- Assenza di mitogeni - Presenza di segnali conflittuali ( se durano troppo va incontro ad apoptosi) - Segnali differenziativi

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1 Ciclo Cellulare M --> G1--> S --> G2 --> M S, G2 e M hanno durata sempre uguale mentre la fase G1 (in media 10 ore) può subire enormi variazioni da tessuto a tessuto (fino a migliaia di ore per i neuroni). Checkpoints - Tarda fase G1: valutazione di eventuale danno genetico - S: valutazione di danno dovuto ad errori replicativi - Fase G2: completamento della duplicazione del Dna e preparazione della fase M - Fase M: controlla che la segregazione cromatinica si effettui correttamente Segnali Esterni I segnali esterni agiscono come fattori di competenza rendendo la cellula competente per la divisione e rendono la cellula capace di superare il punto di restrizione. Il TGFbeta è un fattore di progressione negativo. IGF1 e IGF2 sono fattori di progressione. La cellula fuoriesce dalla fase G1 ed entra in fase G0 per: - Assenza di mitogeni - Presenza di segnali conflittuali ( se durano troppo va incontro ad apoptosi) - Segnali differenziativi Cicline Le cicline sono proteine regolatorie ad elevato grado di conservazione che sono in grado di legarsi a particolari proteinchinasi intracellulari dette cdks(ciclin dipendent kinase) mediante regioni dette cyclin box. Il legame di una ciclina alla propria cdk determina l attivazione di questo complesso enzimatico in grado di fosforilare alcune proteine implicate nella progressione del ciclo. Le cicline sono divise in classi e sottoclassi (A-H); le più importanti sono comprese tra A ed E. La loro sintesi e degradazione è fase specifica (D aumenta in fase G1 e rimane costante per tutte le fasi, E è prevalente in fase G1, A in fase S e G2, B in fase G2 ed M). CDKS Le cdks sono serin treonin chinasi, attive se legate alle rispettive cicline partners ( la D attiva cdk4 e cdk6, E attiva cdk2, A attiva cdk2 e cdc2, B attiva cdc2). Ciascun complesso attivato è a sua volta attivatore del complesso ciclina-cdk successivo, garantendo la progressione del ciclo. L attività delle cdks può essere modulata negativamente per fenomeni di fosforilazione in due residui specifici(thr 14 e tyr 15) e positivamente ad opera di una fosfatasi, la cdc25. CAK (cdk activating kinase) provoca la fosforilazione di un residuo di treonina che generalmente è in posizione 160. le cdk vengono inibite da cdk inhibitors che moderano le concentrazioni attive delle cdks. CDK Inibitors Le cdk inhibitors sono distinguibili in due grandi classi ed hanno modulazione negativa del ciclo 1 / 6

2 cellulare : - inibitori non selettivi: inattivano la funzione di una serie svariata di cdks. Comprende p21, p27, p57. Agiscono in tutte le fasi del ciclo rendendo il complesso ciclina-cdk inattivo. Legano cyc interagendo con entrambe le parti del complesso. - inibitori selettivi: specifici per cdk4 e cdk6. Comprende p16, p15, p18 e p19. Agiscono solo in fase G1 legandosi a cdk4 o cdk6 prima che esse abbiano formato il complesso con le cicline. In questo modo ne impediscono il legame inattivandole. Legano solo cdk occupando una tasca importante per l attività chinasica (lega ATP). TGFbeta Il TGFbeta ha azione inibitoria nei confronti del ciclo cellulare. A livello del punto di restrizione in tarda fase G1, induce la sintesi di un inibitore selettivo delle cdk, il p15. Questo è in grado di legare il proprio complesso ciclina-cdk spiazzando un inibitore non selettivo p27, il quale, liberato, può andare ad inattivare altri complessi, amplificando l azione di inibizione, con conseguente blocco della proliferazione cellulare. CDK Inibitors Fase G1 Determina la durata di tutto il ciclo. Contiene il primo e più importante punto di restrizione in cui agiscono cdki sia selettivi che non selettivi. Il superamento di questo momento biologico dipende dalla concentrazione di mitogeni o da errori genetici ed avviene ad opera di una serie di eventi che vedono implicata anche la proteina prb. La presenza di mitogeni all inizio della fase G1, induce all interno della cellula la sintesi della ciclina D. I livelli aumentati di ciclina D permettono il legame con la cdk4; tale complesso viene fosforilato da CAK che lo attiva. L azione di questo complesso si esplica fosforilando prb la cui fosforilazione viene amplificata dal complesso E-cdk2 che si forma in una fase più tarda del ciclo, sotto induzione del complesso D-cdk4. Ad opera dei due complessi cicline-cdk, prb si ritroverà iperfosforilato e rilascerà i fattori di trascrizione che indurranno l attivazione di alcuni geni che sintetizzano proteine implicate nel passaggio alla fase S del ciclo. prb è in grado di legare in particolare il fattore di trascrizione E2F attraverso un particolare sito di legame accanto al quale si trova un sito per il prodotto del protoncogene c-abl che viene rilasciato anch esso dopo la sua fosforilazione. E2F lega in tandem DP attivando l istone deacetilasi se Rb è ipofosfoilato o l istone acetilasi se è iperfosforilato. E2F 1, 2, 3a sono attivatori della trascrizione, 3b, 4 e 5 sono repressori della trascrizione. Rb fa parte delle proteine pocket insieme a p107(viene progressivamente sintetizzata così consente alla cellula di proseguire il ciclo di duplicazione) e p130(deve essere degradata per consentire alla cellula di entrare nel ciclo) che hanno sito di legame per vins, tf e complesso ciclina-cdk. Fase S 2 / 6

