Siena, 4 giugno 2009 Relatori Dott.ssa Ilaria Carboni - biotecnologa Dott. Ugo Ricci - biologo genetista

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1 Corso professionalizzante per addetti sala autoptica Genetica forense Siena, 4 giugno 2009 Relatori Dott.ssa Ilaria Carboni - biotecnologa Dott. Ugo Ricci - biologo genetista

2 DI COSA PARLEREMO OGGI GENETICA FORENSE - LA PROVA DEL DNA OBIETTIVO Conoscere le possibilità tecniche offerte dal test del DNA. "Ogni giudizio è in bilico sull'orlo dell'errore." Frank Herbert ( ), scrittore americano.

3 Dove si trova il DNA? Ogni organismo vivente è costituito da cellule. Ogni cellula presenta un NUCLEO. All interno del nucleo si trova il DNA: Acido DesossiriboNucleico. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

4 Nel nucleo di ogni cellula umana ci sono 46 filamenti di DNA, avvolti a formare un gomitolo. Ogni filamento prende il nome di cromosoma. I cromosomi di una cellula umana sono 46. Se potessimo distendere il gomitolo di DNA avremmo un filo della lunghezza di oltre 2 metri! Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

5 I 46 cromosomi di una cellula sono organizzati in coppie: 22 coppie di autosomi e una coppia di cromosomi sessuali. Per ogni coppia, un cromosoma viene ereditato dalla madre e uno dal padre. La coppia di CROMOSOMI SESSUALI è costituita da due X per la femmina e da un X e una Y per il maschio. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

6 Il DNA mitocondriale Il DNA mitocondriale è presente in strutture della cellula chiamate mitocondri. E circolare, è molto più piccolo di quello nucleare ed è presente in più copie. DNA mitocondriale Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

7 Come si trasmette il DNA? DNA nucleare: ogni individuo eredita 50% del suo DNA dal padre e 50% dalla madre. Cromosoma Y: viene trasmesso dal padre ai figli maschi. Ogni uomo ha lo stesso identico cromosoma Y del proprio padre ma anche del proprio nonno. DNA mitocondriale: viene trasmesso dalla madre a tutti i figli (sia maschi che femmine) Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

8 L EREDITARIETA Marcatori autosomici Marcatori parentali Autosomici (trasmessi in parte da tutti gli antenati) Cromosoma Y (trasmesso intero, ma solo tra maschi) DNA mitocondriale (trasmesso intero, ma solo dalle femmine) Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

9 Il linguaggio del DNA Sul DNA l informazione genetica è scritta con un alfabeto di sole 4 lettere, le basi azotate: ADENINA (A) TIMINA (T) GUANINA (G) CITOSINA (C). La complessità degli organismi e le differenze individuali sono in gran parte dovute a come si susseguono queste 4 lettere sul DNA. Una sequenza di DNA: CAGGGAAGATGAAAAAAGAGACTGTATTAGTAAGGC TTCTCCAG Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

