PROGRAMMA CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE --- PROF. ROVIGATTI ACCADEMIA NAVALE DI LIVORNO (ANL) --- AA

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1 PROGRAMMA CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE --- PROF. ROVIGATTI ACCADEMIA NAVALE DI LIVORNO (ANL) --- AA Lezione: Venerdì 08 FEBBRAIO REGISTRO: 1. Introduzione corso. La Biologia Molecolare è estremamente importante in Medicina. 2. Nobels in Medicina Ci soffermiamo su 2012: John Gurdon e Shinya Yamanaka. Pietre Miliari: 1865,71, 1903, 1910, 1931, Esperimenti di F. Griffith, O. Avery, A. Hershey e M.Wigler/R. Axel. DETTAGLIATO: Presentazione del Corso: testi consigliati di JD. Watson, B. Lewin e E. Allison. Ulteriori testi di consultazione. 2/3 dei premi Nobel ultimi 50 anni assegnati per ricerche di BM. Assegnazione del Premio Nobel per la Medicina e Chirurgia a Elisabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Shostack nel Natura e funzione dei telomeri e della telomerasi. Problema della replicazione delle estremità (End Replication Problem). Cenni su Replicazione DNA: DNA polimerasi, direzione 5 -à3, primers, frammenti Okazaki, cromosomi, numeri/valori x geni-genoma. L. Hayflink, J. Shay: la basi cellulari, citologiche e molecolari della senescenza. Mantenimento dei telomeri, telomerasi (Th. Cech e J. Lingner), inizio del ciclo Breakage-Fusion-Bridge (BFB) e sue importanti conseguenze per l instabilità genomica e per la carcinogenesi (McClintock). Pietre miliari ed albori BM: 1865, 1871, 1903, 1910, 1913, 1927, 1931 (Mendel, Miescher, Correns, Tschermak, DeVries, Thomas Hunt Morgam, Bridges, Sturtevant, fino a B. McClintock). Sutton e la teoria cromosomica dell ereditarietà. Esordi alla Scuola di Thomas Hunt Morgan. Moscerino occhi bianchi: incroci x wt e Back-Crossing. Due lavori emblematici del gruppo di Roland De Pinho (MD Anderson Cancer Institute) e di Inder Verma (Salk Instute, San Diego) dimostrano l importanza della Telomerasi per la senescenza e di Satelliti del DNA centromerico per la carcinogenesi indotta da mutazioni BRCA1-, 1

2 Prime mappe genetiche approntate da Sturtevant. Terminologia di Johanssen e di Bateson. Esperimenti su natura del materiale ereditario di F. Griffith (1928): principio trasformante. Esp. di Avery, McLead & McCarthy (1944), di A. Hershey e M. Chase (1952) e di M. Wigler e R. Axel. 2 lezione: Venerdì 15 FEBBRAIO REGISTRO: 1. Conclusione esperimenti di M. Wigler e R. Axel e loro implicazioni. Herman Muller: induzione mutazioni con X-rays. Concetto mutazione. 2. G. Beadle e E. Tatum. Mappatura pathways metabolici. Clonazione gene alcaptonuria (HGO). Genetica diretta 3. Genetica Inversa. Genes as beads on strings. S. Luria e M. Delbruck (fluctuation test): Introduzione. DETTAGLIATO: Ulteriori libri di testo di B. Lewin, M. Cummings, Stracham & Reed, siti internet a partire da Bioetica e Elisabeth Brackburn (articolo NEJM). Attualità Biologia Molecolare. Sua rilevanza per le ricerche biomediche. BM permea ormai tutti i campi della medicina. Il DNA è materiale ereditario di batteri, virus ed eucarioti: Esperimenti di F. Griffith (1928): principio trasformante. Esp. di Avery, McLead & McCarthy (1944), di A. Hershey e M. Chase (1952) e di M. Wigler e R. Axel (1978). Importanza metilazione per la deaminazione di C e sue conseguenze. Presenza di isole CpG e loro importanza per la regolazione dei geni housekeeping. Transizioni e Transversioni. Dettagli esperimento M. Wigler. Calcolo della frequenza dei siti di taglio enzimi di restizione. Isolamento frammenti di DNA HSV-TK e loro trasfezione. Importanza dell esperimento di Wigler per: 1) maggior semplicità modello virale, 2) particolare selezione gene TK con cocktail HAT; 3) metodi di trasfezione permetteranno di selezionare/isolare singoli geni. Isolamento frammenti di DNA HSV-TK e loro trasfezione in cellule di topo L-TK-; 4) Dimostrazione mediante elettroforesi su gel di poli-acrilamide della presenza di due attività enzimatiche distinte di TK in cellule L trasfettate. Calcolo dimensioni genomi, numero geni, dimensioni medie di un gene, dimensioni medie di una proteina codificata dal gene. 2

3 Esordi alla Scuola di Thomas Hunt Morgan. Moscerino occhi bianchi: incroci x wt e Back-Crossing. Prime mappe genetiche approntate da Sturtevant. Terminologia di Johanssen e di Bateson. Esperimenti di Herman Mueller (esercitazione/animazione da DNAftb) determinano presenza geni m oltre che l nel topo, i quali causano letalità nei maschi ma non nelle femmine. I geni m ed l sono ovviamente recessivi ed appaiono nei maschi in quanto eredità legata al sesso. A. Garrod (1908) e gli inizi della genetica metabolica (inborn errors of metabolism). L alcaptonuria: gene isolato e studiato dopo 50 anni. Genetica di Apergillus e altre muffe. Irraggiamento con X-rays dei conidi ed utilizzo di ascospore aploidi. L alcaptonuria: gene autosomico recessivo: mappaggio su 3q2: sua clonazione circa 60 anni dopo il lavoro di Garrod e grazie all iniziale clonazione da Aspergillus. Esperimenti di Genetica Diretta e di Genetica Inversa (Charles Weissmann). Esercitazione di mappatura di pathway metabolici studiati con la metodologia di Beadle e Tatum. Pathway Ornitina-> Citrullina-> Arginina. Esempio di complementazione. 3 lezione: Venerdì 27 FEBBRAIO REGISTRO: 1. Luria-Delbruck: test di fluttuazione. Calcolo della frequenza di mutazioni mediante equazione di Poisson. Hanahan & Weinberg: Hallmarks of Cancer. 2. Paradosso cancro: ci soffermiamo su: Loeb, Bodmer, Vogelstein, Duesberg. Cairns: mutazioni adattative. 3. Saymour Benzer e la struttura fine del gene. Regolazione espressione genica: introduzione DETTAGLIATO: Albori della biologia molecolare: suo rapporto con la fisica/fisici teorici. Affinità fra concetti struttura materia (nucleo) e strutture biologiche (gene): Thompson, Rutherford, Niels Bohr. Esperimento di Luria-Delbruck: premesse concettuali, selezione darwiniana vs. adattamento lamarckiano. La figura di S. Luria: fuga dall Italia e dall Europa per regimi fascista/nazista. A slot machine, a broken test-tube. Test di fluttuazione di Luria- Delbruck: premesse storiche-logiche, esecuzione, interpretazione e calcolo con equaz. Poisson. Esperimento Luria-Delbruck: 3

