COMPARAZIONE DELLA METODICA AUTOMATICA SISH

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1 COMPARAZIONE DELLA METODICA AUTOMATICA SISH (Silver Enhanced In Situ Hybridization) CON LA METODICA MANUALE FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) PER LA VALUTAZIONE DELLO STATO DEL GENE HER2 (neu) NEL CANCRO DELLA MAMMELLA 23 luglio 2008 Laura Giorcelli

2 Geni e neoplasie della mammella Nella patogenesi del cancro della mammella sono stati studiati diversi geni tra cui quelli che codificano per: recettore dell estrogeno (ERs) recettore del progesterone (PRs) p53 BRCA1-BRCA2 ErbB2 (HER2) score 1+ score 2+ score 3+

3 ErbB2 (HER2/neu) Protoncogene che codifica per un recettore tirosin-chinasico, appartenente ad una famiglia di recettori per fattori di crescita. Altri membri della famiglia: EGFR, ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4). Il legame di specifici fattori di crescita con ErbB3 e ErbB4, induce una eterodimerizzazione con ErbB2 e successiva trasduzione a valle del segnale. L amplificazione di ErbB2 ed l iperespressione della relativa proteina sono riscontrati nel 20-30% dei cancri della mammella e sono associati ad un decorso clinico più sfavorevole ed a diminuzione del tempo di sopravvivenza.

4 Trastuzumab E un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato, con elevata affinità di legame per la proteina HER2 (neu). Si lega alla porzione extracellulare dei recettore HER2. Inibisce gli effetti sulla trasformazione cellulare maligna a livello dei tessuti epiteliali. Determina la downregolazione dei livelli di espressione e produce alterazioni nella trasduzione dei segnali intracellulari HER2 mediati. Accelera l internalizzazione e la degradazione dei recettori HER2 dalla membrana cellulare. E un potente mediatore della citotossicità anticorpo dipendente cellulo-mediata (ADCC)

5 Herceptin (Trastuzumab) Azione selettiva del Trastuzumab sulle cellule tumorali grazie all elevata espressione dei recettori

6 L importanza dello stato di HER2 Per poter valutare la possibilità di intraprendere una terapia con il Trastuzumab è importante conoscere lo stato di HER2. Il Trastuzumab viene utilizzato: nella malattia metastatica (1998 Stati Uniti, 2000 Europa) in terapia adiuvante (2005 studio HERA) Attualmente l approccio terapeutico più utilizzato è la terapia con Trastuzumab per un anno dopo aver effettuato un ciclo di chemioterapia tradizionale

7 Algoritmo prognostico della valutazione di HER2 IHC Evaluation (Hercept test) score 0, 1+ score 2+ score 3+ No terapia con Trastuzumab Analisi tramite FISH Terapia con Trastuzumab

8 FISH ( Fluorescence in Situ Hybridization) Vysis PathVysion HER2 DNA Probe Sonda di DNA Locus Specific Identifier (LSI) HER2/neu (17q11.2-q12) lunga 190 Kb e direttamente marcata con SpectrumOrange Sonda DNA Chromosome Enumeration Probe (CEP) 17 lunga 5,4 Kb marcata direttamente con SpectrumGreen specifica per la sequenza di DNA alfa satellite nella regione del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1) L ibridazione specifica ai due siti bersaglio porta alla formazione di un segnale fluorescente rosso in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 ed ad un segnale fluorescente verde in corrispondenza di ciascun centromero del cromosoma 17

9 Protocollo FISH su tessuto paraffinato Deparaffinatura del vetrino Pretrattamento enzimatico Melting Ibridazione Lavaggi di stringenza Interpretazione con microscopio fluorescenza

10 Scoring FISH Contare 20 nuclei per campione di tessuto, se possibile da aree di tumore distinte Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totale di segnali CEN-17 verdi. I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati amplificati per il gene HER2 FISH con gene HER2 non amplificato (A-B-C) e con amplificazione del gene HER2 (D) I risultati vicini o coincidenti al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela, se il rapporto è ad un valore limite eseguire il conteggio di altri 20 nuclei e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei

11 SISH (Silver in Situ Enhanced Hybridization) INFORM HER2 DNA Probe (VENTANA MEDICAL SYSTEM) Effettuata in coloratore automatico Preparazione di due vetrini, uno per la valutazione di HER2 ed uno per il centromero del Cromosoma 17 Si effettua in un unica giornata

12 SISH (Silver in Situ Enhanced Hybridization) INFORM HER2 DNA Probe (VENTANA MEDICAL SYSTEM) I vetrini vengono privati della paraffina e sottoposti a trattamento con proteasi per permettere alle sonde di penetrare nelle cellule. Tali sonde, marcate con DNP (2,4 dinitrofenolo), si legano a specifiche sequenze target di DNA. Il probe, marcato con DNP è visualizzato mediante anticorpo primario anti-dnp di coniglio ed anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato a perossidasi di rafano (HRP) utilizzata come substrato cromogenico. La reazione di ibridazione in situ con argento è pilotata dall aggiunta in sequenza di argento acetato, idrochinone e perossido di idrogeno; in questa reazione gli ioni argento (Ag+) sono ridotti dall idrochinone in atomi di argento metallico. Il precipitato di argento si deposita nei nuclei e una singola copia del gene HER2 (17q11.2-q12), o il centromero del cromosoma 17, viene visualizzata come punto nero.

