Salvatore Tripodi. La biologia molecolare applicata all immunoterapia specifica. Allergologia Pediatrica Ospedale Sandro Pertini
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1 Salvatore Tripodi Allergologia Pediatrica Ospedale Sandro Pertini La biologia molecolare applicata all immunoterapia specifica
2 k Tests Skin Prick Dottore, mio figlio è allergico a tutto!?!
3 Produttore di allergene Fonte allergenica Molecola allergenica Der p 1 Ghiandole salivari e cutanee Fel d 1 Ghiandole salivari e cute Can f 1
4 Nomenclatura delle molecole allergeniche Phleum pratense 1 r = ricombinante n = nativo s = sintetico rphl p 1 Prime 3 lettere del Genere Prima lettera della Specie ordine di identificazione Dermatophagoides pteronyssinus r = ricombinante n = nativo s = sintetico Der p Der p Prime 3 lettere del Genere Prima lettera della Specie ordine di identificazione isoforme a. Peso molecolare simile b. Identica funzione biologica, se nota, per es. attività enzimatica c. > 67% di identità di sequenza amminoacidica.
5 Componenti Allergeniche specifiche e cross-reattivereattive allergeni specifici sensibilizzanti primari allergeni cross-reattivi panallergeni
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7 Marco 8 years, from Verona sneezing, rhinorrhea, itching nose and eyes from March to September, worse with wind and outdoor J F M A M J J A S O N D SPT > 3 mm : birch, grass, mugwort would you prescribe specific immunotherapy? MANY WOULD ANSWER NO
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9 La stagione complessiva dei pollini, e quindi delle pollinosi, tende ad essere più lunga per: anticipo della fioritura di piante invernali e primaverili; prolungamento della stagione per alcune erbe a fine estateinizio autunno. Frenguelli 04
10 Frenguelli et al, An.All.Asthma Immunol La fenologia vegetale in particolare si occupa della definizione delle fasi di sviluppo (o fasi fenologiche) delle piante in particolari scale fenologiche e della registrazione delle date in cui esse si verificano nei diversi ambienti.
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12 Your daughter is allergic to grass! what does it mean? mix timothy grass pollen grains phl p 1 Phl p 1 Phl p 2 Phl p 3 Phl p 4 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 7 Phl p 11 Phl p 12
13 Allergens in a pollen grain (es. Phleum pratense (Timothy grass, Coda di Topo specific Phl p 1 Phl p 2 Phl p 3 Phl p 4 Phl p 5 Phl p 6 timothy highly cross-reactive Phl p 7 Phl p 12 birch in many other pollens and vegetables timothy mugwort
14 specific Allergens in a pollen grain (es. Phleum pratense (Timothy grass, Coda di Topo grass pollen Phleum Lolium Birch Mugwort Phl p 1 Phl p 2 Phl p 3 Phl p 4 Phl p 5 Phl p 6 Lol p 1 Lol p 2 Lol p 3 Lol p 4 Lol p 5 Lol p 6 Bet v 1 Art v 1 polcalcin cross-reactive profilin Phl p 7 Phl p 12 Lol p 7 Lol p 12 Bet v 4 Bet v 2 Art v 5 Art v 4
15 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 2 Phl p 4 Bet v 1 Phl p 6 Phl p 7 Phl p 12 Bet v 4 Bet v 2 timothy grass birch Art v 5 Art v 4 Art v 1 mugwort mugwort
16 Phl p 2 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 4 Grass polcalcin Phl p 7 polcalcin Bet v 4 Birch Bet v 1 Phl profilin p 12 profilin Bet v 2 polcalcin Art v 5 molecular diagnosis with IgE profilin Art v 4 Mugwort Art v 1
17 Phl p 1 Phl p 2 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 4 Grass polcalcin CBP Birch profilin profilin CBP profilin mugwort Mugwort birch histamine grass ctr negative SPT with extracts
18 apparently similar patients (with extracts have totally different patterns of sensitization mugwort birch grass ctr negative histamine SPT with extracts