10 1 catggatata tggcactgga gggggctacc cagctttatc gaatccactt tcctatgttt 61 ggagaattct tcactttata aggcagaacc ttgccctaaa actaaagaaa ctgaaaacca 121 ggtatttgct ttccacatct ctctcctaac tgggacaggg ttacgtgtaa gtcctgagct 181 tttccagtca gacaaaccaa ccccgacttt gaaaaactga atcaacaaaa ggaggaggac 241 gtagaggtca aagaggaagc agcgacagaa gcaagcccca taagcaatcc attctggtga 301 ggttgaaggc aacagcaaca gctaatttac tccagtttga attaattaat ccttccagct 361 gggcacggtg gttcacgcct gtaatcccac cactttagga ggctgaggcg ggcggatcac 421 ctgaggtcag gaattaagag accagacagg ccaacatggt aaaaccctgt ctctactaaa 481 aatgcaaaaa ttaaccaggt gtggtggcac acgcctgcag tcccagctac tagggagact 541 gaggcaggag gatcacttga acccaggaag cagaggttgc agtgagctga gatcatgcca 601 ctacattcca gcctgggcaa cagagcgaga acctgcctca aaaaaaaaaa aaaaattctt 661 ccttcatcca gttttaaaag ggaacactga caacagtttt aggagtatct gtcaccttat 721 gtcagagaaa gtacaaatag tgtgaacatg tcacctaaca gtgatgcttt cactggacca 781 gctctgcagt atagtacgta gcacactgtt cctgcacaag actggttctt ctacccttta 841 ggaaattcta tgaatagccc aatatcctct ttaatcacaa agccatttat gattaaagta 901 gagggatttc tattatttaa gactatgaac actaacgcat atttttctta gttttttttt 961 ttttttttga gacagggtct cactccatca cccaggttgg aatgcggtgg tacaatctca 1021 gctcactgca acctccacct cctgggctca agcgatcctc tcacctcagc ctcctgagta 1081 aatgggagca taggagtgtg ccaccacacc cggttaattt tttctatttt taggagacac 1141 agggtttcac cacattgccc aggctggtct caaactcctg agctaaagtg atccgcccac 1201 ctcagtctcc gaaagtgctg ggattacagg catgagccac cacgcccagc ctaacacata 1261 ttcttagatc acaacggcat cccaaagcat cactttaaag ttcagataaa gtaacttcaa 1321 cccttgctct gacaaagttt cgtatcttac aactccctac cttctacaag tggcatgttt 1381 gcagtctcag ttcttcccac aatctactat gacccctctc tccttaagaa ccaatgtcaa 1441 tattcgtgag actggttagc agaaaactgt cagctaaatc acatcctgac ccttctttct 1501 gtacacacat ttaaaacaac atcttgatgc aaactgatat aaaaggaaca atttattaca 1561 gatgcaaaag ccaacttaac attaaacttt tgtatttata tcaccataaa caatgaagtg 1621 taagagaaaa cccaattgaa cagtttggtt cacccatgcc ttcataactt caaaacccaa 1681 taatcatcaa tacataatga tgacaagata accagttctt gaatattaag aaactagaat 1741 tgttgcttta gcatgtttaa gactatgcac ctcccccctc ttccctctct gacacacaca 1801 cacaaaataa cagcatcaac agcatcagca acatcatgaa atacctacaa caaaaaattt 1861 caaccctggc agcacttgag aatgacctaa gaaatttatt ttaaaatatc cattatgtgg 1921 gttctttcat cagagattct gattcaattg gtctgggctc gaactcagga atcaatattt 1981 ttttaacagc ttcccaagga attctaatgc actcacacag ggcttagaac cagtgaagag 2041 gaacataatg ttctcaagca cctgtttatc catagcattc tattcttgca cagctggtgt 2101 taatgtattt aactcattaa ccactgaccc taaatattag ctaatcatta agccccagtt 2161 ggtactcgcc tgtgtggagg ttaccacata gtctgggagg atgacttaaa atattttatt 2221 ttggtgttgg actgtgtcat ctataattct ggcttcagag aacagagtaa aatatgattg 2281 agatttaatt ggtggttttt ctgaattgat ctaggagtga tctgctaaat gctttatgta 2341 cttataccct tccactgtgc aagaccatat aggggaacaa agtaacaact aaaattcctt 2401 ctcacacaat gggtttccac atttccttca aaagctctac aaattgggaa gggggatttg 2461 aaaagttcac aagtactgct taaattttac taagcagtaa attttactaa gtaaaaatac 2521 acacatctgt gagaataaaa gtagattttc aaatttccac tataaccttt caagcttttg 2581 gcacccaatt ttatatattt atagcgataa tcctctatat ataaagaaag atcacggccg 2641 ggtgcagtgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag gtcgaggcgg gcggatcacc 2701 tgaggtcagg agttcaagac cagactgacc aacatggtga aacctcatct ctactaaaaa 2761 tacaaaaaaa ttagccggtc gtcgtggtgg tgcctgtaat cccacctact cggtaggctg 2821 aggcaggaga atcgcttgaa tccaggaggc ggaggttgca gtgagccaag atcgcgccat 2881 tgcactccag cctgggcgag aaagcaagac tccgtctcaa aaaaaaaaaa gaaagaaaga 2941 aagaaagaaa gattccattc ttgcggggga aatattccaa gacccgcggt ggatgcctga 3001 aactgcagag taccaaaccc tatatatact atgttttttc ctatatatac atacttatga 3061 caaaagtgtg gtccatgaac caatcaagct ccatcctaca tctacagaat cagaatctgc 3121 actgtaataa gagaataaaa ccaaaatact atctttcctt acattagtct ttataacatc 3181 agaaaataca tagtaaatgt atagtaataa aagttacata tacaatccta aaaataacac 3241 taacgaatat ttctaggata agtatataaa gcatttagca aatcactcct agaccaattc 3301 agaaaaacca ccaattaaat ctcaattata ttttactcta ttctctgaag ccaaaattat 3361 agatgacaca gtccaacacc aaaataaaat attttaaatc atcctcccag actatgtggt Se per fare un clic sul mouse ci metto ½ secondo mi occorrerebbero circa 17 giorni per far scorrere tutta la sequenza delle basi contenute nel DNA di una singola cellula!

11 I geni Ogni cromosoma è costituito da una successione di segmenti (geni) che, come parole, hanno un determinato significato. I geni sono localizzati ognuno in una specifica posizione o locus. Ogni gene/parola è presente in una persona in doppia copia. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

12 Il DNA è polimorfo Le forme alternative di un gene sono dette alleli. Ogni allele occupa su cromosomi omologhi lo stesso locus. LOCUS GENETICO D**Sψψψ LOCUS GENETICO D**Sψψψ COPPIA DI CROMOSOMI OMOLOGHI

13 Gli alleli Tutti gli esseri umani hanno lo stesso tipo e lo stesso numero di geni. Lo stesso gene può però presentare piccole differenze di sequenza tra un individuo e l altro, come sinonimi di una stessa parola. Ognuna di queste forme alternative del gene prende il nome di allele. Gene H: Allele 1 Allele 2 Possibili combinazioni in un individuo: Individuo A Individuo B Individuo C Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

14 I polimorfismi Esistono specifiche zone del DNA, dette polimorfismi che presentano molte forme alternative (piú alleli) e risultano quindi estremamente variabili nella popolazione. Forme alleliche conosciute per il polimorfismo D21S11 alleli: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 0,25 D21S11 0,2 0,15 0,1 0, Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