4 effetti non-casuali. Calcolo frequenze mutazione con equazione di Poisson Px= h x. e h / X!. Dimensione dei genomi e dei geni: calcoli generali per E. Coli e per H. Sapiens: % dei genomi corrispondenti a frazioni codificanti. Dibattito Lamarkiano: studi di August Weissman (amputazione coda topi). Studi di J. Cairns su mutazioni adattative. Interpretazione e meccanismo. Mutator phenotype e potenziali implicazioni per la carcinogenesi. Ripetizione/Esercitazione. Calcolo frequenze mutazione con equazione di Poisson Px= h x. e -h / X! Studi di J. Cairns su mutazioni adattative. Interpretazione e meccanismo. Mutator phenotype e potenziali implicazioni per la carcinogenesi. Larry Loeb: teoria per spiegare l alta frequenza di mutazioni delle cellule neoplastiche. 1. alta frequenza di mutazioni adattative con effetti secondari (high rate, small effects); 2. le importanti implicazioni di mutazioni adattative per l evoluzione e 3. le mutazioni adattative come meccanismo evolutivo simile alla senescenza o all apoptosi- con coinvolgimento di polimerasi κ e ζ. e 3. le mutazioni adattative come meccanismo evolutivo simile alla senescenza o all apoptosi- con coinvolgimento di polimerasi che permettono sintesi dopo una lesione (Trans-Lesion Synthesis, TLS). Implicazioni per il Modello di Hanahan e Weinberg, il quale prevede almeno 6 diverse mutazioni in geni che coinvolgano: 1. Regolazione attiva del ciclo (esemplificazione : oncogene); 2. Inibizione del ciclo (esemplificazione: oncosoppressore); 3. Regolatore senescenza/immortalizzazione (esemplificazione: gene che controlla telomeri, telomerasi); 4. Regolazione dell apoptosi (indotta by default col fallire di 1-3); 5. Regolazione dell angiogenesi; 6. Geni coinvolti processo Metastatizzazione. Ripetizione concetti su mutazioni casuali/adattative e loro implicazioni per carcinogenesi. Luria-Dehlbruck - John Cairns Hanahan-Weinberg Larry Loeb. Drammaticità del problema cancro per la specie umana: 1 maschio su 2 ne è colpito ed una femmina su tre. Mentre malattie cardiovascolari diminuite del 50-60%, per il cancro incidenza/mortalità sostanzialmente invariate con piccole differenze da 1970 (John Bailar III). Vari modelli per carcinogenesi basati su pool di staminali che si riproducono frequentemente (1/ 3 days), giorni / vita media = circa divisioni/vita individuo. Modello Luria- Delbruck 104 divisioni = 1 cellula su 100 ha mutazione in un gene qualunque (frequenza mutazioni = 10-6 /gene). Per abbattere, questo alto valore di mutazioni in staminali, Teoria di Cairns prevede almeno due livelli di cellule pluripotenti: N ed S. N son definite come Nsc (=Non-differentiating Stem Cells) ed S come Spd (=Staminal Pluripotent Differentiating). Il valore di N-finale è determinato dal numero di divisioni S, quindi N-finale = N/S. Ed il valore totale di divisioni viene dato da N/S x S. Questo perché le cellule Ncs (=N/S) effettuano 4

5 divisioni asimmetriche che danno come prodotto una nuova cellula Nsc identica alla precedente ed una cellula Spd che andrà invece incontro a differenziamento e morte programmata. Con questo modello, il numero totale di divisioni viene abbattuto da circa a 100 nell uomo e da circa a 60 nel topo. Saymour Benzer: struttura molecolare del gene ultra-fine. Test di ricombinazione dei geni r/h in T2. La regione rii del fago T4: sua analisi ultramicroscopica per ricombinazione e per complementazione. Chiarimenti su modello gene di Saymour Benzer: inversione simmetrica dei marcatori e sua spiegazione e piastramento dopo complementazione. Concetti di test cis/trans e di Hot-Spots. Articolo Scientific American di Saymour Benzer. Gli esordi della genetica batterica: la coniugazione (Joshua ed Ester Lederberg). 4 lezione: Venerdì 29 FEBBRAIO REGISTRO: 1. Carisma di F. Jacob e J. Monod. Premesse al modello LAC. Felix D Herelle; Eli Wolman e l indution erotique. 2. L esperimento PA.JA.MO e la sua interpretazione. Leo Szilard, operon Trp e la regolazione negativa. 3. Mutanti Operon LAC. Funzionalità dei Merozigoti per Oc; I-; Is; I-d. DETTAGLIATO: Gli esordi della genetica batterica: la coniugazione (Joshua ed Ester Lederberg): premessa per la mappatura genica nei batteri (Ely Wolman e Francois Jacob, i.e. coitus interruptus). Modello operone LAC di A. Lwoff, J. Monod e F. Jacob (1960). Concetto di DIAUXIA. Concetto di induzione (batteri, fagi) e di coniugazione (E. Wolman). Allosteria e modello LAC. Introduzione al modello LAC (Istitut Pasteur): ipotesi/modelli iniziali del precursore pz e del plasmagene. E loro confutazione dagli esperimenti di Chr. Anfinsen e del Biostat (AM Torriani insieme a J. Monod). Allosteria e modello LAC. Influenza Leo Szilard, e modello triptofano. Carisma J. Monod e F. Jacob: L hazard et la necessitè - La logique du vivant The Statue Within. Impegno civile-culturale: resistenza ai Nazi-Fascisti (FJ e JM) nel Fronte di Liberazione (De Gaulle) e nel Partito Comunista; critica allo Stalinismo e al Lysenkismo. Esperimento PA.JA.MO e sua interpretazione. 5

6 Influenza Leo Szilard, suo contributo alla fisica e discussione etica, Bertrand Russel, Russel-Einstein Manifesto, Meeting del Pugwash. Suo contributo a modello triptofano. Carisma insieme a J. Monod e F. Jacob: Sistemi policistronici. André Lwoff e l indution erotique, anche in questo caso una forte asimmetria nel risultato. Esperimento PA.JA.MO e sua interpretazione: Hfr (I-; z-) x F- (I+; z+) ipotesi iniziale di un regolatore interno (attivatore positivo) viene falsificata dall esperimento speculare: Hfr (I+; z+) x F- (I-; z-) in cui I- appare recessivo. Sistemi policistronici. Esperimenti chiave modello LAC: mutanti Oc; I-; Is; I-d. Struttura tridimensionale del repressore e sua associazione con mutazioni. Test cis-trans delle mutazioni LAC mediante merozigosi. Riepilogo modello e mutazioni LAC. Modello di attenuazione nell operone triptofano (Yanofsky). Modelli di allosteria (conformazione tesa, aggiustamento indotto) e di alterazione covalente. Importanza modello Operon LAC per ipotizzare RNA messaggero. Esperimenti che hanno dimostrato esistenza mrna. Riepilogo modello e mutazioni LAC. Modello di attenuazione nell operone triptofano (Yanofsky). Isolamento e studi su repressori (l e Lac) da parte dei gruppi di Marc Ptashne e di Walter Gilbert. Modello tridimensionale del repressore Lac: sua associazione a mutazioni specifiche: I-, I-S; I-D. Modelli di allosteria (conformazione tesa, aggiustamento indotto) e di alterazione covalente. Anse sul DNA permettono interazione fra repressori a distanza. Regolazione positiva di LAC: proteina CAP-CRP, messaggeri 2ari, regolazione da glucosio, camp e adenilato ciclasi, variazioni conformazionali della doppia elica. Regolazione positiva spiega osservazioni iniziali di Monod su la diauxia. Regolazione complessa e coordinata fra elementi + e -. Peculiarità operon Lac (mancanza sito UP). 5 lezione: Venerdì 03 MARZO Pochi presenti (week-end sugli sci). REGISTRO: 1. Discussione su modelli biologici: Popper/ Kuhn/ Dogma Centrale BM. 2. Test su Operon LAC. Ulteriori modelli nei procarioti: NTRs; ARA-BAD, Merc-T/R. Scoperta RNA messaggero. 3. Esperimenti di S. Brenner & F. Jacob, di F. Grow & J. Watson e di R. Hall & S. Spiegelman. Devianze della Genetica Medica