19 #1 - true polysensitised child Phl p 2 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 4 Grass Birch Bet v 1 molecular diagnosis with IgE Mugwort birch mugwort grass ctr negative Art v 1 histamine SPT with extracts
20 Phl p 2 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 4 Grass Phl p 7 Phl p 12 Birch #2 false polysensitised monosensitised to grass pollen Mugwort molecular diagnosis with IgE birch mugwort histamine grass ctr negative SPT with extracts
21 #3 false polysensitised monosensitised to birch pollen Bet v 1 Grass Bet v 4 Bet v 2 Birch Mugwort molecular diagnosis with IgE birch mugwort histamine grass ctr negative SPT with extracts
22 #4 - false polysensitised = monosensitised to mugwort Grass Birch Art v 5 Art v 4 molecular diagnosis with IgE Mugwort birch mugwort grass ctr negative Art v 1 histamine SPT with extracts
23 #5 - true polysensitised child + panallergens Phl p 2 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 4 Grass Phl p 7 Bet v 4 Birch Bet v 1 Phl p 12 Bet v 2 Art v 5 Art v 4 molecular diagnosis with IgE Mugwort birch mugwort grass ctr negative Art v 1 histamine SPT with extracts
24 Conventional Diagnosis based upon allergenic extracts 1 anamnesis physical examination tentative diagnosis 2 conventional allergy test (SPT, IgE-Ab) 3 Marco IgE-Ab at molecular level Birch, Grass, Mugwort vaccine NO (?) drugs YES Laura Birch, Grass, Mugwort NO (?) YES Anna Birch, Grass, Mugwort NO (?) YES Pino singleplex Grass multiplex YES YES
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26 which allergenic molecules should I test for IgE reactivity? (simplified example specific molecules extract panallergens Polcalcins profilins Phl p 1; Phl p 5 grass Phl p 7 Phl p 12 Bet v 1 birch Bet v 4 Bet v 2 Art v 1 mugwort Art v 5 Art v 4
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28 Schema delle molecole allergeniche primarie e cross-reattive
29 Algoritmo per la diagnosi molecolare nei pazienti polisensibili a pollini IgE Molecolari per markers primari allergeni specifici IgE Molecolari per molecole cross-reattive A (es. Phl p 1) B (es. Ole e 1) c (es. ) Profilline (es. Bet v 2) Polcalcine (es. Phl p 7) POSITIVE CO-SENSIBILIZZAZIONE NEGATIVE NEGATIVE ITS per sensibilizzante/i primario/i POSITIVE CO-RICONOSCIMENTO POSITIVE Individuare Markers di sensibilizzazione primaria
30 Marco 8 years, from Verona sneezing, rhinorrhea, itching nose and eyes from March to October, worse with wind and outdoor J F M A M J J A S O N D SPT > 3 mm : birch, grass, mugwort IgE to molecules? Phl p 1; Phl p 5 grass Phl p 7 Phl p 12 Bet v 1 birch Bet v 4 Bet v 2 Art v 1 mugwort Art v 5 Art v 4 would you prescribe specific immunotherapy? NO MANY WOULD ANSWER YES grass
31 La rete I-Pan e lo studio Panallergeni in Pediatria
32 RICERCARE INSIEME PER CURARE MEGLIO
33 G. Marseglia Ascoli Piceno A. Bianchi Crotone F. Paravati
34 PANALLERGENS IN PAEDIATRICS recruitment & follow-up MI1 MI2 TS GE FI RA RM1 PD RM3 RM4 BN NA BA CZ sera Bio-bank RM TPS clinical data IgE data Allergy Lab. (PD) PD IgE Databank Statistics wp1 profilin, CBP & pollinosis wp2 LTP syndrome wp3 allergy to mites & tropomyosins
35 Domande e Obiettivi dello Studio Panallergeni in Pediatria Le molecole sono collegate alla gravità clinica? Le molecole sono utili nella scelta del vaccino basato sull utilizzo di estratti? Le molecole sono utili ad orientare la CRT? Il monitoraggio è utile alla diagnosi?
36 study time-line recruitment & IgE test in progress planned (? IgE panallergens negative clinical evolution ITS efficacy 12 mo. positive clinical evolution ITS efficacy IgE panallergens 1700 patients Age 4-18y arruolati 1086 bambini
37 PANALLERGENS IN PAEDIATRICS Pilot study: May September 2009 Only centres in Rome 200 patients recruited Target: warming-up, test procedures identify weak points in the protocol Preliminary results?