15 UN ESEMPIO DI POLIMORFISMO IL SISTEMA AB A B AB 0 Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

16 I CARATTERI DEL DNA SONO QUINDI MOLTO VARIABILI Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

17 Sono mai caduti due fiocchi di neve IDENTICI da quando esiste la Terra? Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

18 Dal periodo giurassico ad oggi (130 milioni di anni) si stima che siano caduti 3 x fiocchi di neve Il numero di molecole d acqua in un tipico fiocco di neve è circa = Il numero di molecole può quindi combinarsi in ( ) modi diversi numero virtualmente impossibile da immaginare

19 I polimorfismi nelle indagini forensi I polimorfismi utilizzati oggi nelle indagini genetico-forensi sono i MICROSATELLITI o STR (Short Tandem Repeats). Un microsatellite è una specifica zona del DNA non-codificante costituita dalla ripetizione in successione (un numero variabile di volte) di un blocco costituito da 4 basi azotate. La differenza tra un allele e l altro sta nella lunghezza, determinata dal numero di ripetizioni. MICROSATELLITE Unità di ripetizione: GACT: Allele 3: Allele 4: Allele 5: Allele 6: Allele 7: AT GACT GACT GACT TTCG (3 ripetizioni) AT GACT GACT GACT GACT TTCG (4 ripetizioni) AT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG (5 ripetizioni) AT GACT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG (6 ripetizioni) AT GACT GACT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG (7 ripetizioni) Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

20 Polimorfismi di lunghezza AATG AATG AATG 7 ripetizioni 8 ripetizioni Ogni locus di ciascun cromosoma può contenere più unità ripetute rispetto a un altro

21 Locus vwa: cromosoma 12p12pter ccctagtgga tgataagaat aatcagtatg tgacttggat tgatctatct gtctgtctgt ctgtcaatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatccat tccatccatc ctatgtattt atcatctgtcc ccctagtgga tgataagaat aatcagtatg tgacttggat tgatctatct gtctgtctgt ctgtcaatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcca tctatccatcc atcctatgta tttatcatct 20 Paterno Materno Locus vwa: 19, 20

22 Ogni microsatellite è presente in doppia copia: ognuna di queste copie viene indicata con un numero che rappresenta il numero delle ripetizioni. Se i due alleli hanno stessa lunghezza (es. 7;7) l individuo è OMOZIGOTE per quello specifico microsatellite. Se i due alleli hanno lunghezza diversa (es. 4;7) l individuo è ETEROZIGOTE per quello specifico microsatellite. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

23 I microsatelliti dell FBI Attualmente vengono utilizzati microsatelliti (i microsatelliti autosomici) più un microsatellite per la diagnosi di genere. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

24 L analisi dei microsatelliti di una persona consente di tracciare una sorta di codice a barre del DNA: il PROFILO GENETICO. Il profilo genetico Il profilo genetico è una caratteristica che accompagna ogni individuo dall epoca del concepimento a dopo la morte Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

25 Quando è possibile utilizzare il test del DNA? Test di paternità/maternità/parentela Casi di violenza sessuale Match traccia biologica individuo sospetto/vittima Identificazione di persone scomparse Identificazione nei disastri di massa Costruzione di banche dati Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

26 Come si traccia un profilo genetico? 1. Estrazione del DNA dal campione 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi 4. Confronto tra i diversi profili genetici ottenuti 5. Analisi probabilistica Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

27 Estrazione di DNA da campione Sangue Sperma Saliva Urina Capelli Denti Ossa Tessuti Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

28 Estrazione del DNA dal campione Tutte le cellule di una persona, da una cellula del sangue a una della pelle, da una cellula dell osso a una di un capello, HANNO LO STESSO, IDENTICO DNA. Si può trovare il DNA praticamente in tutti i materiali biologici Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

29 Altri oggetti potenziali fonti di DNA DNA per contatto = da poche a 50 cellule Impronte digitali; colletti di camicie, maglie, indumenti in genere; passamontagna, caschi da moto; orologi, anelli, stanghette di occhiali; oggetti impugnati, matite, penne, armi bianche, armi da fuoco ecc. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

30 E sufficiente una quantità minima di campione Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

31 Come si traccia un profilo genetico? 1. Estrazione del DNA dal campione 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi 4. Confronto tra i diversi profili genetici ottenuti 5. Analisi probabilistica Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

32 PCR (Polymerase Chain Reaction) Tecnica che consente di ottenere milioni di copie del frammento di DNA che si vuole analizzare. E una reazione enzimatica che si svolge all interno di provette, che vengono inserite in uno specifico strumento. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

33 Come si traccia un profilo genetico? 1. Estrazione del DNA dal campione 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi 4. Confronto tra i diversi profili genetici ottenuti 5. Analisi probabilistica Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

34 Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi AmpFlSTR Identifiler (Applied Biosystems) D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 VWA TPOX D18S51 AMEL D5S818 FGA Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

35 I risultati IL PROFILO GENETICO è di facile lettura: per ogni microsatellite (riportato con una sigla) vengono indicati i due alleli che formano la coppia. STR Amelog. D3S1358 vwa FGA D8S1179 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX traccia X-Y Con l esame del DNA è possibile stabilire se una traccia biologica appartiene a un uomo o a una donna. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