7 DETTAGLIATO: Basi epistemologiche seguendo i principi di falsificabilità di Karl Popper non dimostrano grandi novità concettuali. Un interpretazione più consona proviene dal lavoro di Thomas Kuhn su le rivoluzioni scientifiche, quando cioè si accumulano contraddizioni nella teoria che va per la maggiore. Esempi potrebbero essere la meccanica Galileana che sostituirà - nella fisica- la visione Aristotelica, ovvero la Teoria Relativistaica di Einstein che andrà a modificare la meccanica Newtoniana. Secondo la visione di Gunther Stent questa fase corrisponderebbe probabilmente a quella accademica della Biologi Molecolare. Risposta SOS: attivazione RecA, Inattivazione LexA, ESERCITAZIONE IN CLASSE su regolazione gene ALT-1 da glucosio e zucchero raro da dvd testo Watson JE: Molecular Biology of the Gene. Elementi generali su trascrizione: RNA polimerasi, Sequenza -10, -35, UP, e -10 extended. Tecniche del foot-printing e del gel-shift. Subunità sigma. Importanza delle sub-regioni (4.2, 3.0, 2.4, 2.3 etc.), dei 5 canali di accesso all enzima e del alfa-ctd. Ruolo della sigma 1.1 e 3.1 omologie con DNA. Complesso promotore chiuso ed aperto, promoter-escape. Concetti più generali di attivatori e repressori, regolazione per regulated recruitment e da repressore. Importanza del modello Operon LAC ed in particolare dell esperimebto PA.JA.MO per ipotizzare RNA messaggero. Falsificazione modello (1 gene-à1 ribosome --à 1 protein. Esperimenti che hanno dimostrato esistenza mrna: di Brenner-Jacob (isotopi pesanti e radiattivi) marcando sia con C14 (pesante) che con S35 (radioattivo) e di F. Gros-J. Watson (batteriofago). Esperimento di S. Spiegelman e R. Hall dimostra presenza mrnas per ibridazione dopo aver marcato con P32 e con timidina tritiata. Regolatori essenziali: Attivatori, Repressori, Elementi che bloccano complesso repressore chiuso, Siti legame sul DNA, tecniche di Southern Blotting, Northern Blotting e di Foot-Printing. Esperimenti swapping CTD, struttura del promotore nonideale. Espressione genica: repressa, livello basale, elevata.. Importanza sub unità Sigma (70, 28,34). Modificazioni polimerasi (glna, NTR-C). Variazione conformazionale DNA promotore (gene Mer-T e regione Mer-R). EUGENETICA: Aspetti Generali. Dibattito su mutazioni casuali vs. mutazioni adattative: le tristi conseguenze dell ideologia eugenetica: Charles Davenport, Harry Laughlin e l Eugenics Record Office a Cold Spring Harbor, NY. L interessante caso del 1 Ammiraglio della Flotta USA, David Farragut ( damn the torpedoes: full speed ahead! ) considerato da Davenport nel suo classico testo: Naval Officers: their Heredity and their Development. Discussione su ereditarietà, nature e nurture. 7

8 6 lezione: Venerdì 15 Marzo (qualche assente). REGISTRO: 1. Ripasso regolazione procarioti. Geni ARA-BAD + C. Isolamento repressori LAC (Walter Gilbert & Benno Muller-Hill) e LAMBDA (Mark Ptashne) 2. Legame DNA e attivazione Gal-1/Gal-4. Attivazione Lex-A. Two Hybrid System. Introduzione a Organizzatore di H. Speman. 3. Meccanismi di Embriogenesi Molecolare: Spaetzle Toll Cactus Dorsal. TWIST/ RHOMBOID/ SOG. Hazard et Necessité di J. Monod. DETTAGLIATO: Modello operon arabinosio. Ara-BAD e regolazione da AraC, ma anche da CAP/CRP. Southern Blotting, Northern Blotting, Western Blotting, Footprinting Technology. Esperimenti di Mark Ptashne per isolare il repressore di lambda. Regione di immunità del batteriofago 434 ovvero di Lambda. Mutanti virulent simili ad Oc, concetto di l-immunity. Esperimenti di isolamento del repressore Lac con IPTG marcato del gruppo Gilbert/Mueller-Hill. Ripetizione esperimento PA.JA.MO e sua interpretazione. Influenza Leo Szilard, suo contributo alla fisica e discussione etica, Bertrand Russel, Russel-Einstein Manifesto, Meeting del Pugwash. Suo contributo a modello triptofano. Carisma J. Monod e F. Jacob: Sistemi policistronici. Attivazione negli Eucarioti: Mark Ptashne decide di studiare questi meccanismi in lievito. Gene Gal1 viene regolato da attivatore Gal4 che ha due funzioni: 1. legame a sito DNA a monte (UAS: (AA 1-147)); 2. attivazione trascrizione del gene Gal1 stesso (AA ). Esperimenti di swapping con repressore Lex-A (procariotico, con suo specifico sito riconoscimento su DNA) e di chimerismo artificiale (LexA-Gal4). Meccanismo di REGULATED RECRUITMENT. Meccanismo generale che ritroviamo anche nel STP (signal transduction pathway) esemplificato da Joseph Merrick = Elephant Man: alterazione di STP nel gene GAP (ras pathway, NF-1). Two Hybrid System: Modello dimostrato inizialmente da Ptashne, che richiede almeno due elementi per attivare la trascrizione (UAS binding e attivazione stessa). Vengono nuovamente riassunti qui di seguito. Attività HAT (acetilasi) e attività HDAC (deacetilasi). Esperimenti di Mark Ptashne per studiare la regolazione negli eucarioti (lievito). Scoperta di L. Guariente del sito UAS, regolatore CYC1. Funzione Lex-A nei procarioti: ripasso azione di RecA nell induzione della lisogenia. Adattamento Lex-A eucarioti e sua inibizione in modello Gal1-Gal4. Costruzione molecola ibrida Lex-A/Gal-4 e sua funzionalità in un saggio su 8

