Produzione di agenti terapeutici

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1 Produzione di agenti terapeutici AGENTI TERAPEUTICI RICOMBINANTI Vantaggi Produzione in grande quantità a costi ridotti Sicurezza (es: GH e fattori della coagulazione) Possibilità di ingegnerizzazione 1

2 Geni di proteine (potenziali agenti terapeutici) clonati: >500 Agenti terapeutici di origine biotecnologica autorizzati da FDA: 50 NB: Dati del

3 Diabete di tipo 1 - malattia multifattoriale: cause genetiche e ambientali - Linfociti T si attivano e distruggono le cellule beta del pancreas che producono insulina Insulina: Non contiene modificazioni post-traduzionali Piccole dimensioni 1978: sintesi dei geni delle catene A e B e clonaggio in 2 vettori di espressione. Purificazione delle catene A e B e formazione di legami disolfuro in provetta. 3

4 Recombinant Biopharmaceutical Products in the U.S. Market Recent FDA Approvals 2006: Insulin, rdna, inhaled/pfizer [Exubera Insulin, recombinant powder for inhalation]; Treatment of adults with type 1 and type 2 diabetes. 2005: CTLA4-Ig, rdna [Orencia; Abatacept; cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen 4--Immunoglobulin G1 fragment fusion protein, recombinant] Bristol-Myers Squibb Co. Treatment of rheumatoid arthritis in moderate to severe adult patients. Insulin-like Growth Factor-1, rdna/tercica [Insulin-like Growth Factor-1, recombinant IGF-1] Treatment of growth failure in children with severe primary IGF-1 deficiency (Primary IGFD) or with growth hormone (GH) gene deletion who have developed neutralizing antibodies to GH. Hyaluronidase, rdna [Hylenex; Chemophase; rhuph20; PH-20 hyaluronidase, recombinant human]. To enhance the delivery of local anesthesia, contrast agents, and for subcutaneous fluid replacement (hypodermoclysis). PDGF, rdna/bone matrix [Platelet-derived growth factor (PDGF)-BB, recombinant with inorganic bone matrix] Treatment of periodontal bone defects and associated gingival recession. Calcitonin, rdna [Calcitonin (salmon) - Fortical; calcitonin, recombinant] Treatment of postmenopausal osteoporosis Insulin detemir, rdna - [Insulin detemir, recombinant - Levemir] Treatment of diabetes mellitus (type 1 and type 2; [a long-acting recombinant insulin analog] MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI Isolamento dei cdna negli anni 80 IFNα, IFNβ: sintetizzati da vari tipi di cellule in risposta a un infezione virale IFNγ: secreto principalmente da cellule T CD8+. Induce l espressione delle proteine MHC di classe I e II, e favorisce la presentazione dell antigene. sintetizzato in risposta ad agenti che stimolano la crescita cellulare (inibitore della proliferazione) 4

5 IFNα 23 varianti kda Estremità N-terminale variabile Parte centrale o C-terminale più conservata I vari sottotipi hanno tutti attività antivirale e antiproliferativa sebbene con specificità diverse 5

6 MANIPOLAZIONE DEGLI INTERFERONI Attività di alcuni IFNα ibridi: Induzione della sintesi di (2-5 ) oligonucleotide sintetasi Oligonucleotidi 2-5 Attivazione di una ribonucleasi cellulare latente che taglia mrna virale 2 Attività antiproliferativa maggiore in vari tumori 6

7 MANIPOLAZIONE DELL ORMONE DELLA CRESCITA hgh nativo può legarsi al proprio recettore o al recettore della prolattina => Modificazione del sito di legame con il recettore della prolattina tramite MUTAGENESI SITO-SPECIFICA allo scopo di evitare effetti collaterali nel corso della terapia (His18, His21, Glu174) Ulteriori studi necessari per approvazione FDA 7

8 Ottimizzazione dell espressione Selezione del sistema di espressione ottimale allo scopo di ottenere: - Un prodotto autentico - Una quantità sufficiente per clinical trials e commercializzazione Livelli di sintesi di interleuchina 3 in diversi ospiti 8

9 Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica Malattia ereditaria ad esito fatale tra le più comuni Individui affetti suscettibili di contrarre infezioni polmonari batteriche I batteri causano accumulo di muco nei polmoni Il muco è formato da DNA e polisaccaridi Trattamento delle infezioni polmonari batteriche nella fibrosi cistica - DNasi I - ALGINATO LIASI 9

10 Dnasi I Pulmozyme (Genentech) - Dnasi I umana ricombinante - Clonaggio, espressione, purificazione - Somministrazione tramite aerosol - Riduce la viscosità del muco Approvazione FDA milioni di $ di vendite nel 2001 Alginato liasi Alginato -polisaccaride costituito da β-d-mannuronato e α- L-guluronato, che da luogo a legami trasversali fissando ioni Ca++ -secreto dai ceppi mucoidi di Pseudomonas aeruginosa 10