36 Il profilo genetico del cromosoma Y Il cromosoma Y è presente solo negli individui di sesso maschile ed è in singola copia. Campione DYS 389I DYS 390 DYS 458 DYS 19 DYS 393 DYS 391 DYS 439 DYS 635 DYS 392 A Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

37 Come si traccia un profilo genetico? 1. Estrazione del DNA dal campione 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi 4. Confronto tra i diversi profili genetici ottenuti 5. Analisi probabilistica Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

38 Il DNA viene ereditato al 50% dalla madre e al 50% dal padre Il confronto del DNA di una persona con i DNA dei genitori consente di stabilire legami di paternità/maternità. Il profilo genetico identifica la persona E possibile confrontare il profilo genetico ottenuto da una traccia di materiale biologico (come sangue, saliva, pelle, frammenti di ossa, capelli) con il profilo genetico del sospettato e/o della vittima. Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

39 Il test di paternità Caso 1. Nel corso di una separazione, il marito sostiene di non essere il padre biologico del bambino. Il giudice chiede che venga eseguito il test di paternità. Amelog. D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX Madre X-X Figlio X-Y Padre X-Y Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

40 I test di identificazione personale Caso 2. In seguito all uccisione di una donna, viene rilevata una macchia di sangue. Il magistrato richiede il confronto con il DNA della vittima e di due individui sospetti. Amelog D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX Macchia sangue X-Y Sospetto 1 X-Y Sospetto 2 X-Y Vittima X-X Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

41 Il confronto tra profili del cromosoma Y Campione DYS 389I DYS 390 DYS 458 DYS 19 DYS 393 DYS 391 DYS 439 DYS 635 DYS 392 traccia Individuo A Individuo B Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

42 Come si traccia un profilo genetico? 1. Estrazione del DNA dal campione 2. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Sistema capillare con elettroferogrammi a picchi 4. Confronto tra i diversi profili genetici ottenuti 5. Analisi probabilistica Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

43 L interpretazione dei risultati nelle indagini di identificazione personale La compatibilità genetica Quando il profilo genetico della traccia risulta identico a quello del sospettato, per tutti i polimorfismi esaminati. Campione D8S1179 TPOX TH01 CSF1P0 Traccia 11, 12 8, 8 6, 9 10, 10 sospetto 11, 12 8, 8 6, 9 10, 10 L incompatibilità genetica Quando il profilo genetico della traccia risulta diverso rispetto a quello del sospettato, per uno o più marcatori genetici. Campione D8S1179* TPOX TH01 CSF1P0* Traccia 11, 12 8, 8 6, 9 10, 10 sospetto 11, 11 8, 8 6, 9 9, 10 Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

44 PERCHE IN CRIMINALISTICA 13 MARCATORI AUTOSOMICI SONO RITENUTI SUFFICIENTI PER L IDENTIFICAZIONE? D8 D21 D7 CSF D3 TH01 D13 D16 vwa TPO D18 D5 FGA Cam 13, 14 29, 30 10, 11 11, 12 15, 16 6, 7 11, 12 11, 12 16, 17 8, 8 12, 14 11, 12 21, 22 Freq 13% 11% 12% 20% 13% 13% 18% 17% 12% 28% 5% 22% 6% Frequenza del profilo stimata in una popolazione italiana 1 su Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

45 Uno dei limiti dell esame del DNA per l identificazione di persona è rappresentato dai GEMELLI MONOZIGOTI, che hanno identico profilo genetico! Associazione Identificazioni Forensi (A.I.Fo.)

46 Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

47 LA REPERTAZIONE Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

48 La repertazione Il profilo genetico può dirci se un soggetto ha lasciato parte di sé su un oggetto o se è probabile che sia passato da un certo posto. E fondamentale che il sopralluogo giudiziario sia compiuto con le dovute cautele per evitare contaminazioni. La repertazione e conservazione del reperto è fondamentale per ottenere risultati attendibili dalle analisi del DNA.

49 Impiego di materiale dedicato per la repertazione e conservazione del campione biologico Sistemi di protezione Tamponi sterili Contenitori idonei Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

50 La fase immediatamente successiva a quella del sopralluogo tecnico è detta repertazione. Consiste in quell insieme di operazioni mediante le quali gli investigatori raccolgono tutti gli oggetti che potranno costituire fonte di prova e provvedono a custodirli con i dovuti accorgimenti. Regolamentata dall art. 348 commi 1 e 2 c.p.p., finalizzata alla ricerca delle cose e delle tracce pertinenti al reato nonchè alla conservazione di esse e dello stato dei luoghi. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

51 LINEE GENERALI Fondamentale è non mischiare tra loro i campioni, anche se apparentemente sembrano della stessa origine (specialmente nel caso di peli, capelli, ecc.). Importante condurre una repertazione molto ampia, prelevando vari campioni da una stessa sede. In ogni caso, dopo la fase di repertazione, i reperti dovrebbero essere conservati in un frigorifero ad una temperatura di 4 C o in freezer a 20 C a seconda di quanto si prevede occorra prima della consegna al laboratorio. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