9 Gal-1. Essenzialità sito Lex-A sul DNA. Modello di localizzazione o di reclutamento regolato (regulated recruitment). Associazione con meccanismi di Trasduzione del Segnale (Signal Transduction Pathway, STP). Determinazioni associazioni fra proteine mediante two hybrid system: fish, bait e selezione con auxotrofi. Modello sperimentale: sistema 2 ibridi (2 hybrids system). Schema generale Aux-Trp; Aux-Leu; Aux-His e selezione per plasmidi contenenti Bait, Fish (generalmente genoteca cdna), ultima selezione per prototrofia His. + Dettagliato: Su questi stessi principi si basa il sistema 2 Ibridi: le due funzioni di 1. legame all UAS e di 2. attivatore trascrizione vengono separate nei due diversi domini. Se e solo se i due domini si RIASSOCIANO (i.e. si legano l una all altra), allora avremo attivazione finale. Elemento FISH (pesce, preda) e BAIT (esca). Esempio con RAS, del quale cerchiamo i gigandi successivi (nel STP), diviene il BAIT. Non sapendo quale fish abboccherà, produciamo una genoteca di espressione (FISH) che produca TUTTI gli mrna presenti nella cellula (cdna library). Utilizzando un triplice auxotrofo: trp/leu/his, il BAIT viene introdotto con vettore trp+, la genoteca cdna cone vettore leu+ ed infine si testa l avvenuta associazione per prototrofismo per il gene his (his+). Biologia Molecolare Embriogenesi-- Introduzione Dibattito su preformismo (Homunculus) ed epigenesi (entelechia di Aristotele; esprit vital successivo) caratterizza molti studi embriologici fino al secolo scorso. Roux riuscì ad inattivare con un ago arroventato una delle due cellule dello zigote di rana, ottenendo uno sviluppo parziale (preformismo). Tuttavia esperimenti simili effettuati sul riccio di mare (in fase di blastula) da Driesch e da Morgan ancora su rana ottennero risultati opposti: ciascuna delle cellule separate di un embrione primordiale può ricostruire l intero embrione (epigenesi). Simili risultati con idre/polipi. Esperimenti di Hans Speman. L esperimento di Hans Speman è stato fondamentale per la nostra comprensione dell embriogenesi e per la caratterizzazione dell organizzatore embrionale. Verrà premiato con il Nobel. Preliminari: Speman dimstrò che una costrizione dell embrione di Drosophila (ottenuta con un capello della sua neaonata Gretchen) bloccava la formazione di strutture centrali quali ali e altere. Consiste nel trapianto del blastoporo dorsale (blastula/gastrula) in una posizione ectopica su di un altro embrione (eseguito su specie di Salamandre, distinguibili per maculazioni/diverso colore della pelle). H. Speman e H. Mangold riuscirono ad indurre dal sito del trapianto la generazione di un gemello siamese. L appropriato utilizzo di specie variate e distinguibili permise di capire che era dovuto alla presenza di un ORGANIZER (sostanza diffusibile, morfogeno) e non di crescita ed embriogenesi delle cellule trapiantate. La natura molecolare dell ORGANIZER verrà considerata nella prossima sezione. Meccanismi molecolari dello sviluppo. Principi fondamentali evoluzione darwiniana (600 mil. anni) e separazione protostomideuterostomi. Assi antero-posteriore e dorso-ventrale. 13a divisione: circa 6000 cellule corticali che formano il 9

10 vitellogeno. Porzione posterioreà granuli polari, cell. Polari estroflesse. 3 principi essenziali x studiare sviluppo; 1. gradienti: si evincono sin da esperimento pioneristico di Speman e sono bene evidenziabili con tecniche di Northern e IHC (esempio: fattore bicoid); 2. trasporto: vi sono vari esempi di morfogeni/fattori di crescita che vengono trasportati spesso a livello del messenger RNA (mrna). Esempio principale: endonucleasi HO viene espressa nel sistema di sessualità lievito caratteri a ed a- solamente nella cellula genitrice grazie ad un rinibitore ash il cui mrna viene trasportato nella cellula figlia. Simili sistemi per OSKAR, trasportato al polo posteriore grazie a sequenze riconoscimento nell mrna di Oskar situate nella regione 3 -UTR. Se scambiamo (swapping) questa regione 3 -UTR di Oskar con la corrispondente regione del gene Bicoid (materno, posizionato anteriormente), si creeranno embrioni con due estremità posteriori (polar cells anteriori). 3. rescue : tipici esperimenti di rescue sono quelli nei quali una determinata mutazione viene complementata dall aggiunta di sostanze/estratti ottenuti da embrione WT. Gradiente dorso-ventrale. Presente sia in insetti che in vertebrati, ma nei primi appare essere invertito, probabilmente in una biforcazione primordiale dell evoluzione. Effettori; Gurken, Torpedo, RAS (funzione principale: inibire Spaetzle). Attivazione STP di Toll-receptor (also immunity), similarità con rel, NFkB e IkB (dorsal/cactus) e con NIK/IRAK (pelle/tube). Su lato dorsale, è attivo invece il gradiente di BMPs (bone morphogenic protein) che a loro volta attivano i segnalatori Smad s. Dorsal però non viene eliminato: sempre presente nell embrione, viene traslocato nel nucleo solo dopo attivazione da Spaetzle (esperimenti IHC). Trasmissione segnale regione ventrale (mesenchima)-à neoroectoderma laterale : TWIST - ROMBOID SOG. Dipendenza da segnale molecolare (enhancers). Twist ha un numero limitato di siti binding per Dorsal: verrà quindi attivato solo in posizione ventrale, dove Spaetzle ha più alta concentrazione. Ulteriore regolazione da SNAILS, inibitore a sua volta attivato da TWIST e DORSAL solo ventralmente. 7 lezione: Venerdì 22 MARZO REGISTRO: 1. Hazard et Necesité di J. Monod. Meccanismi di allosteria e Feed-Back. Cenni di Evoluzionistica: The Spandrels of St. Mark by Stephen J. Gould e R. Lewontin. 2. Origine della Vita. Esperimento di Miller-Urey. Modelli di biogenesi sulla terra secondo Martin e Russel 3. Riboswitches. Ribozimi: Thomas Chek e Sidney Altman. Sol Spiegelman e the little monster. Dettagli finali embrionegensi: Even-Skipped 2. 10