11 Isolamento del gene alginato liasi - da una specie di Flavobacterium - screening di una genoteca in E. coli in che modo? 1. Piastratura dei cloni su terreno solido contenente alginato 2. Aggiunta di Ca ++ : il terreno diventa opaco. 3. Rimane un alone trasparente attorno alle colonie esprimenti alginato liasi che hanno idrolizzato l alginato 4. Analisi del DNA clonato, espressione e caratterizzazione della proteina 11

12 Alginato liasi di Flavobacterium 63 kda 40 kda 23 kda Amplificazione tramite PCR del tratto codificante per l enzima di 40 kda Clonaggio in Bacillus subtilis: => Alginato liasi secreta nel mezzo di coltura e funzionante su alginato prodotto da P.aeruginosa Ulteriori studi necessari per approvazione FDA 12

13 CDR=regioni determinanti la complementarietà AGENTI TERAPEUTICI BASATI SU ANTICORPI MONOCLONALI Binding antigene Trattamento con papaina Attiva la cascata del complemento Si lega ai recettori per l Fc di cellule: -ADCC -fagocitiche AGENTI TERAPEUTICI BASATI SU ANTICORPI MONOCLONALI IgG murine IgG chimeriche uomo-topo IgG umanizzate 13

14 Anticorpi monoclonali come immunosoppressori: OKT3 OKT3 T cell CD3 T cell CD3 Blocco della funzione delle cellule T Farmaco potente ma con effetti collaterali importanti in via di sviluppo: HuM291 (mab umanizzato) 14

15 Anticorpi monoclonali coniugati Esempio di utilizzo di MAb coniugati PA 15

16 Esempio di utilizzo di MAb coniugati Esempio di utilizzo di MAb coniugati Radioimmunoterapia pre-targeted 16

17 Problemi riscontrati nell utilizzo di anticorpi monoclonali: 1. Accoppiamento chimico difficoltoso e poco riproducibile 2. L impiego di MAb di origine NON umana presenta problemi di reazioni crociate e sensibilizzazione Bisogno di MAb UMANI Estrema difficoltà nel produrre MAbs UMANI con la tecnica dell ibridoma a) Cromosomi instabili in ibridomi linfociti umani/mieloma murino b) Non sono disponibili idonee linee cellulari di mielomi umani c) Ragioni etiche 17

18 Possibili soluzioni: 1. Introduzione (trapianto) di PBLs (peripheral blood lymphocytes) umani in un topo scid 2. Creazione di topi transgenici capaci di produrre un immunoglobulina umana e selezione dei cloni con la normale tecnica dell ibridoma 3. Utilizzare la tecnologia del DNA ricombinante Produzione di anticorpi chimerici uomo-topo 18

19 Produzione di anticorpi umanizzati Produzione di anticorpi umanizzati (I) 1) Ibridoma di topo isolamento del cdna delle catene L e H 2) Amplificazione tramite PCR delle regioni variabili (V H e V L ), clonaggio e sequenziamento 3) Analisi della sequenza e identificazione delle CDR 19

20 Produzione di anticorpi umanizzati (II) 4) Sintesi di 6 coppie di primers (3 CDR L + 3 CDR H ) 5) ~30 pb Coda di 12 nucleotidi complementari alle regioni FR del DNA umano Produzione di anticorpi umanizzati (III) 6) 6 cicli di mutagenesi per sostituire atrettanti frammenti CDR 7) Clonaggio dei geni ricombinanti codificanti catene H e L in vettori di espressione 8) Introduzione in cellule ospiti idonee (E. coli o di mammifero) e produzione degli anticorpi 20

21 >100 anticorpi monoclonali umanizzati con questa tecnica 20 in sperimentazione clinica SVANTAGGI: Tecnica laboriosa e costosa PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI 21

22 PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI Espressione di un frammento Fv anticorpale assemblato PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI 22

23 PRODUZIONE DI FRAMMENTI Fv IN E. COLI M13 COME ALTERNATIVA AL BATTERIOFAGO λ 3 Single chain Fv antibody Per consentire un giusto orientamento dei peptidi 23

24 Disulfide-stabilized Fv antibody Diabete di tipo 1 - malattia multifattoriale: cause genetiche e ambientali - Linfociti T si attivano e distruggono le cellule beta del pancreas che producono insulina Anticorpi monoclonali umanizzati contro il diabete di tipo 1 Keymeulen et al. New England J. of medicine 2005 Jun 23;352(25): [Trial Clinico fase II] -Anticorpi monoclonali anti CD3 umanizzati -80 malati (40 anticorpo -40 placebo) Miglioramento per 12 pazienti il cui livello di produzione di insulina era gia alto. Per gli altri pazienti (28) il bisogno di insulina è rimasto stabile. Effetti collaterali non gravi e passeggeri 24

