L'applicazione dei metodi rapidi microbiologici nel processo farmaceutico: case studies

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1 L'applicazione dei metodi rapidi microbiologici nel processo farmaceutico: case studies Francesco Antonetti- Coordinatore gruppo microbiologia di Romasessione qualità AFI

2 Le nuove strategie introdotte dalla ICH Q8 sono basate sulla «Quality by Design (QbD)» e sul Process Analytical Technology (PAT). L obiettivo è ottenere dati che coprano l intero processo, possibilmente in real time e la microbiologia tradizionale non è in grado di soddisfare tali richieste Le tecniche di micro-rapida diventano una valida alternativa e rappresentano anche una risposta responsabile alle richieste regolatorie e di maggior controllo dei rischi e di innovazione (ICH Q9 e ICH Q10) Il potenziale risultato dell applicazione queste nuove strategie è quello di diminuire il rischio della non disponibilità di farmaci dovuta a contaminazione microbica.

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5 Molte industrie farmaceutiche hanno già iniziato ad applicare i metodi rapidi per il controllo microbiologico del processo di Produzione e per il controllo degli impianti/macchinari. In questa presentazione vedremo alcune di queste tecnologie con le relative strategie di validazione e regolatorie

6 La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Rilascio di prodotti liquidi uso oromucosale: collutorio e nebulizzatore Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini Il Pallchek Rapid Microbiology System La bioluminescenza nel laboratorio microbiologico La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini

7 PRINCIPALI STEP DI ELABORAZIONE RISULTATI CONVALIDA PROTOCOLLO PRESENZA/ASSENZA 1,0E+07 1,0E+06 R 1,0E+05 L 1,0E+04 U 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,00E+00 Presenza = prodotto contaminato Threshold limit di presenza/assenza in RLU Assenza = prodotto non contaminato 1,3 UFC Pseudomonas Segnale di presenza al T=0 e al T=24 inoculo 1-5 UFC 1,22E+07 tmtc aeruginosa 2,7 UFC Staphylococcus 9,98E+06 tmtc aureus 3 UFC Bacillus subtilis 7,50E+05 tmtc 3,3 UFC Burkholderia 1,09E+06 tmtc cepacia 3,7 UFC Aspergillus 2,49E+06 tmtc niger 3,7 UFC Escherichia coli 1,61E+07 tmtc 4,3 UFC Staphylococcus epidermidis 1,36E+07 tmtc 4,7 UFC Mix microbico 1,49E+07 tmtc 4,7 UFC Candida albicans 1,32E+07 tmtc T=0 T=24 1.Elaborazione del Threshold limit di presenza/assenza Bioluminescenza vs Tradizionale 2.Arricchimento del campione in terreno liquido L incubazione del campione inquinato in T.S.B. per 24 ore amplifica notevolmente la presenza passando da un numero di UFC contabili su piastra al tempo zero (T=0) pari r i a 1-5UFC, ad un valore incontabile ( tmtc - too many to count) equivalente a RLU (metodicainin bioluminescenza) 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 RLU 1,00E+04 1,00E+03 PRESENZA Threshold limit 1,00E+02 ASSENZA Bioluminescenza Tradizionale 1,00E+01 1,00E+00 3.Confronto risultati qualitativi (presenza/assenza) ottenuti in parallelo (Risultati perfettamente sovrapponibili) 4.Approvazione del prodotto RLU RLU Thresholdlimit, prodotto microbiologicamente puro ovvero ASSENZA RLU > RLU Thresholdlimit, prodotto microbiologicamente contaminato ovvero PRESENZA La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini

8 STEP REGOLATORIO: RICHIESTA DI VARIAZIONE METODO Var. type IB n. B.II.d.2 Change in test procedure for the finished product d) Other changes to a test procedure (including replacement or addition) Authorized situation Proposed situation Research specific microorganisms and microbial counts by tests described in European Pharmacopoeia (current edition monographs and ) Research of specific microorganisms and microbial counts by tests described in European Pharmacopoeia (current edition monographs and ) or as an alternative Presence / absence of microbiological contamination evaluated by bioluminescence method, described in the monograph of the European Pharmacopoeia (current edition) followed, where the bioluminescence test has given a signal of presence of microbiological contamination, by microbial counts and research of specific microorganisms by tests described in the monographs and of the European Pharmacopoeia (current edition) La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini

9 BENEFICI Metodica tradizionale: Giorni 7(+1) Tempi di risposta analitica accorciata notevolmente Metodica bioluminescenza: Giorni 1(+1) Diminuzione dei tempi di stoccaggio Aumento qualità dei controlli (tempestività di risposta) La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini

10 AUMENTO COSTI DIRETTI GESTIONE ANALISI (REATTIVI TEMPO MANODOPERA) 2 3 MESI DI LAVORO PER REALIZZARE UN NUOVO PROGETTO COSTI DI CONVALIDA E DI VARIAZIONI REGOLATORIE PRODUZIONI CON NUMERO LOTTI/ANNO SIGNIFICATIVO La bioluminescenza applicata a forme farmaceutiche non obbligatoriamente sterili. Paola Barraco - Serenella Bruschi Annarita Conti Angelini

11 CONVALIDA DEL METODO MICROBIOLOGICO RAPIDO DI CITOMETRIA IN FASE SOLIDA (CHEMSCAN RDI) PER IL CONTROLLO DI STERILITA DI ANTIBIOTICI INIETTABILI BULK ACS Dobfar SpA PRINCIPIO: si basa sulla tecnologia della citometria in fase solida con fluoresceina diacetato che permea le membrane e, solo nei microrganismi vivi, viene trasformata in fluoresceina dalle esterasi presenti il sistema è costituito da un laser ed un fotomoltiplicatore che captano e amplificano l emissione della fluorescenza; lo strumento rileva la presenza di cellule vive e il processore digitale elabora il segnale ottenuto, usando diversi parametri di discriminazione (colore, forma del segnale e intensità della luce). Il procedimento è costituito dai seguenti passaggi: Filtrazione Marcatura Scansione laser La filtrazione e la marcatura sono passaggi critici, devono essere condotti in isolatore o sotto cappa a flusso laminare (grado A) in ambiente di grado B. La scansione laser, anche se meno critica, deve preferibilmente essere eseguita sotto cappa flusso laminare. VANTAGGI: Non basato sulla crescita Rapido (4 ore) Molto sensibile: limite di rivelazione 1 UFC Recupero contaminanti SVANTAGGI: Non applicabile a prodotti non filtrabili PROBLEMATICHE Possibilità di rilevare microrganismi non coltivabili APPLICAZIONI Analisi di materie prime, prodotti finiti, controlli di processo Bioburden Test sterilità Monitoraggio ambientale Analisi gas compressi Vitalità indicatori biologici

12 Convalida (EP 5.1.6; USP <1223>, <71>) La convalida del metodo ha previsto le seguenti fasi: Design Qualification (DQ) Installation Qualification (IQ) Operational Qualification (OQ) Performance Qualification (PQ) PQ1: convalida in assenza del prodotto PQ2: convalida in presenza del prodotto Parametri di convalida Parametri di convalida - Specificità - Fattibilità - Limite di risoluzione - Equivalenza (tra metodo tradizionale e standard) - Accuratezza - Precisione - Robustness/Ruggedness MICRORGANISMI UTILIZZATI PER LA CONVALIDA Pseudomonas aeruginosa Aspergillus brasiliensis Candida albicans Bacillus subtilis Staphylococcusaureus Clostridium sporogenes Propionibacterium acnes (crescita lenta) Staphylococcushaemolyticus (isolato ambientale) APPROCCIO REGOLATORIO - Richiesta ad AIFA dell autorizzazione all utilizzo di tale tecnica/strumento per il rilascio (con sottomissione della documentazione di convalida) - Sottomissione ad AIFA del DMF con metodo del test di sterilità con chemscan RDI alternativo al metodo tradizionale.