11 DETTAGLIATO: Embriogenesi molecolare: Gradiente terminale posteriore. Torso dimostra un peculiare sistema STP: -P in Y-918 implica legame di GAP e previene attivazione RAS (Von Reclinghausen o NF-1). In caso di attivazione recettoriale, -P anche in Y-630, la proteina legata, CORKSCREW, è una fosfatasi che quindi defosforila Y918, allontana GAP e permette attivazione RAS. Geni di Segmentazione (Asse Antero-Posteriore). Studiati soprattutto da C. Nusslein-Vohlard ed E. Wieschous includono sia GENI MATERNI (presenti già nell uovo ma variamente attivati/regolati): due esempi che abbiamo già in parte visto sono Bicoid ed Oskar. Oskar posizionato per trasporto mrna (esemplificato da feromoni/sessualità lievito: gene HO viene esptresso solo nella mother cell perché l inibitore ash1 viene trasportato ed espresso specificamente ella cellula figlia). Spesso i geni materni regolano la famiglia successiva di geni: GENI GAP. Così, nel caso di Bicoid (materno), due geni vengono regolati dal suo gradiente: Orthodenticle e Hunchback (Hunchback è in realtà a metà strada fra materno e GAP precoce, vedi oltre). GENI GAP Orthodenticle viene espresso solo in posizione più anteriore rispetto ad hunchback, in quanto possiede un minor numero di siti di legame/enhancers per l attivatore Bicoid. Il gradiente di Bicoid e l affinità dei siti di legame determinano quindi il pattern per questi geni GAP. Come accennato, Hunchback ha anche una componente materna in quanto una copia di questo gene viene regolata come materna. Viene tuttavia antagonizzata nella sua espressione finale (sintesi proteica) dal regolatore NANOS, che si lega al 3 -UTR e che a sua volta viene espresso caudalmente. Il gradiente di Nanos può essere dimostrato con IHC ed ibridazione in situ. Altri tre geni GAP vengono similmente regolati da Hunchback (tipo GAP precoce): Kruppel, Knirps e Giant vengono espressi in quest ordine su asse A-P, in quanto Hunchback è in questo caso regolatore negativo (repressore): Giant sarà espresso in posizione + caudale, laddove Hunchback è in minor concentrazione in questo gradiente, in quanto il suo enhancer contine un numero di siti di legame assai più elevato rispetto a Kruppel (7 vs 3), etc. GENI del PAIR-RULE Geni del Pair-Rule sono tipicamente regolati dai geni del GAP, espressi più precocemente nell ontogenesi. Qui l espressione è ancor più sofisticata, in quanto specifici geni verranno regolati in specici segmenti genici. Se analizziamo il gene Pair-Rule chiamato Even Skipped (Eve), ci accorgiamo che la sua espressione in segmenti specifici è determinata dalle sequenze regolative che si trovano a monte o valle del gene. Legando queste sequenze a b-gal (Lac-Z), l enzima verrà espresso in maniera specifica nelle varie bande. A fronte di un gene di appena kb, le sequenze regolative occupano circa 12 kb. Ad esempio, nel 2 segmento EvenSkipped viene specificamente espresso, quando sono assenti gli inibitori Kruppel e Giant (Geni GAP; che determinano quindi l inizio e la fine della striscia di espressione) e quando sono al contempo presenti gli attivatori Bicoid e Hunchback (attivatore in questo caso). La natura di questi regolatori viene confermata in animali transgenici KO per questi fattori: mentre i KO di Kruppel e Giant espandono molto la striscia EvenSkipped-2, il KO di Hunchback ne è privo. 11

12 Talvolta, repressori da soli possono determinare il posizionamento delle singole bande/segmenti: sempre per EvenSkipped, le bande 3 e 4 sarebbero determinate dai gradienti di Hunchback e Knirps che sono opposti (i.e., A-P e P-A): gli enhancers in stripe 3 hanno pochi siti per Hunchback e di + per Knirps (3 e 5), mentre la situazione in stripe 4 è speculare (6 e 3). Sia Hunchback che Knirps agiscono qui come inibitori dei segmenti 3 e 4. GENI del SEGMENT-POLARITY. Per questi geni, in particolare per Goosberry e per Paired, conosciamo degli interessanti meccanismi evolutivi. Questi sono i geni che determinano la porzione Anteriore o Posteriore di ciascun segmento. Nel caso di Goosberry e di Paired, la loro sequenza dimsotra la presenza di due importanti domini regolativi: PAX (da paired) e Homeobox. Anche se i due regolatori Goosberry e Paired dimostrano soltanto 25% in omologia di sequenza (a livello di aminoacidi), i due elementi regolativi, PAX e HMBX sono presenti in ambedue in posizioni equivalenti. Mutanti Goosberry dimostrano alterazioni in ciascuno dei 14 segmenti di DM, mentre quelle Paired in segmenti alterni (7 su 14). Per rispondere alla domanda se la sequenza Paired sia derivata per duplicazione di Goosberry (come appare assai probabile) e soprattutto se siano essenziali per lo sviluppo le variazioni (mutazioni) introdotte in Paired, ovvero le sequenze regolative, è stato effettuato il seguente esperimento. Un mutante Goosberry dimostra un pattern scomposto nei 14 segmenti: questo mutante viene reso transgenico con l aggiunta di una fusione fra il gene Paired (25% omologo) e le sequenze regolative di Goosberry. Il moscerino transgenico diviene perfettamente funzionale/wt (RESCUE), dimostrando così che è l espressione di Paired sotto controllo di tipo Goosberry che permette il recupero (o complementazione). 8a lezione: Venerdì 4 APRILE REGISTRO: 1. Principi essenziali della Replicazione. Problema tautomerizzazione. Fedeltà re plicativa (proofreading) 10-9 (MMR). 2. Meccanismi Mutazione: agenti alchilanti, ossidanti (ROS), deaminanti etc. Specificità MMR per elica neo-sisntetizzata (GATC, Dam metilasi). Carrellata: dalla scoperta dei carcinogeni ai mutageni agli oncogeni umani: P. Pott K. Yamagiwa H. Kenneway B. Ames Wigler-Cooper-Barbacid-Weinberg. 3. Meccanismi del riparo del DNA. 1. fotoliasi, 2. demetilasi, 3. ER: BER e NER: GG e TCR. UVR-ABC. DETTAGLIATO: Caratteristiche essenziali replicazione (dntp)n + dntp - (dntp)n+1 + P-P. G da sfavorevole (3.5 Kcal/mole) a favorevole (7kcal/mole) con pirofosfatasi (implicazioni per piro-sequenziamento). Riconoscimento appaiamento basi, discriminazione fra desossi- e ribonucleotidi, paragone con struttura mano destra: palmo, dita e pollice. Primer, curva 90 12

13 C e suo ruolo, funzione di thumb, palm e fingers, ruolo Mg++ e Zn++ su due siti aminoacidici A e B, ruolo Tyr su elica O, Lys e Arg neutralizzano su fingers. Concetto di processività ed esemplificazioni (pol I e pol III). MUTAZIONI: Necessità di sue ciclo per stabilizzarla. Due tipi: transizioni e transversioni. Meccanismo tautomerico già menzionato nel lavoro del 53 (Donahoo). Altri analoghi: BrdU, acyclovir etc. Proofreading etc da 10-5 a 10-7 mut.rate grazie a MMR. MutS, MutH, MutL, seguiti da Exo7 o RecJ + Exo1/Exo6, meccanismo molecolare della riparazione per scelta di elica (metilasi DAM e GATC). Meccanismi mutageni endogeni (formazione ROS, alchilazione, ossidazione, deaminazione etc.) ed esogeni radiazioni UV e iuonizzanti, raggi X etc. (Hoeijmakers). Ripetizione su analoghi basi: strutture chetoniche ed enoliche, BrdU, acyclovir etc. Deaminazione Citosina non da forte rischio, se metilata porta ad una transizione. La maggior parte siti C è eliminata nel genoma ad eccezione di CpG islands, importante per controllo geni (soratutto housekeeping). Le CpG islands sono marcatori della presenza di geni. Formazione anelli ciclobutanici, soprattutto da rad UV: dovuti a stacking (TT o TC o CC). Danno da sostanze intercalanti: Acridine Orange usato indiscriminatamente come defoliante spesso associato a diossina (studi IARC, movie Platoon): carcino- e teratogenesi, forte aumento di still births. Altri intercalanti (EthBr, ProEth). Carrellata su Mutagenesi Oncogeni. Test di Bruce Ames dimostra forte associazione fra carcinogenesi e mutazioni. Panoramica carcinogenesi: Katsosaburo Yamagiva dimostra per la prima volta l induzione di tumori con carcinogeni (catrame). Ernest Kennaway riesce ad isolare da tonnellate di catrame il BenzoPirene, MetilColantrene, DimetilSolfato etc., primi carcinogeni puri. Su queste sostanze si basa test di Ames: utilizza mutanti auxotrofi His- di Salmonella Tiphimurium, studiandone reversione inducibile a His+. Carcinogeni devono essere precedentemente attivati (in genere da geni detossificanti, ad esempio da Citocromi P450). Esemplificazioni con EthylMethanSulfonato, UV e Aflatoxin B. Ciascun ceppo appare specifico per un certo spettro di mutazioni ma non per altre. Gli ultimi studi in questa panoramica, sono quelli eseguiti per chiarire il meccanismo di alcuni tumori umani: Joseph Merrick the elephant man- è un esempio paradigmatico di mutazioni in questo pathway: breve sketch del personaggio affetto da malattia di Von Recklinghouse ovvero Neurofibromatosi 1 (NF1). Il pathway NF1 si associa tramite il Signal Transduction Pathway (STP) a RAS (simile a G-binding proteins) ed è stato evidenziato da una serie di studi eseguiti contemporaneamente da Geoffrey Cooper, Robert Weinberg, Mariano Barbacid e Mike Wigler. Identificazione di oncogeni con tecniche di trasfezione in cellule di topo NIH-3T3 (Robert Weinberg, Mariano Barbacid, Michael Wigler, Jeffrey Cooper): identificazione iniziale e purificazione delle sequenze umane con sonde Alu. Ulteriori passaggi per trasfezione (2aria, 3aria). Clonazione in vettore lambda e caratterizzazione con sonde v-onc.s. Omologia con v-ras, 13

