Laboratorio e diagnostica nel. Prof.ssa Daniela Cabibi Università degli Studi di Palermo

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1 Laboratorio e diagnostica nel carcinoma della mammella Prof.ssa Daniela Cabibi Università degli Studi di Palermo

2 Le risposte che il clinico si attende dall Anatomia Patologica sono sempre più numerose, specie per quanto riguarda le neoplasie mammarie IN PASSATO: Diagnosi di neoplasia su basi morfologiche e stadiazione TNM Immunoistochimica Fattori prognostici Ibridazione in Situ Markers predittivi di risposta alla terapia Sottotipizzazione molecolare della neoplasia

3 All Anatomia Patologica si chiede sempre di più, fornendo sempre meno Resecati chirurgici Core biopsy, microbiopsie in sede metastatica Campioni citologici da agoaspirato ( FNA) Era delle «Biopsie liquide»?! ( ricerca di alleli mutati circolanti nel sangue)

4 Diagnosi di istotipo in base alla morfologia talora difficile Immunoistochimica: e-caderina : carcinoma duttale = + lobulare = Alcuni carcinomi lobulari possono essere +

5 Immunoistochimica nella diagnosi differenziale tra carcinoma invasivo e carcinoma in situ/proliferazioni non neoplastiche actina P63, CD10, CK5/6 : evidenziano la persistenza dello strato di cellule basali nelle proliferazioni non neoplastiche e nel carcinoma in situ

6 Carcinoma tubulare Adenosi florida A CK5/6 P63

7 Fattori prognostici e predittivi di risposta alla terapia Recettori ormonali per estrogeni e progesterone Ki67 HER2

8

9 Importanza di una corretta fase pre-analitica: tempo di ischemia fredda Molti Ag si distruggono in circa 20 min. se non fissati immediatamente implementare la tecnica del sottovuoto estrogestrog+ Core biopsy mammella Stessa pz: resecato chirurgico fissato tardivamente

10 Sottotipi molecolari breast cancer derived from two main cell types: NSG 1) luminal-like cell compartment. Non-basal-like cancers luminal A ( 73%) : ER/ PR+ HER2 neg. Ki67 14%. luminal B(10%): positivo per ER e/o PR, HER2 + o - Ki67 14% HER2 type (5%) : ER / PR neg, HER2. + 2) compartimento basale/myoepiteliale carcinomi basal-like Triplo negativo (12%): ER/PR/HER2 neg, CK5/6 o EGFR= spesso + basal-like

11 HER2 (HER2/neu o c-erb2) proto-oncogene situato nel braccio lungo del cromosoma 17 che codifica una proteina della famiglia dei Recettori dei Fattori di crescita epidermici ( Epidermal Grown Factor Receptors =EGFR) con attività tirosin-kinasica dimerizzazione attivazione

12 Meccanismi di attivazione di recettori della famiglia di ErbB A B PI3K PIP3 P P P P AKt + P P P Src - PTEN P P + RAS + SOS RAF P GBR2 + P P P P P + MEK1 + MEK2 mtor P P P P P ERH 3 sopravvivenza ERH 1 ERH 2 Proliferazione P P

13 HER 2 risulta amplificato/ iperespresso in 15-20% di carcinomi della mammella targeted HER2 therapy= terapia personalizzata -> evidente miglioramento delle curve di sopravvivenza in donne con cancro HER2+ Linea guide ASCO-CAP 2013 raccomandazioni per migliorare l'accuratezza dei test per HER2 per far sì che nessun donna venga esclusa da questa potential life-saving therapy con farmaci per HER2

14 Tutti i carcinomi infiltranti della mammella devono essere sottoposti a test per HER2 Un anno di trattamento negli USA= $70,000 Necessità di identificare le donne HER2 negative per evitare un trattamento inutile, potenzialmente tossico e COSTOSO

15 HER2: metodi attualmente impiegati IPERESPRESSIONE PROTEICA IMMUNOISTOCHIMICA AMPLIFICAZIONE GENICA IBRIDIZZAZIONE IN SITU (FISH/CISH/SISH)

16 Score immunoistochimico ASCO-CAP2013 HER2 negativi (0-1+): positività di membrana, assente o incompleta, appena percettibile in <10% delle cellule HER2 positivi ( score 3+): positività forte e completa in > 10% delle cellule Casi 2+: modificati rispetto allo score FDA e ASCO-CAP 2007 a)positività debole/moderata anche se incompleta in>10% b) positività forte e completa in<10% delle cellule

17 Nei casi 2+, ripetere il test con ISH Nel valutare il risultato di HER2, bisogna sempre tenere in mente il quadro clinico generale p.es: fare attenzione al tumore G1, positivo per recettori ormonali, basso ki67 ma HER2+ O, viceversa, al tumore G3, negativo per recettori ormonali, alto Ki67 ma HER2-