13 Scoring SISH (1) Metodi di determinazione dello stato del gene HER2

14 Scoring SISH (2) Visualizzazione dei segnali in punti discreti e cluster

15 Risultati-I I parte Nella prima parte del nostro studio abbiamo confontato le metodiche SISH e FISH Analisi in FISH e SISH di 53 pazienti, 52 donne ed 1 uomo, con età media di 63,6 anni, aventi tutti carcinomi infiltranti della mammella Score 2+ all Hercept Test 22/53 pazienti hanno recettori estrogenici maggiori del 50% 19/53 pazienti hanno recettori estrogenici minori od uguali al 50% 12/53 pazienti hanno recettori estrogenici completamente negativi

16 Risultati- I parte Caso positivo: donna di anni 74 Score FISH: >8- Score SISH: >8 Ki67 (Mib-1): 50%; ER: 90%; PR: 90%

17 Risultati-I I parte FISH SISH ,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,6 2,8 3,3 4 8 Distribuzione della frequenza del valore del rapporto HER2/CEN 17 con metodica FISH e metodica SISH nei 53 casi del nostro studio

18 Risultati-I I parte Le due metodiche danno uguale risultato in 51 casi su 53 cioè nel 96,2% dei casi, in 2 casi danno risultati diversi. In entrambe, risultano positivi all amplificazione del gene HER2 9 casi. Le metodiche non concordano nel risultato di 2 dei 9 casi: in un caso la FISH è positiva (score >2.5) mentre la SISH è negativa (score 1.1), nel secondo caso la FISH è negativa (score 1.6) mentre la SISH è positiva (score >3). SISH positiva e FISH negativa sul gene HER2

19 Risultati-I I parte Correlazione tra gli score di FISH e SISH nei 53 casi studiati

20 Risultati- I parte I dati forniti da questo studio hanno dimostrato che le due metodiche prese in esame, la FISH e la SISH sono concordanti nel 96,2% dei casi, soddisfacendo i criteri dell ASCO/CAP (American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists) che richiedono un livello minimo di concordanza del 95%, ed in accordo con i dati di letteratura che indicano un valore di concordanza al 96%. I casi positivi all amplificazione genica sono 9, pari al 16,9% del totale.

21 Caratteristica Tipo di metodica Tempo di esecuzione Caratteristiche dell operatore Tipo di microscopio Tipo di segnale N preparati Decadimento segnale Conservazione Legenda: vantaggio Risultati- I parte Manuale 2 giorni Operatore specializzato A fluorescenza Fluorescenza Rapido svantaggio FISH 1 Necessita di lettura immediata Automatica 6,5 ore Operatore non specializzato Ottico SISH Cromogeno argentico 2 Nessuno Temperatura ambiente Confronto tra le caratteristiche della FISH e quelle della SISH

22 Risultati-II parte Nella seconda parte dello studio abbiamo valutato attraverso analisi con SISH l eventuale amplificazione di HER2 in pazienti con score 1+ all Hercept test Sono state valutate 30 pazienti donne con neoplasie infiltranti della mammella ed età media di 65,6 anni Le pazienti in esame sono stati scelte in base alla loro nulla/scarsa positività ai recettori ormonali (ER e PR): 7/30 pazienti hanno entrambi i recettori ER e PR negativi (-/-); 2/30 pazienti hanno il recettore ER negativo ed il recettore PR positivo (-/+); 6/30 pazienti hanno il recettore ER positivo ed il recettore PR negativo (+/-); 15/30 pazienti hanno entrambi i recettori ER e PR positivi (+/+) La positività di un singolo recettore o di entrambi i recettori non supera mai la soglia del 40%.

23 Risultati-II parte 29 dei 30 casi analizzati sono risultati negativi per amplificazione del gene HER2, un caso è risultato polisomico cioè contenente più di due cromosomi 17 (o centromeri del cromosoma 17) all interno del nucleo. La successiva rivalutazione del caso polisomico in FISH ha dato risultato negativo. Caso polisomico donna di anni 66 Score FISH: 1.1 Score SISH: 1.3 Ki67 (Mib-1):30% ER: - PR: -

24 Risultati-II parte Caso negativo: donna di anni 42 Score SISH: 1.1 Ki67 (Mib-1): >20%; ER: -; PR: - HER2 (foto a sinistra), CEN 17 (foto a destra) Caso negativo per amplificazione genica tramite SISH

25 Conclusioni La metodica SISH presenta alcuni vantaggi e relativamente pochi svantaggi rispetto alla FISH. Per questi motivi pensiamo che possa essere una valida alternativa alla FISH, soprattutto in piccoli centri dove l ibridazione in situ non viene utilizzata su larga scala, ed in cui potrebbe essere effettuata con metodica SISH, con effettivo risparmio economico e di tempo, e senza necessità di personale esperto dedicato. La seconda parte dello studio non ha mostrato evidenze di amplificazione genica in pazienti con carcinoma della mammella con score 1+ all IHC (Hercept Test). E stato quindi confermato che il trend diagnostico-terapeutico seguito attualmente è corretto, essendo legittimo escludere questi pazienti dalla terapia con Trastuzumab dopo la sola esecuzione del saggio immunoistochimico.

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