Her-2 nel carcinoma mammario

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1 Her-2 nel carcinoma mammario Piera Balzarini U.O. Anatomia Patologica Università degli Studi di Brescia Spedali Civili di Brescia

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3 Il gene ERBB2 dà origine ad un recettore tirosin-chinasico appartenente alla famiglia degli Epidermal Growth Factor Receptors All interno di un organismo, la crescita e il differenziamento delle varie componenti cellulari sono finemente regolati attraverso una complessa rete di segnali extracellulari. Le varie cellule sono in grado di rispondere a queste molecole segnale grazie alla presenza di specifici RECETTORI di membrana dai quali in seguito trae origine la trasduzione del segnale.

4 I recettori tirosin-chinasici agiscono fosforilando specifiche proteine bersaglio, catalizzano cioè l aggiunta di un gruppo fosfato su determinati residui tirosinici. In questo modo il segnale originale viene tramutato in un ordine al quale la cellula risponderà in vari modi (es. aumentando la proliferazione)

5 L alterazione di un recettore tirosinchinasico, dovuta ad un amplificazione o all attivazione costitutiva, comporta una de-regolazione della crescita e la successiva acquisizione di un fenotipo tumorale.

6 Recettori tirosin-chinasici

7 La famiglia HER HER2 appartiene alla famiglia dei recettori per l EGF, i membri di questa famiglia sono costituiti da: -una porzione extracellulare contenente il sito di interazione con il ligando -un segmento transmembrana -una regione citoplasmatica dotata di attività tirosin-chinasica

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9 Ligandi A differenza degli altri membri della famiglia HER, HER2 non sembra interagire con un ligando d elezione, è perciò denominato RECETTORE ORFANO Eterodimerizzazione D altra parte HER2 rappresenta il partner di eterodimerizzazione preferito dagli altri membri della famiglia, contribuendo all ATTIVAZIONE della cascata fosforilativa

10 HER-2/neu (c-erbb2) L amplificazione dell oncogene Her-2/neu è stata evidenziata in media nel 20-30% di carcinomi della mammella. Elevati livelli di Her2/neu sembrano costituire un fattore prognostico negativo con minore risposta alla chemioterapia e maggiore tendenza alla recidiva. D altra parte l'iperespressione / amplificazione di HER2 rappresenta il criterio di selezione delle pazienti per la terapia con il farmaco Trastuzumab (Herceptin TM ).

11 HER-2/neu (c-erbb2) Come si valuta lo status di Her-2/neu? espressione proteica: IIC amplificazione genica: FISH

12 FISH Tecniche che permettono di monitorare i diversi stadi dell espressione di HER2

13 Her2/neu e immunoistochimica Screening con IIC (IIC) Attraverso un ANTICORPO specifico si analizza l espressione della proteina HER- 2, per esempio, tra gli anticorpi rivolti verso la porzione intracellulare di HER2:» CB11» HercepTest

14 Cellula normale (presente nel normale tessuto mammario) Cellula tumorale (nel carcinoma mammario si può osservare iperespressione proteica) Cellula tumorale (azione del farmaco anticorpale Trastuzumab)

15 c-erbb-2 e IMMUNOSTOCHIMICA SCORE c-erbb-2 PATTERN DI COLORAZIONE 0 negativa Assente o debole colorazione di membrana in meno del 10% delle cellule tumorali 1+ negativa Colorazione debole e incompleta della membrana, osservata in più del 10% delle cellule tumorali 2+ positiva Colorazione debole/moderata e completa della membrana, osservata in più del 10% delle cellule tumorali 3+ positiva Colorazione forte e completa della membrana, osservata in più del 10% delle cellule tumorali

16 Come utilizza questo dato il clinico?

17 Come utilizza questo dato il clinico?

18 Score HT trastuzumab Valutazione FISH: n segnali HER-2/CEP17 > 2

19 Come otteniamo queste immagini?

20 Tecnica FISH Tecnica FISH

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24 FISH: GENETICA MOLECOLARE La FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotiche marcate (DNA probes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovvero determinate sequenze del DNA. STEP: -denaturazione del DNA -incubazione sonda + DNA denaturato [ annealing ] -rivelazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza

25 Campioni di DNA FISH: tappe della metodica Cromosomi in metafase o nuclei interfasici

26 FISH Her-2: dove? - SEZIONI IN PARAFFINA - CITOINCLUSI - CITOLOGICI (BIANCO o DECOLORATI)

27 Test FISH Her-2 vetrini blocchetto Fetta in bianco Fetta colorata con EE

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32 Interfase Metafase Interfase e Metafase