14 identificazione mutazione puntiforme mediante tecniche taglia-cuci ed infine con sequenziamento. Ruolo della mutazione attivante ras: inattivazione GTPase. Simili alterazioni nella malattia di Von Recklinghausen/Neurofibromatosi I (gene Gap). Studio di carcinomi alla vescica, frequente nei fumatori, utilizzando la tecnica della trasfezione su cellule murine NIH-3T3 per riuscire ad isolare il gene (su circa 23000) affetto. Per le cellule trasfettate, vengono utilizzate in esperimenti di Southern blotting sequenze ripetute di tipo Alu (circa 10 6 /nel genoma umano, sequenze cosiddette SINE): nelle prime cellule trasfettate sono presenti molte bande Alu, che però diminuiscono nelle trasfezioni successive (perché?). Ulteriori sonde per oncogeni umani non dimostrano alterazioni ad eccezione del gene RAS. Per capire però cosa era stato alterato in RAS, sia Weinberg che Barbacid eseguirono una serie di esperimenti di taglia&cuci in cui univano insieme diverse porzioni del gene RAS normale e di quello ottenuto dai tumori alla vescica. Con questa tecnica, localizzarono la mutazione in una regione all estremità 5 del gene RAS e successivi esperimenti di sequenziamento dimostrarono la presenza di mutazioni in posizione o Meccanismi di riparo: fotoliasi attivata da quanti di luce visibile. Ulteriori meccanismi: ER, BER, NER (GG-NER e TCR-BER); MMR; HR e NHEJ. Metiltranferasi permette una reversione immediata del danno, ma con meccanismo assai dispendioso per la cellula (enzima viene inattivato). Glicosilasi scindono legame glicosidico creando sito AP (apurinico/pirimidinico). Meccanismo di flipping-out della base male appaiata. Glicosilasi per Uracile, oxog, metilg etc. Meccanismi ER (excission repair): 1. short patch ER: Nuclease APE agisce successivamente e taglia zucchero-fosfato del sito AP seguita da nucleasi/ligasi XRCC1 (X-rays cross-complementing) e ligasi 3 e da polimerasi β. 2. long patch ER: intervengono PARP (poly-adp ribose polymerase) e PNK (Poly Nucleotide Kinase), le cosiddette sliding clamps (pinze scorrevoli) FEN1 =Flap Endonuclese, DNA ligasi XRCC1 e ligasi1. Importanza MGMT nella terapia dei gliomi (presentazione lavoro M. Hegi su NEJM: temozolomide agente alchilante- agisce solo su pazienti con MGMT metilato discussione). Ulteriori meccanismi di fail-safe, glicosidasi che riescono ad eliminare base alterata: MutT elimina oxog, mentre MutY elimina basi appaiate incorrettamente con oxog. MMR: geni equivalenti negli eucarioti: MSH (MutS homologue), MLH (MutL homologue) e PMS. BER e NER, caratteristiche generali che li distinguono si basano sulle dimensioni degli addotti riparati dai due meccanismi. James Cleaver e lo studio di mutazioni nello Xeroderma Pigmentosum (anomalie sistema nervoso e forte aumento tumori)- geni XP, Cockayne Syndrome e geni CS. Sistema UVR-ABC: AB riconoscono e segnalano danno, mentre C esegue incisione su doppia elica. 14

15 9 lezione : VENERDI 12 APRILE REGISTRO: 1. Ripetizione BER, NER, MMR. Sindromi associate: HNPCC, XP, Cockayne. 2. NER: GC e TCR: Ripetizione apparato Basale della Trascrizione: TFIID, B, F, H. TAFs e TBP. Introduzione a fattori trascrizione. Eptameri ripetuti su RNA pol devono essere fosforilati (TFIIH) 3. TFs: HTH, ZN Fingers, Leu Zippers, bhlh. Animazione su Leland Hartwell e gene checkpoints: RAd9 e Ced9. Introduzione alla Ricombinazione: Esperimento di Creighton-McClintock. Esperimenti di Meselson-Weigle dimostrano ricombinazione per breakage-reunion. Modelli di Holliday (2 SSBs e 1DSB). CONCLUSIONE RIPAREO ER. NER si distingue in NER-GG (global genome) e NER-TCC (transcription coupled repair). DETTAGLIATO: Elementi essenziali RNA pol (procarioti). Promotori deficitari/deboli (-35 BP element; extended promoter, etc.). Corrispondenza con sub-regioni 4.2 e 3.0/2.4. di sigma Varie sub-regioni assolvono funzioni differenti. La 4 implicata nel riconoscimento e la 2 nella dissociazione delle basi (à complesso aperto). 5 canali di entrata/uscita: ingresso DNA, uscita elica T, uscita elica NT (stampo/non stampo), uscita dell RNA e canale (ortogonale) per ingresso nucleotidi. s 1.1 importante regolatore dell ingresso del DNA., in quanto mimica il DNA stesso e blocca così l enzima. s 3.2 mimica invece l RNA e fa quindi scivolar via i neotrascritti, causando così trascrizione abortiva. Elementi essenziali della trascrizione negli Eucarioti: 3 RNA polimerasi principali negli euc.: la pol-ii trascrive geni cellulari. BRE o elemento di risposta a TFIIB (TFIIB response element), TATA associato a TBP (TATA box binding protein), Inr (iniziatore) e DPE (downstream promoter element) che legano il TFIID, forse il primo fattore di trascrizione essenziale per inizio (molto grande, 8-9 elementi): è un complesso multi proteico = contiene infatti sia il TBP (TATA box binding protein) che i TAFs (TBP associated factors). Alcuni TAFs hanno una struttura che ricorda gli istoni, ad esempio TAF 42 e 62 di Drosophila sono simili a H3-H4, mentre altri TAF mimetizzano il DNA, ad esempio nel caso in cui legano la porzione di TBP che legherebbe normalmente la doppia elica come per s 1.1 ). TFIID attiva trascrizione creando una drammatica curvatura nel DNA di circa 100, interagendo con il solco minore. Al legame di TFIID segue quello di TFIIA e TFIIB (simile a sigma 3.2), dopo di che la polimeasi (Pol II) può legarsi al sito promotore in associazione a TFIIF. Complesso di pre-inizio della trascrizione. Qui le cose 15