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39 Cartella Allergo-Pneumologica e Test in vivo 300 campi/dati per paziente Consenso Informato Scheda anagrafica Anamnesi Familiare Anamnesi Patologica Risultati Skin Prick Test Coordinate posizione siero all interno della sieroteca Campionamento del paziente nel sottoprogetto di pertinenza
40 the telematic platform of the Italian Paediatric Allergy Network
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42 Cartella Allergo-Pneumologica: Parametri studiati Criteri gravità rinocongiuntivite ARIA Criteri gravità asma GINA
43 Diario clinico telematico Accesso mediante pwd personale Grafica semplificata e interattiva Anamnesi patologia prossima (Rinocongiuntivite, Asma) Anamnesi Farmacologica Calcolo indici derivati (RTSS)
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50 tripodi *****
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53 prurito oculare lacrimazione starnuti secrezione nasale prurito nasale ostruzione score: 0-18
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58 Curve sintomatologiche ottenute mediante modello statistico di interpolazione dei dati
59 Test in vitro IgEtotali IgEspecifiche contro: allergeni estrattivi singole molecole
60 Cynodon dactylon ncyn d 1 Phleum pratense Phl p 1 Phl p 2 Phl p 4 Phl p 5b Phl p 6 Phl p 7 Ph p 11 Phl p 12 Betula verrucosa Bet v 1 Bet v 2 Bet v 4 Olea europaea Ole e 1 Cupressus arizonica Platanus acerifolia Artemisia vulgaris Art v 1 Ambrosia elatior Parietaria judaica Par j 2 Plantago lanceolata Pru p 3 IgEs UniCAP estratti sensibilizzanti primari panallergeni
61 Distribuzione di frequenza delle singole molecole phlin soggetti positivi all estratto prevalence (%) Phl p 1 Phl p 2 Phl p 4 Phl p 5 Phl p 6 Phl p 7 Phl p 11 Phl p 12
62 No influence of age? perc cent Sensitization to panallergens (IgE>1kU/l) 27.3% 26.8% 28.2% 26.2% 31.6% any Phl p 11 7 (1.5%) Phl p 12 (12.1%) Pru p 3 (15.3%) 0 4 to 6 7 to 9 10 to to to 18 age (years)
63 Influenza del pattern molecolare sulla severità dei sintomi Molecole vs ARIA intermittente-lieve intermittente-mod./severa persistente-lieve persistente-mod./severa
64 Relazione tra numero di molecole di Phl p riconosciute e concentrazione media di IgE contro Phl p 1000,00 100,00 IgE contro Phleum pratensis (ku/l) 10,00 1,00 0,10 0, numero di molecole
65 Ruolo clinico dei livelli di IgE specifiche contro il Phleum pratense medio SMS 1,50 1,45 1,40 1,35 1,30 1,25 1,20 1,15 1,10 1,05 SMS 1,00 <17,5 tra 17,5 e 100 >100 IgE ccontro Phl p (ku/l)
66 Phl p5b - Phl p1 - >0.35kU/l Phl p5b - 48,7% 30 different patterns of IgE sensitization Phl p1- to Phleum pratense (!!! 7% Phl p5b - Phl p1-4,2% Different patients, all sentized to Timothy grass, present different molecular sensitization patterns Heiss S. et al. J Invest Dermatol 1999 Phleum pratensis molecules recognized (Phl p X) Pat b N % , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,0
67 Birch How many Marco? #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #16 #17 panallergens EXTR Bet v 1 Bet v 2 Bet v 4 45,81 22,96 0,10 0,08 36,17 0,27 35,33 0,11 29,72 0,04 0,10 57,77 27,14 25,89 0,04 0,03 25,62 22,85 0,34 0,40 15,50 15,75 0,02 0,02 11,15 13,61 0,03 0,02 9,64 2,93 17,40 0,05 6,73 0,11 7,04 0,06 6,57 8,35 0,01 0,01 5,22 0,03 7,20 0,01 4,40 0,04 4,44 0,02 4,11 2,69 1,78 0,01 2,02 2,16 0,01 0,01 0,88 0,07 1,36 0,02 0,74 0,06 0,03 2,02 0,60 0,47 0,01 0,01 A) true sensitization to birch B) sensitization to birch and to profilin C) sensitization to profilin D) sensitization to polcalcin