33 Centromeric and locusspecific probe: Metaphase and interphase analysis A) centromeric and B) locus-specific probes to detect structural aberrations

34 La FISH è in grado di valutare il n di copie del protooncogene Her-2/neu (sonda LSI ), in relazione al numero di cromosomi 17 (sonda CEP17) per distinguere l amplificazione genica dall aneuploidia cromosomica [Jimenez et al., 2000]. esiste amplificazione genica se: n segnali c-erbb2/cep17 2 [Pauletti et al., 1996; Gancherg et al., 2000; Hanna et al., 2001]

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36 L'iperespressione proteica / amplificazione di Her-2/neu rappresenta: 1) Marker prognostico in quanto permette di prevedere il probabile decorso ed esito della malattia 2) Marker predittivo in quanto viene utilizzato per predire la risposta della paziente alla chemioterapia ed alla terapia ormonale; ; inoltre esso seleziona le pazienti per la immunoterapia con Trastuzumab.

37 IIC

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39 Trastuzumab Il farmaco Herceptin TM è costituito da un anticorpo monoclonale umanizzato rivolto verso la porzione extracellulare della proteina HER-2. Mediante tecniche di ingegneria genetica, è stato possibile costruire una molecola in grado di riconoscere in modo specifico la proteina, limitando il rischio di reazioni immunitarie avverse; il 95% dell anticorpo Herceptin TM è infatti di natura umana, mentre la porzione murina (che riconosce l epitopo specifico) costituisce solamente il 5%.

40 Meccanismo di azione

41 Meccanismo di azione Non si conosce l esatto meccanismo attraverso cui il trastuzumab induce una parziale remissione del tumore e un aumento di sopravvivenza nelle pazienti. Ipotesi proposte: - Blocco della crescita del tumore: l interazione di Herceptin con la proteina HER2 sulla superficie della cellula tumorale induce l internalizzazione del complesso Ab-recettore. In questo modo viene a mancare il segnale proliferativo indotto dal recettore HER2.

42 Meccanismo di azione - ADCC: citotossicità cellulare anticorpomediata. Il legame di Herceptin con la proteina HER2 costituisce un segnale attivatorio nei confronti delle cellule Natural Killer che aggrediscono la cellula tumorale - Sinergia con la chemioterapia: il trattamento con Herceptin sembra inibire la riparazione delle cellule tumorali danneggiate dal chemioterapico

43 Quali sono i fattori che influenzano la precisione del test? Fase pre-analitica - pezzo operatorio vs agobiopsia - tempo di invio in laboratorio - modalità di fissazione e di processazione Fase analitica - scelta dell'anticorpo/sonda - sono necessari controlli positivi e negativi

44 Quali sono i fattori che influenzano la precisione del test? Fase post-analitica - interpretazione dei risultati dei test IIC/FISH - presenza di artefatti o di eterogeneità biologica

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50 IIC IIC

51 FISH: dual probe

52 APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE PER LA DIAGNOSI BIOLOGICA DEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA Oncologo: richiede il test appropriato e si confronta con l'anatomopatologo per l'interpretazione Chirurgo: è responsabile del prelievo e deve garantire l'invio in tempi accettabili del campione al laboratorio di AP

53 APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE PER LA DIAGNOSI BIOLOGICA DEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA TECNICO DI LABORATORIO: processa i campioni prestando particolarmente attenzione a tutti i dettagli tecnici che possono influenzare il risultato. Le fasi cruciali pre-analitiche sono: tempistiche ottimali e tipo di fissazione, timing del sezionamento, depaffinazione e smascheramento / pre-trattamento.

54 APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE PER LA DIAGNOSI BIOLOGICA DEL CARCINOMA DELLA MAMMELLA ANATOMO PATOLOGO: deve valutare la qualità e la corretta preparazione del campione da analizzare e in sinergia con il BIOLOGO deve eseguire controlli interni ed esterni e di interpretare i risultati in base al sistema suggerito dall'algoritmo internazionale.

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56 Il test HER2 un approccio multidisciplinare ONCOLOGO PATOLOGO PAZIENTE CHIRURGO TLB

57 Solo due esempi prima di salutarci!

58 Eterogeneità genetica

59 Agobiopsia maggio 2013

60 Mastectomia, settembre 2013

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