52 sangue e macchie di sangue prelievo da vivente - il prelevamento dovrebbe essere effettuato da un medico o da un infermiere specializzato. Di norma si prelevano 1-5 ml in due tubi separati con EDTA come anticoagulante. Su ogni provetta debbono essere indicati in maniera chiara la data e l ora, il nome della persona alla quale è stato effettuato il prelievo ed il numero di registro. I campioni di sangue possono essere sottoposti direttamente all estrazione del DNA oppure possono essere conservati per un periodo limitato in frigorifero a 4 C. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

53 prelievo da cadavere - il prelevamento del sangue dal cadavere viene di norma effettuato dal miocardio, ove una porzione di sangue rimane liquido per un lungo periodo di tempo. Durante la fase dell autopsia si può facilmente accedere al cuore e prelevare il sangue che viene inserito in una provetta con anticoagulante. Il prelievo può anche essere effettuato prima dell autopsia, tramite iniezione tra il 3 e 4 spazio intercostale e successiva deposizione in provetta con EDTA. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

54 sangue liquido sulla scena del delitto - non accade frequentemente di rinvenire questo tipo di sostanza, poiché la coagulazione avviene piuttosto rapidamente. Sangue liquido può essere prelevato mediante una siringa sterile e trasferito in una provetta con anticoagulante. In parallelo conviene far assorbire la sostanza su dei pezzetti di stoffa sterile che vanno poi inseriti in una provetta, con relativa etichetta recante il luogo e la data del prelievo. sangue liquido diluito - un risultato positivo nelle analisi del DNA dipende anche dalla concentrazione del campione. Bisogna evitare, ove possibile, ulteriori diluizioni del sangue. Usare una siringa sterile e trasferirli in una provetta con EDTA. In parallelo far assorbire un po di sostanza su frammenti di stoffa sterile e inserirli in una provetta. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

55 macchie di sangue umide - l umidità è un fattore estremamente dannoso per la buona conservazione dei reperti biologici, perché favorisce la crescita batterica e dei funghi, impedendo le successive analisi. In particolare si deve porre attenzione per cercare di eliminare l umidità dalle macchie, avendo cura di lasciarle asciugare all aria prima dell asportazione. Riporre il reperto in una busta di carta o in una scatola di cartone, naturalmente con un etichetta recante tutte le indicazioni necessarie, in maniera tale che l umidità residua possa traspirare. Mai utilizzare buste o contenitori di plastica! Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

56 oggetti o indumenti di piccole dimensioni: conviene repertare tutto il materiale; oggetti o indumenti di larghe dimensioni: nel caso di tessuti, come ad esempio tappezzerie di auto, moquette, conviene ritagliare il frammento di tessuto, lasciare asciugare la macchia e procedere come sopra. Quando gli oggetti non sono asportabili, come nel caso di macchie su pavimenti, muri, oggetti di grandi dimensioni, bisogna prelevarle con un frammento di tessuto sterile di piccole dimensioni. La macchia viene lasciata assorbire da uno dei due substrati che vengono posti a contatto con l'aiuto di una pinzetta sterile. Dopo l asciugatura essi possono essere riposti in buste di carta contrassegnate. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

57 macchie di sangue secco E importante procedere alla repertazione di un campione delle macchie in tutte le sedi sul luogo del delitto, anche se le circostanze sono apparentemente chiare e non suggeriscono il coinvolgimento di più persone. Si tratta di una regola generale, perché non si può escludere a priori che si tratti di macchie biologiche derivate da soggetti diversi. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

58 oggetti di larghe dimensioni non assorbenti: quando le macchie sono su pavimento, tavoli e comunque su materiali che non assorbono le tracce, la macchia può essere grattata con l ausilio di un piccolo bisturi, lasciandola cadere in un pezzetto di carta, che verrà poi richiuso ed inserito in un contenitore di carta o cartone, etichettato. Le tracce possono essere anche inserite in provette di piccole dimensioni, usando con molta attenzione quelle di plastica, poiché per effetto elettrostatico si rischia di veder letteralmente volare via la polvere ottenuta dal raschiamento. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

59 oggetti di larghe dimensioni assorbenti: è questo il caso di macchie su intonaco, asfalto, materiali che trattengono il sangue assorbendolo in maniera cospicua. Se questi materiali vengono grattati insieme alla macchia, si ottengono dei frammisti contenenti vernici, calce, residui catramosi ecc., tutti veleni che possono rendere inefficaci i tentativi di analisi da parte del laboratorio forense. Il miglior modo (ed anche il più semplice) per prelevare questi reperti, è quello di utilizzare dei pezzetti di stoffa leggermente imbevuti con una goccia di acqua distillata sterile, che vengono posti a contatto con le tracce con l aiuto di un paio di pinzette. Il frammento di stoffa deve poi essere deposto in una provetta e lasciato ben asciugare all aria prima di richiuderla. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

60 oggetti o indumenti che possono essere tagliati: macchie su tappezzerie di auto o di pareti, tappeti, larghi pezzi di carta debbono essere di preferenza prelevate ritagliando la porzione del materiale che contiene la macchia e deposti in contenitori di carta o cartone, etichettati.. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