13 Utilizzo Chemscan RDI per Environmental Monitoring in seguito a deviazioni di processo Bini Manuela Bisceglia Matteo GlaxoSmithKline Manufacturing Unipersonale S.p.A Tecnologia: Chemscan RDI Applicazione : determinazione rapida del bioburden delle superfici a supporto della gestione delle anomalie microbiologiche di processo relativamente a reparti sterili Vantaggi : individuazione rapida della Root Cause e Root Entry reale finalizzata ad una rapida identificazione delle azioni correttive e preventive associate Strategia : (PQ-1) qualifica System Suitability tecnologia (applicazione) (PQ-2) validazione del metodo/trend analysis (test di monitoraggio ambientale)

14 Utilizzo RMMs per Environmental Monitoring in seguito a Ripristino di Classe Ambientale Bini Manuela Bisceglia Matteo GlaxoSmithKline Manufacturing Unipersonale S.p.A Tecnologie: Chemscan RDI e Milliflex Rapid Applicazione : determinazione rapida del bioburden dell aria e delle superfici a valle delle attività di ripristino di classe ambientale Vantaggi : screening in tempi ridotti della qualità microbiologica degli ambienti e degli equipment a valle delle attività di ripristino di classe ambientale, al fine di intraprendere azioni correttive e preventive mirate, prima del riavvio delle attività produttive. Strategia : (PQ-1) qualifica System Suitability tecnologie (applicazioni) (PQ-2) validazione dei metodi/trend analysis (test di monitoraggio ambientale)

15 BacT/ALERT 3D 60 : metodo microbiologico rapido per il controllo di sterilità su campioni In Process Control (IPC) e Working Cell Banks. Paola Barzi MerckSerono S.p.A.

16 Technologia BacT/ALERT BacT/ALERT (biomérieux) è un sistema rapido automatico non distruttivo per verificare la presenza/assenza di microrganismi in campioni mediante il metodo per inoculo diretto La tecnologia capta l aumento di CO2 dovuto alla crescita microbica. La conseguente variazione di ph viene rilevata da un sensore colorimetrico (cambio dal grigio al giallo) Applicazioni in MerckSerono MerckSerono ha identificato due campi di applicazione per la tecnologia BacT/ALERT : Monitoraggio di campioni provenienti dal Processo UpStream (USP) dei Bioreattori (dalla fase di amplificazione, harvest & fine processo) Qualifica e rilascio di Working Cell Banks (WCBs) da utilizzare in dosaggi biologici in vitro Vantaggi Identificazione dei campioni (barcode /disponibilità rawdata/id specie) Lettura più facile: lettura automatica ogni 10 min. (non ispezione visiva) Possibilità di analizzare prodotti torbidi Racks basculanti che favoriscono la crescita microbica Maggiore sensibilità (il recupero di 1-10 UFC in presenza di prodotto è più alta rispetto al metodo compendiale) Tempi ridotti per acquisire risultati

17 Strategia per l implementazione Validazione Equipment: IQ, OQ e PQ Studi di fattibilità per avere informazioni preliminari sull applicabilità del sistema per l uso previsto PQ1 Validazione per l uso proposto: 1. GPT 0 (Growth Promotion Test) dei terreni in assenza di prodotto con un inoculo microbico di UFC; questa fase eseguita in duplicato per ogni microrganismo assicura la fertilità di ciascun terreno usato con entrambi i metodi. 2. GPT 1 dei terreni in presenza di prodotto con un inoculo microbico di UFC; questa fase eseguita in duplicato per ogni microrganismo assicura la fertilità di ciascun terreno usato in presenza di prodotto con entrambi i metodi. Non è stata trovata differenza tra i due metodi. 3. GPT 2 dei terreni in presenza di prodotto con un inoculo microbico di 1-10 UFC; questa fase è prevista come analisi comparativa tra il metodo BacT/ALERT e quello compendiale vengono eseguiti. Vengono eseguiti 5 replicati per ogni microrganismo con entrambi i metodi. E stata trovata differenza statisticamente significativa tra i due metodi; questo denota che il BacT/ALERT ha una sensibilità maggiore rispetto al metodo compendiale.