68 Birch Timothy grass #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #16 #17 panallergens EXTR Bet v 1 Bet v 2 Bet v 4 45,81 22,96 0,10 0,08 36,17 0,27 35,33 0,11 29,72 0,04 0,10 57,77 27,14 25,89 0,04 0,03 25,62 22,85 0,34 0,40 15,50 15,75 0,02 0,02 11,15 13,61 0,03 0,02 9,64 2,93 17,40 0,05 6,73 0,11 7,04 0,06 6,57 8,35 0,01 0,01 5,22 0,03 7,20 0,01 4,40 0,04 4,44 0,02 4,11 2,69 1,78 0,01 2,02 2,16 0,01 0,01 0,88 0,07 1,36 0,02 0,74 0,06 0,03 2,02 0,60 0,47 0,01 0,01 nel 41% dei casi diagnosi errata di sensibilizzazione a betulla! panallergens EXTR Phl p 1 Phl p 12 Phl p 7 152,99 167,66 27,04 0,08 98,56 49,47 0,05 67,73 155,56 151,79 9,06 0,09 92,60 73,27 4,21 0,02 61,42 62,38 2,08 0,02 24,56 16,61 4,39 0,04 41,39 29,33 0,04 3,15 in this small serie we found seven Marco
69 2004; 101: J Allergy Clin Immunol 2005; 116: Clinical and Experimental Allergy, 2008; 38,
70 Immunotherapy with recombinant grass pollen (Phleum) allergens Double-blind placebo-controlled trial (24 active; 25 placebo) January 2002 to August 2003 Phl p 6 5µg 10µg Phl p 1 Phl p 5b 10µg 10µg 5µg Phl p 2 Phl p 5a Jutel et al, JACI 2005
71 Immunotherapy with recombinant grass allergens Well-days Symptoms 42 A P A P A P Medication Combined SMS = 38.9% P = P = P = Days without sy ymptoms p= Jutel et al, JACI 2005 Score active (n=24); 0 A P placebo (n=25)
72 Phl p 5a/b specific antibody responses Four Phl p 5 IgE-negative subjects treated with a cocktail containing Phl p 5a/b IgG4 ( ng/ml ) IgE ( kua/l ) 1, , ,0 0,8 0,6 0,4 0, blood sample IgG1 ( ng/ml ) Jutel et al, JACI 2005
73 Pattern phla molecole Phl p 1,2,4,5b,6,7,11,12 Phl p 1,2,5b,6,11,12 Phl p 1,2,5b,6 bin pattern 0,35 pz 0,35 n 8 (0,35) bin pattern 0,35 pz 0,35 n 6b (0,35) bin pattern 0,35 pz 0,35 n All (0,35) IgEs x una data molecola: 1= presenti 0= assenti
74 Pattern phla molecole: 75% del IgEs x una data molecola: 1= presenti 0= assenti campione Phl p 1,2,4,5b,6,7,11,12 Phl p 1,2,5b,6,11,12 Phl p 1,2,5b,6 Pattern a 8 molecole: 9 pattern coprono il 75% del campione Pattern a 6 molecole: 7 pattern coprono il 75% del campione Pattern a 4 molecole:3 pattern coprono il 75% del campione
75 Trial con vaccino molecolare (CRT) Phl p 6 5µg 10µg Phl p 1 Phl p 5b 10µg 10µg 5µg Phl p 2 Phl p 5a
76 Quanti pazienti coperti da un vaccino molecolare? (phl p 1,2,5b,6)
77 Monitoraggio Aerobiologico Grazie alla preziosa collaborazione di Alessandro Travaglini (AIA) PRIMA: Previsioni Aerobiologiche del periodo di picco pollinico durante il quale condurre il monitoraggio dei sintomi clinici DURANTE: Determinazione istantanea delle concentrazioni di granuli pollinici e identificazione dei reali picchi pollinici sul territorio romano
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80 ncyn d 1 (allergene primario del G2) 4,09 Phleum pratense (estratto) 9,34 Ph p 1 (allergene primario del G6) 12,70 Ph p 4 (allergene primario del G6) 9,35 Ph p 12 (profilina, panallergene del G6) 0,24 Parietaria judaica (estratto) 5,13 Par j 2 (allergene primario del W21) 0, Giordano, Gram + & Parietaria m 3 medias pollini/m RTSS 0 15/5 17/5 19/5 21/5 23/5 25/5 27/5 29/5 31/5 2/6 4/6 6/6 8/6 10/6 12/6 14/6 16/6 18/6 20/6 22/6 24/6 Graminae Urticacee RTSS 7 Per. Media Mobile (Graminae) 7 Per. Media Mobile (Urticacee) 7 Per. Media Mobile (RTSS) 0
81 CONCLUSIONI L Allergia Molecolare non è il futuro, ma il presente e. 1. può facilmente essere effettuata con i nuovi metodi diagnostici 2. è utile per identificare le sensibilizzazione primarie 3. nei bambini polisensibili 4. può modificare la nostra decisione clinica in relazione alla immunoterapia allergene specifica, quando indicata Il diario clinico on line (AllergyMonitor ) integrato con la conta pollinica può rappresentare uno strumento formidabile per seguire meglio la patologia allergica e per individuare l allergene/i principali nei pazienti polisensibili La rete I-P@N è un importante strumento per svolgere studi in ambito allergologico-pediatrico
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