25 mab utilizzati come agenti terapeutici nella terapia contro il cancro Nome generico Origine Isotipo Target Indicazioni Anno approvaz. mabs non coniugati Trastuzumab (Herceptin) Umanizzato IgG1 umane HER2/neu Cancro al seno 1998 Rituximab (Rituxan) chimerico IgG1 umane CD20 Linfoma 1997 Cetuximab (Erbitux) chimerico IgG1 umane Recettori EGF Cancro al colonretto 2004 Bevacizumab (Avastin) chimerico IgG1 umane VEGF Cancro al colonretto, polmone 2004 Alemtuzumab (Campath- 1H) Umanizzato IgG1 umane CD52 Leucemia linfocitica cronica 2001 Immunoconiugati Ibritumomab tiuxetan (Zevalin) insieme a rituximab Murino IgG1 murine radiomarcato 90 Y CD20 Linfoma 2002 Tositumomab e 131 I tositumomab (Bexxar) Murino IgG2a murine radiomarcato 131 I CD20 Linfoma 2003 Gemtuzumab (Myelotarg) Umano (farmaco derivato da streptomyces) IgG4 umana coniugato con calicheamicina CD33 Leucemia mieloide acuta 2000 FARMACI CONTRO HIV Anticorpi anti-gp120 Proteina CD4 libera Proteina di fusione CD4-Fc 1. Legame alla gp Legame alle cellule recettrici di anticorpi (risposta ADCC) 25

26 Recombinant antibody 2G12 produced in maize neutralizes HIV-1 and can be used as cost-effective vaginal protein microbicide to prevent HIV transmission Monoclonal antibodies that block the binding of HIV to cellular receptors have been shown to prevent viral transmission through mucosal tissue. But such antibodies can be produced only at high cost and low capacity through expression in mammalian cells and are therefore not optimal for commercial manufacture. Two studies describe the purification of the anti-hiv antibody 2G12 from genetically engineered maize on a large and cost-effective scale. Rademacher et al. used a fluorescent marker protein to identify and breed transgenic plants that accumulated a high amount of 2G12 in the seed endosperm, the plant's specialized storage tissue. Ramessar et al. purified the antibody from 2G12-expressing maize without using protein A-affinity chromatography, a step typically used for antibody isolation, but toxic if protein A leaches into the final product. Despite differences between mammalian and plant-specific processing of protein-linked carbohydrate, both studies found that glycan modification of maize-produced 2G12 antibodies did not alter antibody binding to the gp120 subunit of the envelope protein of HIV. The HIV-neutralizing properties of mammalian cell- and maize-produced 2G12 were comparable, with the latter being somewhat more potent. Maize-produced 2G12 could be an effective prophylactic mucosal microbicide, and large-scale plant cultivation and prolonged seed storage in the absence of cold temperatures make this method of antibody production economically attractive. Plant Biotechnol. J. 6, 189 (2008); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3727 (2008). Uccisione selettiva delle cellule infettate da HIV 26

27 When a HIV particle binds to a cell, the interaction of gp120 with CD4 changes gp120's shape. This in turn changes the shape of gp41, in such a way that the gp41 helps to initiate the process of membrane fusion between virus and cell. FUZEON (T20) T-20 is a peptide (a 36 amino acid chain) with amino acid sequences that are identical to a segment of the heptad repeat (HR-1 and HR-2) regions of the gp41 molecule on the HIV envelope. The drug binds to the HR-1 region and disrupts interactions between HR-1 and HR-2 that normally draw HIV into contact with the target cell. By blocking this step, T-20 blocks cell fusion, and consequently, HIV's entry into the cell. 27

28 Münch et al. Discovery and Optimization of a Natural HIV-1 Entry Inhibitor Targeting the gp41 Fusion Peptide Cell 129, , 20 April 2007 To identify natural HIV-1 inhibitors we screened a comprehensive peptide library generated from human hemofiltrate. The most potent fraction contained a 20- residue peptide, designated VIRUS-INHIBITORY PEPTIDE (VIRIP), corresponding to the C-proximal region of α1-antitrypsin, the most abundant circulating serine protease inhibitor. We found that VIRIP inhibits a wide variety of HIV-1 strains including those resistant to current antiretroviral drugs. Further analysis demonstrated that VIRIP blocks HIV-1 entry by interacting with the gp41 fusion peptide and showed that a few amino acid changes increase its antiretroviral potency by two orders of magnitude. Thus, as a highly specific natural inhibitor of the HIV-1 gp41 fusion peptide, VIRIP may lead to the development of another class of antiretroviral drugs. Animali transgenici come bioreattori (Pharming) 28

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