3 Una volta innescata procede fino a quando tutto il materiale genetico non viene duplicato. Deve essere in grado di garantire la sintesi di una copia esatta di tutto il patrimonio genetico cellulare in un tempo breve(8 ore) e deve compiere questo processo senza errori, superando i possibili problemi di terminazione del DNA di nuova sintesi (GC-telomeri e telomerasi). È caratterizzata dal complesso A-cdk2 o A-cdc2, p53(attiva i meccanismi di riparazione in caso di errori). Se c è un errore p53 è fosforilato da ATM e non è riconosciuto da mdm2 che altrimenti ne induce ubiquitinazione. Mdm2 risulta sequestrato nel nucleolo ad opera della proteina p14arf. Fase G2 Costituisce un breve GAP(2 ore) che segue la sintesi del DNA e precede la mitosi. È sotto stretto controllo di un fattore noto come MPF (metaphase/mitosis promoting factor) costituito dalla ciclina B e cdc2. L attività chinasica di MPF è regolata da processi di fosforilazione (week1) e defosforilazione (cdc25). Il bersaglio diretto di MPF rimane oggi oscuro ma forse fa parte della famiglia delle Map kinasi. MPF nella forma attiva catalizza una serie di reazioni di fosforilazione che danno inizio alla divisione mitotica. Fase M revede la condensazione e la separazione dei cromosomi associata alla migrazione ai poli del fuso mitotico. Un licensing factor garantisce che la duplicazione del DNA avvenga una sola volta prima della separazione cromosomica. Questo fattore è espresso a livello nucleare solo in fase S, ma permane a livello citoplasmatico in fase G2. I processi di destrutturazione e ristrutturazione della membrana in fase M consentono il rientro di questo fattore nel nucleo ove eserciterà la sua azione nelle prossime duplicazioni delle cellule figlie. Vi sono vari mitogeni quali citochine e fattori di crescita che influenzano il reclutamento in G1 di cellule quiescenti. Essi, stimolando soprattutto l espressione di cicline D, determinano la progressione lungo questa fase fino al punto di restrizione(fattori di competenza). I fattori di progressione sono implicati nel superamento del punto di restrizione in fase G1 e del passaggio alle fasi successive del ciclo( MAPK, JAK). Il prodotto del protoncogene myc agisce in forma di eterodimero insieme a max, si lega in maniera specifica su delle sequenze geniche dette I-BOX(caggtg) determinando aumento o diminuzione dell attività proliferativa. Il prodotto di myc agisce da regolatore fisiologico (se c è un eccesso di fitogeni modula l eccessivo stato di proliferazione sttiva, se invece c è carenza di fitogeni, esercita un attività di stimolo della crescita cellulare, in condizioni normali). Se c è una sovra produzione di proteina MAD essa compete con mix per il legame a max per cui può indurre la repressione di segnali mitogenici o la produzione di proteine ad azione negativa sull attività proliferativa cellulare. Quando mix(prodotto di myc) è associato a max o a miz-1, l eterodimero attivo agisce andando a modulare componenti del ciclo: - cdk4 e ciclina D2: i loro livelli di sintesi possono essere incrementati - la degradazione di p21 e p27: può essere indotta sia da myc-max, sia da myc-miz1 anche 3 / 6