16 si complicano negli eucarioti, nel senso che la polimerasi deve a sua volta associarsi ad una regolazione raffinata per agire: dopo il legame con TFIIE, interviene TFIIH, un complesso multi proteico dotato di attività ATPasica, elicasica ed anche chinasica. ATP viene scisso nel passaggio da complesso promotore chiuso ad aperto (melting dsdna + attività elicasica) mentre l attività chinasica è essenziale per fosforilare residui tirosina sulla lunga coda presente sulla PolII. Sequenza ripetuta TyrSerProTyrSerProSer di 7AA ripetuti 30 volte nel lievito e 52 volte nell uomo deve essere fosforilata in Tyr dalla chinasi presente nel complesso TFIIH perché avvenga il cosiddetto promoter escape. Ultime considerazioni: la funzione di traitd union fra DBD e attivatore (Ptashne) viene svolta negli eucarioti superiori dal Mediatore, un altro complesso multi proteico (almeno 20), spesso associato ad elementi SAGA o SWI5, cioè rimodella tori della cromatina. Il Mediatore corrisponde quindi al modello dimostrato inizialmente da Ptashne, che richiede almeno due elementi per attivare la trascrizione (UAS binding e attivazione stessa). Vengono nuovamente riassunti qui di seguito. Attività HAT (acetilasi) e attività HDAC (deacetilasi). Esperimenti di Mark Ptashne per studiare la regolazione negli eucarioti (lievito). Scoperta di L. Guariente del sito UAS, regolatore CYC1. Funzione Lex-A nei procarioti: ripasso azione di RecA nell induzione della lisogenia. Adattamento Lex-A eucarioti e sua inibizione in modello Gal1-Gal4. Costruzione molecola ibrida Lex-A/Gal-4 e sua funzionalità in un saggio su Gal-1. Essenzialità sito Lex-A sul DNA. Modello di localizzazione o di reclutamento regolato (regulated recruitment). Associazione con meccanismi di Trasduzione del Segnale (Signal Transduction Pathway, STP). Determinazioni associazioni fra proteine mediante two hybrid system: fish, bait e selezione con auxotrofi. Modello sperimentale: sistema 2 ibridi (2 hybrids system). Schema generale Aux-Trp; Aux-Leu; Aux-His e selezione per plasmidi contenenti Bait, Fish (generalmente genoteca cdna), ultima selezione per prototrofia His. Introduzione alla ricombinazione: esperimento seminale di McClintock-Creighton: utilizzazione oltre ai marcatori genetici (wx e c), di 2 marcatori citologici (knob ed interchange). Figura carismatica della B. McClintock: sue peregrinazioni fino agli studi a CSHL. Esperimenti di M. Rhoads (A1a1/Dtdt = selfing o autoimpollinazione) e B. McClintock (CDs/CDs; Ac/Ac+ x cds+/cds+; Ac+/Ac+) : sua spiegazione molecolare. Introduzione agli elementi trasponibili: paradosso della pannocchia colorless maculata. Elementi del mais sono trasposoni: autonomi (Ac, Spm, Dt) e non-autonomi (Ds, dspm, Unnamed). Generazione di Ds a partire da Ac. (riquadri di Punnett, esercitazione in aula): introduzione agli elementi trasponibili, Retrotrasposoni e Retrovirus. 16

17 10 lezione : VENERDI 26 APRILE REGISTRO: 1. La ricombinazione e la sua importanza per i meccanismi di riparo del DNA. Sintesi Translesione (TLS) Polimerasi IV e V, κ e ξ. Varianti del Modello di Holliday: Meselson-Redding e Szostack-Orr-Weaver. 2. Stallo della forcella, sua regressione e collasso. Apparato enzimatico Spo11 / Rec ABCD, Ruv ABC. Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer (HNPCC): Kolodner Vogelstein, Lynch. Meiosi. 3. Sequenze X. Meccanismi molecolari di Rec A, rec FOR, HR/NHEJ. Grandi complessi proteici: MRN e MRX; BRCA1/BRCA2; Synthetic Lethality. Introduzione ai trasposoni: esperimenti di Marcus Rhoades a Barbara McClintock. DETTAGLIATO: RIPARO PER RICOMBINAZIONE: Si instaura quando vi sia un impossibilità ad effettuare riparo ER, per una lesione grave al DNA, tipicamente un taglio dsdna (interruzione della doppia elica). Riparo per ricombinazione omologa (HR): possibile quando vi sia uno stampo intatto. Esemplificato da SCE (sister chromatid Exchange). Fattori che intervengono (definizioni e funzione): SPO-11, MRX, MRN, DMC1, RAD51 (omologo di REC-A), RAD-52, RAD-50. Alterato nella Sindrome di BLOOM, in quella di Nijmegen ed inell atazia telangectasia (AT). Anche nel caso di mutazioni BRCA-1 e BRCA-2 viene chiaramente alterato un meccanismo di ricombinazione HR. Riparo per ricombinazione non-omologa (Non-Homologous End Joyning - NHEJ): Attivazione di KU-70 e KU-80 che mantengono uniti i frammenti di DNA non-omologhi. Attivazione con ssdna di DNA-PK, che fosforila e attiva Artemide (Venere), un endo/esonucleasi formazione frammenti 3 -OH attivazione rec. NH. γ-h2ax, importante segnale di danno cromosomico trasmesso da ATM (mutated in AT) e ATR (ATM related), due sensori del danno genotossico. Segue fosforilazione della sequenza SQEL/Y (serina-glutammina-ac. Glut- leucina/ tirosina), marcatore del danno per 50 kb fino MegaBasi. Intervengono anche rimodellatori, tipo SWI/SNF. 17