18 Test di Sterilità Rapido a Novartis V&D, Siena Alessandra Antonnicola, Emanuela Lavarini Maria Paolo Baini Rimini, Giugno 2013

19 Test di Sterilità Rapido a Novartis V&D, Siena Tecnologia utilizzata: Milliflex Rapid: filtrazione su membrana, coltura su terreno agarizzato, Bioluminescenza, sistema automatico di analisi dell immagine Applicazione: test di sterilità per rilascio finale di un prodotto iniettabile (vaccino)

20 Strategia per implementazione/regolatoria per il Test di Sterilità Rapido PQ 1 pre-tests; PQ1 in accordo a EP/USP eseguito da Novartis Pharma, Stein AG ( , approvazione FDA Aprile 2009) Studio di fattibilità sul vaccino H1N1 eseguito da Novartis Pharma (Luglio 2009) IQ-OQ sistema Milliflex Rapid e Trilab (Luglio-Agosto 2009) PQ2 (Settembre 2009-Dicembre 2009) Submission a EMEA, type 2 submission (November 2009) EMEA, domande e risposte (Dicembre 2009 Febbraio 2010 ) Parere positivo da CHMP (19 Febbraio 2010) EMEA approva ufficialmente il Test di Sterilità Rapido per il vaccino H1N1 (2 Marzo 2010) Rilascio del vaccino H1N1 con Test di Sterilità Rapido (Marzo 2010) Validazione in corso per il vaccino contro meningite e vaccini influenzali stagionali ( )

21 MONITORAGGIO RAPIDO MICROBIOLOGICO ATTIVO IN CONTINUO DELL ARIA PER CAMERE BIANCHE CON BIOLAZ Elizabeth Bennett (Particle Measuring System)

22 Lo strumento Biolaz di Particle Measuring Systems utilizza la metodologia IMD (Istantaneous Microbial Detection) che rileva le particelle in aria discriminando i componenti inerti dalle unità biologiche; viene rilevata la fluorescenza emessa da metaboliti cellulari Scopo di questo case study è stato di verificare che Biolaz funzioni correttamente in grado A (zona di riempimento) e non sia suscettibile di falsi positivi derivati da specifici prodotti chimici e materiali comuni per camere bianche che vengono introdotti nell'ambiente usati per la pulizia.

23 Test chimici 6% Perossido di idrogeno (Steri Perox 6% ) 6% Perossido di idrogeno (Klercide-CR Sterile Filtered Biocide C) 70% USP Isopropyl alcool mist aerosol (Dec-Ahol mist aerosol) 70% USP Isopropyl alcool spray IPA) (Klercide 70/30 Sterile Soluzione di ipoclorito di sodio 0,52% Biocide E) (Klercide-CR Sterile Test dei materiali Maschera naso e bocca per cleanroom Indumenti per Cleanroom Contec polypropylene nonwoven wiper (Helix ) Contec quiltec I two-ply polyester wipes (QT1-99)

24 Installato sotto grado A in ambiente asettico: durante la produzione (giorno 2)

25 6% Hydrogen Peroxide (Klercide-CR Sterile Filtered Biocide C) 70% USP Isopropyl alcohol spray (Klercide 70/30 Sterile IPA) Clean room nose and mouth mask Contec polypropylene nonwoven wiper (Helix )

26 Il Biolaz è in grado di leggere zero Bio-Counts in zona di produzione asettica di grado A sia nel riposo e nello stato di utilizzo, in corrispondenza con i risultati osservati sugli attuali metodi tradizionali. I prodotti chimici che vengono comunemente utilizzati in ambiente sterile non presentano Bio-Counts sul Biolaz, inoltre il sistema indica che non vi è alcun danno o effetto residuo sullo strumento. Il Biolaz non è suscettibile di false indicazioni positive da indumenti e materiali di pulizia comuni come previsto in questo studio (test di stress).