4 tramite l aumento delle proteine legate al processo di degradazione tramite ubiquitinazione delle proteine stesse. da un lato questi eterodimeri lavorano inducendo cdk cicline e dall altro bloccano le componenti di controllo negativo del ciclo come p La proteina cul-1 è una componente dell enzima E3 del processo di ubiquitinazione. La componente Fbox dell E3 è la componente di riconoscimento specifico, quindi tramite questa, E3, riconosce e lega la proteina, lega ubiquitina e ne consente la degradazione. Quindi, quando l eterodimero mic-max determina l aumento di E3, aumenta l attività dell ubiquitino ligasi e quindi la capacità degradative nei confronti di proteine specifiche( p21 e p27). Tutti questi effetti causano l aumento della progressione della cellula lungo il ciclo cellulare e passaggio alla fase S. Tutti gli stimoli mitogenici convergono sul terminale Ciclina D e determinano il rilascio dei fattori di trascrizione. Altri fattori come TGFbeta o RB rallentano il ciclo e ne determinano un arresto. Ciclo Cellulare e Cancro Tutti i prodotti di oncogeni attivati favoriscono la progressione lungo il ciclo cellulare; il contrario fanno gli oncosoppressori. I geni antiapoptotici vengono attivati nella trasformazione neoplastica ed i proapoptotici vengono inibiti durante il processo cancerogenetico. Oncogeni e Ciclo Cellulare I prodotti di protoncogeni sono fatscontrata l overespressione di alcune cicline in particolare quelle della classe D(D1,2,E) che quindi si comportano come veri e propri onctori di crescita(sis), recettori di membrana per questi stessi fattori(her2/neu), secondi messaggeri come ras, src, raf e fattori di trascrizione nucleari(jun, fos, myc). In alcuni tumori solidi umani(carcinoma mammario e testicolare) ed in alcune forme leucemiche è stata riogeni. Nel carcinoma mammario è stata riscontrata l overespressione della fosfatasi cdc25. Oncosoppressori e Ciclo Cellulare p53 è alterato in oltre il 70% dei tumori umani. La proteina p53 è sintetizzata in seguito a danno genetico. L aumento delle sue concentrazioni aumenta le concentrazioni di p21, che, inibendo le cdk, permette l arresto del ciclo cellulare per consentire l attivazione, sempre da parte di p53, dei meccanismi di riparazione del DNA o l induzione di apoptosi. L inattivazione di p53 può dipendere dalla proteina mdm2, da essa stessa indotta, che è in grado di legare p53 ed inattivarla, controllando così le sue concentrazioni. Un overespressione di mdm2 determinerebbe un inibizione massiva di p53 e quindi una deregolazione del ciclo, favorendo attività proliferativa senza controllo. Può essere inibita dal legame con proteine di virus oncogeni(e1b, E6, Tag) con conseguenze altrettanto cancerogenetiche. 4 / 6

5 Rb è alterato in diversi tumori umani, la sua mutazione può essere associata anche a mutazioni di due cdk:p15 e p16. Anche prb può essere inattivata dal legame con proteine virali e la sua perdita stimola l apoptosi. Apoptosi e Ciclo Cellulare (vedi oncogeni ed oncosoppressori) Punti di restrizione: tutte le fasi del ciclo cellulare prevedono la presenza di punti di restrizione (controllo). L unico conosciuto è il check point in fase G1 regolato da p53 ma anche da prb e TNF beta. Sono stati identificati particolari fattori proteici di regolazione dei punti di restrizione : MAD per il check point in fase S, RAD9, RAD17, RAD24 per il check point in fase G2(solo in drosophila e c. elegans). P53 contribuisce anche alla regolazione del check point in fase G2 e probabilmente in fase M. La lunghezza dei telomeri potrebbe essere inoltre un fattore limitante la progressione del ciclo. I fattori cui l alterazione è stata associata al processo di trasformazione neoplasica sono: - fattori di crescita - fattori di trasduzione del segnale - fattori di trascrizione(ras, rab, myc) - cicline (overespresse in alcuni tumori umani come ad esempio ciclina D ed E) - inibitori delle cicline sia selettivi che non selettivi i cui geni possono essere meleti(p16 e p21) - oncosoppressori prb e p53 Se si effettua un analisi citofluorometrica si nota come, in una massa tumorale, vi sia una distribuzione anomala delle cellule trasformate durante le diverse tappe del ciclo: - il picco in fase S è molto più elevato rispetto alla condizione fisiologica, a dimostrazione di una intensa attività proliferativa - il picco in fase G1 si riduce fortemente ad indicare che i punti di restrizione sono alterati - nel tessuto normale prima del picco G1 è presente un pre-picco che indica le cellule che sono in apoptosi, questo pre-picco scompare nella maggior parte dei tumori, ad indicare come il processo di morte cellulare programmata venga deregolato. Fonti - Lezioni del Prof. Giuseppe Carrubba, Direttore del reparto di Oncologia Sperimentale del Dipartimento Oncologico dell Ospedale Ascoli - Civico di Palermo 5 / 6

6 - Il Mondo della Cellula, Becker - Kleinsmith Hardin, Edises 6 / 6