61 schizzi di sangue di piccole dimensioni: queste tracce sono spesso difficili da rimuovere dalle superfici e particolari cautele devono essere adottate a seconda del tipo di materiale sul quale vengono rinvenute. Il raschiamento porterebbe probabilmente alla perdita di molto materiale, oltre alla rimozione di inibitori che diverrebbero preponderanti data l esiguità della traccia stessa. Sicuramente è preferibile il metodo della imbibizione con un frammento di stoffa, che deve essere inumidito con una minima quantità di acqua distillata sterile e poi utilizzato con le modalità già ricordate per le macchie di sangue umido. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

62 sperma e macchie di sperma sperma liquido - questo tipo di reperto si trova di solito all interno di profilattici usati risultando quindi veri e propri contenitori. In questo caso conviene certamente repertare tutto il materiale, inserendolo in un apposito contenitore, che verrà etichettato. Nel caso di violenze sessuali bisogna ricordarsi di effettuare un prelievo di sostanza ematica o di saliva dalla vittima, perché molto spesso nel reperto si rinvengono cellule della vittima stessa. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

63 RICERCA di TRACCE BIOLOGICHE sulla VITTIMA Tamponi cutanei (ricerca di saliva, sperma, cellule epiteliali di sfaldamento ) Raccolta di formazioni pilifere Tamponi cavitari (cavo orale, genitali, retto, per ricerca di liquido seminale ) + Tampone buccale (o prelievo di sangue) per DNA vittima Possono essere usati comuni tamponi in cotone e/o poliestere, ma senza mezzo di coltura Conservare a -20 C

64 TAMPONI CAVITARI A seconda della circostanze: Tamponi vaginali (2 tamponi fornice + 2 tamponi canale cervicale) Tamponi genitali esterni (2 tamponi piccole labbra) Tamponi rettali (2 tamponi) Tamponi orali (2 tamponi fornici gengivali + sottolinguali) Conservare per test DNA Preparare striscio per esame morfologico (+ motilità?)

65 macchie di sperma generalmente le macchie di sperma presentano un aspetto traslucido e sono facilmente rilevabili sulla scena del crimine. Nel passato un metodo che veniva utilizzato per individuare queste tracce, impiegava l illuminazione con una sorgente di luce ultravioletta (luce di Wood), per mezzo della quale è possibile rivelare una leggera fluorescenza. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

66 RICERCA di TRACCE BIOLOGICHE su INDUMENTI Ricerca di: sperma, saliva, formazioni pilifere. Consenso scritto della vittima per esame e conservazione reperti. E opportuno fare spogliare la vittima dopo che sul pavimento è stato steso un lenzuolo pulito e sopra carta da filtro, per non disperdere reperti (formazioni pilifere ). Se la vittima si è cambiata, ma non ha lavato gli indumenti, chiederle di consegnarli per l esame. Farsi guidare dal racconto della vittima per la ricerca delle zone di contatto vittima-aggressore.

67 REPERTAZIONE DI INDUMENTI Fare asciugare il reperto se umido o bagnato. Una volta asciutto, conservare in busta di carta o in scatola di cartone per evitare che si formi umidità. Sigillare e contrassegnare il reperto. Conservare a -20 C (o se il reperto è ingombrante, a temperatura ambiente ma in luogo asciutto). Nella cartella clinica dovrebbe essere dato atto della repertazione, con sintetica descrizione.

68 IN CRIMINALISTICA E MOLTO UTILE STUDIARE ALCUNE CARATTERISTICHE DEL DNA Il cromosoma Y UOMO X, Y DONNA X, X L esame del profilo del cromosoma Y può essere molto utile quando ci sono tracce miste donna-uomo. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

69 L esame Y-STR favorisce l identificazione del profilo genetico maschile nei casi di violenza sessuale Campione D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 Amelogenina Traccia 10, 13, 14, 15 29, 30, 32 8, 10, 11, 12 10, 11, 12 15, 16, 17 6, 7, 9 X-Y Vittima 10, 13 29, 30 8, 11 10, 12 16, 17 7, 9 X-X Sospetto 14, 15 29, 32 10, 12 11, 11 15, 16 6, 9 X-Y Campione DYS391 DYS389-I DYS439 DYS389-II DYS438 DYS437 Traccia Vittima sospetto Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

70 Tuttavia Uomini discendenti da uno stesso padre non possono essere discriminati tra loro con l esame del cromosoma Y; Ci sono pochissimi dati di popolazione sui marcatori del cromosoma Y. Utile per le esclusioni, ma bassa la probabilità di match Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

71 IN CRIMINALISTICA E MOLTO UTILE STUDIARE ALCUNE CARATTERISTICHE DEL DNA DNA mitocondriale cellule prive di nucleo DNA nucleare scarso e/o degradato Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

72 Tuttavia Tutti i soggetti imparentati per via materna hanno lo stesso DNA mitocondriale; Ci sono pochissimi dati di popolazione sul DNA mitocondriale. Utile per le esclusioni, ma bassa la probabilità di match Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

73 tessuti, ossa ed unghie Non aggiungere alcun fissativo ai reperti! Sostituire i guanti ogni qualvolta si passa a prelevare un reperto diverso. Le ossa vengono conservate piuttosto bene in contenitori di carta, che debbono essere poi conservati in congelatore. La repertazione di unghie sulla scena del delitto è un evento raro, ma può accadere di avere a che fare con questo materiale, che viene facilmente conservato in contenitori sterili, come piccole provette. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