18 HER2-negative (1+) breast cancer with unfavorable prognostic features: to FISH or not to FISH? (Iorfida et al. Ann.Oncol. 2012) Il 13% dei casi 1+ ma che presentano almeno un ulteriore fattore di rischio risultano amplificati in ISH alto grado, alto Ki 67, Fattori di rischio invasione vascolare estesa, LN+, rec.ormonali assenti

19 CISH Chromogenic In Situ Hybridization Permette di individuare al microscopio ottico in campo chiaro specifiche sequenze geniche a livello della singola cellula tramite la deposizione di un cromogeno

20 Definizione ibridizzazione Reazione specifica di una sonda con un acido nucleico target Marcatura fluorescente/cromogenica Sonda DNA Target 5 3 T T A C A A G T A T C G T G A T G A T T C A G C A T C C G 5 3 Ibrido Ibridazione T A C T A A G T C G T A Marcatura fluorescente/cromogenica T G A T G A T T C A G C A T C C G

21 CISH: la procedura Il pretrattamento La dispensazione della sonda La denaturazione L ibridizzazione I lavaggi di stringenza La rivelazione La controcolorazione L interpretazione dei risultati I controlli

22 Le sonde HER2 cromosoma 17 (centromero) Sonde a DNA coniugate con Digossigenina Biotina/digossigenina

23 Il segnale Una copia del gene HER2 appare come un piccolo, singolo dot brunastro Patterns riscontrabili (63x-100x) Singoli dot Clusters

24 Risultati (ASCO/CAP 2013) Da osservare in una popolazione omogenea e contigua Risultato amplificato: Single-probe: > = 6.0 segnali di HER2/cell in media Dual-probe : HER2/CEP17 ratio > = 2.0 HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 > = 6.0 segnali/cell Risultato equivoco: Single-probe: numero di segnali di HER2 compreso tra 4.0 e 6.0 /cell Dual-probe: HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 compreso tra 4.0 and 6.0 segnali/cell. Risultato negativo: Single-probe; numero medio di segnali HER2 < 4.0 segnali/cell Dual-probe HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 < 4.0 segnali/cell

25 Artefatti tecnici: CDI diagnosticato come HER2 3+ su core biopsy nel 2008 MTS epatica HER2 negativa dopo 2 anni Falso positivo: aspecificità causata dall incompatibilità tra anticorpo e sistema di rivelazione

26 Carcinoma duttale infiltrante ampia area centrale HER2 neg Linfonodo HER2 3+

27 focolai HER 2=3+ nel grasso peri-linfonodale Eterogeneità tumorale?? Falsa negatività del tumore primitivo per inadeguata fissazione??

28 nno 2006: Donna di 65 anni: Carcinoma lobulare infiltrante (G3) metastatico al linfonodo sent. A Her 2 neg 1+ HER2 neg anche sul LNS

29 Dopo 6 anni mts cutanea addominale HER2 =3+

30 ripetendo Her2 sul tumore primitivo: rare cellule 3+

31 Possibili variazioni di HER2 tra mts e tumore primitivo ( 5-15% dei casi) Ipotesi Cause biologiche: Vero cambiamento della biologia del tumore? Etereogeneità tumorale? Cause tecniche: Casi 1+ con fattori di rischio ma non testati all ISH? Diverse modalità di esecuzione di HER2 nel corso degli anni? Diversi criteri di lettura con le nuove linee guida ASCO-CAP 2013 Testare HER2 anche nelle recidive e nelle metastasi, specie se il tumore primitivo era negativo (ESMO), (ASCO), (NCCN) La re-biopsia ha portato ad un cambiamento della terapia nel 14% delle pazienti

32 "A bad test can be just as bad as a bad drug." Non può esistere un buon patologo senza un buon laboratorio di Anatomia Patologica GRAZIE!

33 It is essential to ensure that time to fixation (cold ischemic time) and time in fixative (which has increased from 6 to 48 hours to 6 to 72 hours in this Update on the basis of available data and to conform with the ASCO/CAP) are recorded and considered in defining the test result.

34 COMMENT: Fixation time and HER2/neu assessment. Bohn OL, Sanchez-Sosa S (Am J Clin Pathol. 2011) The authors evaluated only 3+ carcinomas and did not include 2+ equivocal cases, Numerous studies have shown high concordance between FISH and ICH 3+tumors; in contrast, 2+ cases are the most likely to be discordant by FISH. Time and type of fixation and the postfixation treatment contribute to the quality of. ISH staining results further studies on preanalytic factors including 2+ equivocal cases are necessary to demonstrate that formalin fixation time has little or no impact on HER2/neu expression

35 ma anche le altre avrebbero avuto score 2+ secondo ASCO-CAP 2013 e amplificazione alla SISH -> caso di etereogeneità tumorale

36 Etereogeneità tumorale: Efficacia della targeted terapia adiuvante per Her2 anche nei tumori luminal-type (positivi per estrogeni e negativi per HER2 ) -->blocca la piccola popolazione di stem cells, HER2+ che pur costituendo solo 1-5% del tessuto tumorale, potrebbe essere responsabile della crescita tumorale e delle metastasi! Hasan Korkaya, Max S. Wicha, Cancer Research 2013

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