transporter genes Major Facilitator multidrug transporter CaMDR1 Azole resistant yeast Lanosterol ERG11 14α-demethylated sterols Ergosterol ATP Binding Cassette (ABC) multidrug Transporter Echinocandins - spectrum Highly active Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei Candida kefyr Pneumocystis carinii Low MIC,with fungicidal activity and good in-vivo activity. Very active Candida parapsilosis Candida gulliermondii Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Aspergillus terreus Candida lusitaniae Low MIC, but without fungicidal activity in most instances. Some activity Coccidioides immitis B. dermatididis Scedosporium species Paecilomyces variotii H. capsulatum Detectable activity, which might have therapeutic potential for man (in some cases in combination with other drugs).

14 Echinocandins-Spectrum vs. Moulds Active against Aspergillus species Glucan synthase localized in apical tips Activity against other yeast and moulds is less well described or variable Staining with antisera to glucan synthase subunit (Fks1p) Aniline blue staining of β (1-3) glucans stains only at apex Beauvais et al. J. Bacteriol 2001;183: Echinocandins act at the apical tips of Aspergillus hyphae DiBAC Bowman et al. Antimicrob Agent Chemother 2002;46:

15 A Imhof, JCM 2003, 41: Saggi in terreno liquido YeastOne-Sensititre Possibilità di determinare la CMI e la CMF Semplicità di interpretazione e di lettura Possibilità di saggiare funghi filamentosi farmaci da saggiare e loro concentrazioni terreno di crescita ph temperatura e tempo di incubazione inoculo fungino controlli lettura interpretazione dei risultati

16 NCCLS conditions for antifungal susceptibility testing Characteristic Suitability Inoculum Inoculum standardization Test medium Format Temp Duration of incubation End point Yeasts Macrodilution or microdilution 35 C NCCLS M27-A (135) CFU/ml Spectrophotometric, with reference to a 0.5 McFarland BaSO 4 turbidity standard RPMI 1640, buffered to ph 7.0 with M MOPS 48 h (Candida spp.), 72 h (C. neoformans) Optically clear well for amphotericin B, ~80% reduction in growth (macrodilution testing with azoles), prominent decrease in turbidity (microdilution testing with flucytosine and the azole antifungals) Conidium- and spore-forming fungi CFU/ml Spectrophotometric, with specificatiion of a target optical density that varies by fungal genus Same as M27-A Microdilution 35 C 48 h (most fungi) NCCLS M38-P (133) Prominent growth reduction from control (~50%) for flucytosine, fluconazole, and azoles; optically clear well for amphotericin B; the T-level revision will propose the use of an optically clear end point for intraconazole and the newer azoles (e.g., voriconazole) Da Rex, J. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14: Interpretative Breakpoints for Isolates of Candida Species Drug Concentration (µg/ml) Susceptible Susceptible Dose-Dependent Resistant Flucytosine 4 (8-16) 32 Fluconazole Itraconazole 0,125 0,25-0,5 1 Voriconazole* NCCLS: M27-A *CLSI: M27-S2 2006

17 Saggi in agar Diffusione da disco Impossibilità di determinare la CMI e la CMF Utilizzo di terreni interferenti con l attività dei farmaci Assenza di crescita per alcune specie fungine Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura Semplicità e rapidità di esecuzione Relativa economicità E-test Possibilità di determinare la CMI Impossibilità di determinare la CMF Utilizzo di terreni interferenti con l attività dei farmaci Assenza di crescita per alcune specie fungine Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura Semplicità e rapidità di esecuzione Possibilità di saggiare funghi filamentosi