74 Capelli Le formazioni pilifere debbono essere prelevate con l uso di pinzette, toccando soltanto il fusto e facendo molta attenzione a non danneggiare il bulbo, se presente. Mai inserire nello stesso contenitore dei capelli prelevati da sedi diverse, come capi d abbigliamento o punti diversi di un lenzuolo o di una federa. Anche la forfora può essere raccolta e custodita in un foglietto di carta. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

75 saliva ed urina campioni liquidi devono essere prelevati con una siringa ed inseriti in una provetta sterile. Più frequentemente questi due liquidi biologici si trovano come macchie, che possono essere prelevate seguendo le raccomandazioni suggerite per le macchie di sangue e di sperma. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

76 materiali particolari Accanto ai reperti classici di cui si è parlato sopra, è possibile rinvenire numerosi materiali che potenzialmente contengono tracce di materiali biologici, di varia origine. Tra i materiali particolari e sulle modalità del prelievo, si ricordano alcuni tipi di tracce piuttosto frequenti, nelle quali è facile imbattersi nel corso del sopralluogo: mozziconi di sigarette - devono essere prelevati con un paio di pinzette ed inseriti in contenitori separati, anche se sono della stessa marca e dello stesso tipo e se sono stati rinvenuti per esempio nello stesso portacenere. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

77 buste da lettera e francobolli - le buste da lettera ed eventuali francobolli, attaccati o meno, possono venire facilmente conservati in una busta di carta; residui di feci - Si tratta di prelevare un campione di un residuo di feci ed inserirlo in un contenitore di vetro, lasciandolo asciugare all aria. Materiali che contengono residui di feci, come fazzoletti, frammenti di carta, vengono repertati senza particolari accorgimenti e conservati in contenitori sterili. proiettili - residui di sangue, capelli, tessuti, sono presenti sulle ogive che hanno attraversato un corpo, anche se talvolta in quantità irrisoria ed invisibile. Successivamente, in laboratorio verranno prelevati i residui biologici con metodiche particolari, senza danneggiare il reperto per le comparazioni balistiche. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

78 L importanza di identificare la natura del campione biologico Illuminatori a diverse lunghezze d onda Saliva Sperma

79 Diagnosi generica i test di orientamento Suggeriscono la presenza di un certo tipo di campione biologico Test al luminol per sostanza ematica Falsi positivi Detergenti Tensioattivi Vernici Succhi di frutta

80 Diagnosi generica e di specie Occorrono metodi specifici per identificare una certa sostanza. Test OBTI per sostanza ematica Falsi positivi Emoglobina di altri primati

81

82 I limiti del test del DNA Gemelli identici non possono essere distinti con il DNA. Campioni degradati e/o contaminati, tracce miste possono non essere interpretabili. Il test del DNA è quasi sempre un esame comparativo. ATTENZIONE: il campione biologico si può facilmente trasportare da un luogo all altro. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

83 Casi pratici Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

84 Accertamenti tecnici ripetibili e non ripetibili Art. 359 cpp Art. 360 cpp Operazioni tecniche per le quali sono necessarie specifiche competenze

85 Accertamenti tecnici ripetibili Non esiste in realtà una simile dizione nel codice. Sono dunque da identificare per differenza in riferimento agli accertamenti tecnici previsti dall'art. 359 cpp con il limite dei non ripetibili di cui all'art. 360

86 CASO 1 - Furto aggravato Nell estate 2001 vennero perpetrati alcuni furti in scuole elementari e materne nella zona di Rignano. I Carabinieri repertarono nei locali ove erano avvenuti i furti alcuni mozziconi di sigaretta e una macchia di sangue, verosimilmente lasciata da uno dei ladri. Il Magistrato chiese di determinare il profilo genetico della saliva sui mozziconi e della macchia di sangue e di comparare i risultati con i profili assunti dai Carabinieri a tre indagati. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

87 CASO 1 - Furto aggravato Dei tre reperti prelevati in tre distinti episodi, due furono associati a un indagato dal quale si era riusciti a ottenere il profilo genetico. Fu così possibile associare questa persona a due distinti episodi criminosi. Accertamenti indiretti della P.G. su l indagato permisero poi di arrestare anche i suoi complici che avevano lasciato l altra traccia biologica. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

88 CASO 2 - Omicidio di Via della Scala a Firenze L 8 novembre 2003 viene trovata uccisa Rossana D Aniello nel suo appartamento di Via della Scala. Le primissime indagini fanno sospettare dell episodio un uomo, uno spasimante respinto. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

89 CASO 2 - Omicidio di Via della Scala a Firenze Sul posto nel frattempo vengono rinvenute delle tracce di sangue lontane dal rinvenimento del cadavere, cosa che fa sospettare che il sangue sia dell omicida. Il Magistrato dispone quindi un immediata consulenza tecnica: Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

90 CASO 2 - Omicidio di Via della Scala a Firenze Il sangue risulta di una donna, diversa dalla vittima! Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

91 CASO 2 - Omicidio di Via della Scala a Firenze Ulteriori esami sul sangue, tramite il DNA mitocondriale, dimostrano che si tratta di una donna non imparentata per via femminile con la vittima. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

92 CASO 2 - Omicidio di Via della Scala Gli investigatori, tramite tabulati telefonici, identificano una ex compagna di scuola del marito della vittima, Daniela Cecchin, che aveva telefonato in quei giorni alla vittima. Daniela Cecchin viene arrestata e confessa pochi giorni dopo il delitto. Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

93 Caso 3 Omicidio paninoteca Nella notte del 4 dicembre 2003 veniva commesso omicidio del gestore di una paninoteca in via Panicale colpito con quattro colpi di coltello. Intervenuti sul posto gli uomini della scientifica, questi repertavano tra le altre cose, tracce ematiche, mozziconi di sigaretta ed una lattina di Coca Cola semivuota. Tali reperti venivano poi sottoposti ad una serie di esami volti alla ricerca di sostanza biologica.