18 11 lezione : Venerdì 03 MAGGIO REGISTRO: 1. Ripetizione esperimenti di Marcus Rhoades a Barbara McClintock (analisi mediante Punnet s square). Scoperta sequenze IS nei batteri da parte di J. Shapiro. Ricombinazione Sito Specifica (SS): Cre e LozP. Meccanismi copia & incolla e taglia e cuci (TN5 e TN10) 2. Meccanismi molecolari (esperimento Xgal e LINE/SINE). Retrotrasponi. Replicazione Retrovirus (Temin e Baltimore). Sequenze LINE e SINE. Piselli di Mendel (IS gene SBEI). 3. Introduzione geni Immunoglobuline: Ehrlich, Landsteiner, Pauling, M. Burnet, N. Yerne. Esperimento S. Tonegawa. Mecannismo molec.: esameri/nonameri/spaziatori. Calcolo specificità ottenibili. Esperimento Schatz/Baltimore RAG1/2. DETTAGLIATO: Ripetizione esperimenti B. McClintock: Crossing-Over; BFB cycle Ac/Ds elementi trasponi bili (utilizzo riquadro Punnet). Scoperta trasposoni nei batteri: esperimento di Shapiro su mutanti gal-. Esperimenti mediante gradienti di densità/ microscopia elettronica. Insertion sequenze IS- spiegano integrazioni saltatorie. Struttura molecolare e meccanismi di integrazione. Sequenze ripetute invertite e dirette (meccanismo originante). Trasposoni semplici e composti. Plasmidi e geni resistenza. Trasposizione replicativa e non (esempi). Formazione dei co-integrati. Eventi molecolari distinguono i due tipi di trasposizione. Trasposoni a DNA e retroposoni. Esperimenti che dimostrano retro-trasposizione (Lac Z+/-). Replicazione trasposoni a livello forcella replicazione può mimare trasposizione replicativa. Sequenze aggiunte sul sito bersaglio. Dimostrazione di Retrotrasposizione. Trasposoni eucarioti: LTR+ ed LTR-; autonomi e non-; elementi LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) e SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE (introne autocatalitico). Mutazione piselli rugosi di G. Mendel (gene SBEI). Meccanismi taglia&cuci (TN-10) ed esperimento che lo dimostra (heteroduplex) e copia&incolla (TN-3). Dimostrazione di Retrotrasposizione. Trasposoni eucarioti: LTR+ ed LTR-; autonomi e non-; elementi LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) e SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE (introne autocatalitico). Mutazione piselli rugosi di G. Mendel. Meccanismi taglia&cuci (TN-10) ed esperimento che lo dimostra (heteroduplex) e copia&incolla (TN-3). 18

19 Importanza seq.s SINE e LINE. Seq.s SINE possono trasporsi solo in presenza di LINE: dimostrazione sperimentale = necessità presenza di una RT attiva. Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE (introne autocatalitico). Introduzione a retrovirus come retrotrasposoni. Introduzione e struttura dei retrovirus (R-5 / 3 -R) come retrotrasposoni. Esperimenti di David Baltimore e Howard Temin (isolamento della RT), di Peter Vogt, Peter Duesberg, Hidosaburo Hanafusa (struttura genoma virale): meccanismo di replicazione saltatoria (2 jumps). Trascrittasi ed integrasi. Provirus ed LTR (3 -R- 5 ). Strutture di integrazione. Alta percentuale sequenze retrotransposons nei genomi dei (in)-vertebrati. INTRODUZIONE MECCANISMI IMMUNOLOGIA MOLECOLARE. Il problema della risposta anticorpale: studi di C. Landsteiner (apteni + carriers) dimostrano un elevatissimo numero di specificità Ag (circa 109). Teoria delle Catene Laterali (Side Chains): Paul Ehrlich, Esperimenti di Carl Landsteiner dimostrano un numero quasi illimitato di specificità antigeniche (apten + carrier). Teorie istruttive (Felix Haurowitz, Carl Landsteiner, Linus Pauling) e di selezione clonale (Nossal, Frank Macfarlane-Burnet, Medewar, Niels Jerne). Teorie Istruttive falsificate dall esperimento di Anfinsen. Approfondimento su Teoria Selezione Clonale (CST) di Macfarlane Burnet: 1. specificità è interamente dovuta all ospite; 2. ciascuna cellula ha una specificità unica o limitata (1 cell/1 antibody); 3. E l antigene che stimola la cellula (R esterno); 4. alcune delle cellule differenzieranno in plasma-cellule. Struttura simile a trasposoni per i geni delle immunoglobuline. L esperimento di Sosumu Tonegawa come esemplificazione di Southern blotting primitivo: suo significato. Struttura generale IG e TCR e loro induzione durante lo sviluppo/differenziamento: cellule, B, T, APC, dendritiche. Struttura tridimensionali IG: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD etc. Catene H ed L, porzioni V e C, CDR I-III e loro importanza. Calcolo possibilità combinatorie L e H e totali IgG. Ricombinazione geni Ig per delezione ovvero inversione dei segmenti coinvolti. Importanza sequenze di riconoscimento per riarrangiamenti: eptamero-nonamero deve essere seguito da disposizione inversa. Ulteriore differenziamento siti riconoscimento per spaziatori 12 bp e 23 bp: anch essi in posizione invertita. 19

20 Esperimento di Schatz e Baltimore per identificare i geni RAG 1 / 2. Big-Bang evolutivo nella formazione dell immunità adattativa a partire da squali mascellati. Generazione di GOD per inserzione di una sequenza trasposonica all interno dei geni per Ig. Ulteriore diversificazione dei geni delle immunoglobuline. Big-Bang evolutivo nella formazione dell immunità adattativa a partire da squali mascellati. Generazione di GOD per inserzione di una sequenza trasposonica all interno dei geni per Ig. Implicazioni evolutive (SJ Gould, R. Lewontin The Spandrels of St. Marc etc.). Implicazioni evolutive (SJ Gould, R. Lewontin The Spandrels of St. Marc etc.). 12 lezione : VENERDI 10 MAGGIO REGISTRO: 1. Ulteriore variabilità introdotta in IgG da ricombinazione SS imperfetta. Inserzione sequenze IS a partire da squali mascellati (creation of GOD). Ulteriore meccanismo SHM. Domanda Ndounda su HNPCC. Introduzione all Ingegneria Genetica: esperimento di W. Arber su restrizione/modificazione (enzimi restr.) ed animazione su Herb Boyer e Stanley Cohen steps essenziali per la clonazione. Vettori plasmi dici e non-. Clonazione cdna: esempio clonazione direzionale. Cloanzione con sequenze α / ο (Xgal). Bacon probes e PCR quantitativa (Q-PCR). 3.RFLPs x mapping. Esempio Hb A/S cut MstII/ HpaI e Medicina Darwiniana. Microarrays. Genomes (Animaz. Jim Watson + Craig Venter) DETTAGLIATO: INGEGNERIA GENETICA: Gli albori dell ingegneria genetica: esperimenti di Werner Arber su restrizione/modificazione (simili ad esperimenti di Benzer con E. coli B e E. coli K( ). Modificazione spiegata da metilazione da parte ospite. Strumenti di base: taglio con ER netti o sfalzati. Esperimenti seminali di Stanley Cohen e Herb Boyer: generazione vettori con resistenza a Tetraciclina e Kanamicina. (da DNAftb): creazione prima molecola chimera unendo due plasmidi, uno resistente alla Kanamycin e l altro resistente alla Tetracicline, creando quindi una chimera che da resistenza ad ambedue gli antibiotici. Boyer utilizzerà enzimi che creano tagli sfalzati. Per la trasformazione, venne eseguita una tecnica con shock-termico che permette l apertura di pori all interno delle membrane batteriche. Attraverso questi pori passeranno le molecole di DNA associate in precipitati con Ca++ fosfato. Purificazione plasmidi cloruro di cesio/bromuro di etidio o cromatografia. 5 steps per la clonazione: a. estrazione/purificazione DNA; b. taglio con enzima di restrizione specifico (campione-vettore); c. legame campione-vettore seguito da ligasi; d. selezione per cloni ricombinanti, generalmente usando come marcatori resistenze ad antibiotici; e. selezione del gene clonato d interesse, generalmente grazie all ausilio di una sonda. Definizione generale di 20