27 IDENTIFICAZIONI GENOTIPICHE MEDIANTE SEQUENZIAMENTO L esperienza del sito Eli Lilly Italia utilizzando lo strumento Microseq

28 SITO DI UTILIZZO IDENTIFICAZIONI GENOTIPICHE MEDIANTE SEQUENZIAMENTO FARMACEUTICA ELI LILLY ITALIA di SESTO FIORENTINO TECNOLOGIA VANTAGGI/BENEFICI APPLICAZIONI Amplificazione di geni conservati che contengono regioni divergenti per identificare la specie: ü Batteri amplificazione della regione 5 del gene 16S rrna ü Funghi amplificazione della regione D2 del gene Large-Sub Unit rrna Rapidità: prelievo diretto dalla colonia riduzione rapporto ore uomo/n analisi Efficienza: analisi muffe - microrganismi difficilmente coltivabili/stressati - riduzione tempi ID ID contaminanti EM di aree di produzione (sterili e non) Controllo delle acque di processo Controllo dei ceppi microbici di riferimento e isolati locali TEMPISTICA ANALITICA La rapida risposta analitica entro 5-6 ore permette di: ü implementare idonee contromisure per prevenire la ricorrenza degli eventi ü ridurre i tempi di rilascio dei prodotti ü anticipare le attività per migliorare l efficacia delle azioni correttive mirate

29 IDENTIFICAZIONI GENOTIPICHE MEDIANTE SEQUENZIAMENTO INSTALLATION QUALIFICATION (IQ) OPERATION QUALIFICATION (OQ) Eseguite dal fornitore (Good Manufacturing Practice ) PERFORMANCE QUALIFICATION (PQ) Eseguita dalla Eli Lilly (EP - USP - Guideline Applied Biosystem) Kit testati: Bacterial e Fungal Parametri verificati con ceppi ATCC (da Farmacopea) e isolati locali ü Specificità ü Accuratezza ü Riproducibilità ü Precisione ü Robustezza Risultati ü CONFORMITA per tutti i parametri saggiati, con tutti i ceppi test BILANCIO DI UN ANNO DI ATTIVITA AFFIDABILITA dei dati analitici: 100% Identificazioni eseguite: ~ 1300 ü Identificazioni accettate come Specie: 97-98% Riproducibilità anche con analisti diversi Non rilevate difficoltà analitiche/di sistema nella routine APPROVAZIONE L implementazione del MicroSeq non necessita di autorizzazioni di Enti Regulatory perché le identificazioni microbiche non rientrano nei test di rilascio eseguiti direttamente sul prodotto.

30 Gruppo di microbiologia di Roma: Roberto Alesci (Merck Millipore) Federico Biella (life technologies) Serenella Bruschi (Angelini) Valeria Giannelli (Pfizer) Paola Megna (ACS Dobfar) Patrizia Muscas (Lilly) Giorgio Prina (BioMérieux) Cherubina Santoro (Lilly) Manuel Selvaggio (Wyeth) Paola Barzi (Merck Serono) Matteo Bisceglie (GSK) Monica Fadione (Corden Pharma), Paola Lazzeri (Particle Measuring Systems) Annalisa Milanesi (BioMerieux) Luciano Ninu( BioMerieux) Daniele Quaratino (Merck Millipore) Marco Sanvito (Pall Italia) Ringraziamenti al Dr. Francesco Boschi e al gruppo di microbiologia di Milano

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