94 Caso 3 Omicidio paninoteca repertazione Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

95 Caso 3 Omicidio paninoteca repertazione Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

96 Caso 3 Omicidio paninoteca repertazione Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

97 Caso 3 Omicidio paninoteca test sostanza ematica / sangue umano Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

98 Caso 3 Omicidio paninoteca test amilasi Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

99 Caso 3 Omicidio paninoteca profili estratti Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

100 OMICIDIO A SEGUITO DI UNA RISSA Associazione Identificazioni Forensi - A.I.Fo.

101 IMPUTATI CHE HANNO FORNITO UN CAMPIONE DI SALIVA 181_1: VMR Mario; 181_4: CSC Cesar; 181_6: CLC Aham; 181_7: AEM Roberto; 181_8: AEJ Louis; 181_9: SC Joell; 181_10 : UY Yolanda ; 181_12 : CC Augusto. 181_V: Andrade Churata Edwin Richard (vittima) IMPUTATI CHE NON HANNO FORNITO UN CAMPIONE DI SALIVA YI Ezechiel; YI Yparragguirre; V Hugo; QI Cristian; VP Veronica; CEJ Aurelio.

102 Diagnosi di natura con benzidina e con analisi del citocromo B. Esame con Luminol su indumenti privi di macchie evidenti. Profilo genetico con sistema di 15 marcatori genetici + un marcatore per la diagnosi di genere.

103 181_1: VMR Mario; 181_4: CSC Cesar; 181_6: CLC Aham; 181_7: AEM Roberto; 181_8: AEJ Louis; 181_9: SC Joell; 181_10 : UY Yolanda ; 181_12 : CC Augusto. 181_V: Andrade Churata Edwin Richard (vittima)

104 181_1: VMR Mario; 181_9: SC Joell; 181_4: CSC Cesar; 181_10 : UY Yolanda ; 181_6: CLC Aham; 181_12 : CC Augusto. 181_7: AEM Roberto; 181_V: Andrade Churata Edwin Richard (vittima) 181_8: AEJ Louis;

105 Probabilità di condivisione casuale 181_1: VMR Mario; 181_9: SC Joell; 181_4: CSC Cesar; 181_10 : UY Yolanda ; 181_6: CLC Aham; 181_12 : CC Augusto. 181_7: AEM Roberto; 181_V: ACE Richard (vittima) 181_8: AEJ Louis;

106 ESAME DI MATERIALI SEQUESTRATI DAI CARABINIERI IN PIAZZA VITTORIO VENETO E NEI PRESSI

107 A = tracce ematiche B = tracce ematiche C = bottiglie D = maglia di cotone marca Los Angeles con macchie di sangue E = tracce ematiche F = Corriere della Sera intriso di sangue G = maglia di cotone marca Challenger con macchie di sangue maglia di cotone marca Cool Knit con macchie di sangue

108 A = tracce ematiche B = tracce ematiche C = bottiglie D = maglia di cotone marca Los Angeles con macchie di sangue E = tracce ematiche F = Corriere della Sera intriso di sangue G = maglia di cotone marca Challenger con macchie di sangue maglia di cotone marca Cool Knit con macchie di sangue

109 A

110

111 uomo sconosciuto uomo sconosciuto

112 uomo sconosciuto COLTELLO VMR Mario

113 Villavicencio VMR Mario Milon Roberto Mario

114

115 C B

116

117 uomo sconosciuto Soggetto verosimilmente Soggetto correlato correlato con CHAVEZ con CC Augusto ESPINAL CESAR AUGUSTO vittima Andrade Curata Edwin Richard (vittima) vittima Andrade Curata Edwin Richard (vittima) uomo sconosciuto vittima Andrade Curata Edwin Richard (vittima)

118 181_1: VMR Mario; 181_9: SC Joell; 181_4: CSC Cesar; 181_10 : UY Yolanda ; 181_6: CLC Aham; 181_12 : CC Augusto. 181_7: AEM Roberto; 181_V: ACE Richard (vittima) 181_8: AEJ Louis;

119 E altamente verosimile che le tracce di sangue provengano da un individuo imparentato con CC AUGUSTO. L ipotesi più probabile è che tale campione provenga da un fratello germano (quindi di padre e di madre) di CC AUGUSTO. Tale ipotesi è volte più verosimile rispetto all ipotesi che il campione appartenga a un soggetto non correlato dello stesso C. In termini probabilistici, assumendo una probabilità a priori del 50%, tale verosimiglianza equivale a una percentuale del 99,97% circa.

120 B C

121 vittima vittima

122 D

123

124 E

125

126 uomo sconosciuto

127 uomo sconosciuto

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