Protein folding. (Il ripiegamento delle proteine)

Transcript

1 Protein folding (Il ripiegamento delle proteine)

2 Folding in vitro e in vivo

3 (D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., Worth Publishers, 2005)

4 Il folding delle proteine: perché è importante il suo studio? Un numero crescente di malattie ha come causa il misfolding di proteine; Il design di nuove proteine è legato alla conoscenza dei processi di folding delle stesse; La produzione di proteine ricombinanti incontra le maggiori difficoltà per la possibile presenza di corpi inclusi, dovuti a misfolding delle proteine espresse.

5 Ribonucleasi A Denaturazione e Rinaturazione (D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, Fundamentals of Biochemistry, 2nd ed., John Wiley & Sons, 2005)

6 (D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3 ed., John Wiley & Sons, 2004)

7 Paradosso di Levinthal Proteina di 100 residui Due gradi di liberta torsionali/residuo (phi,psi) 3 conformazioni accessibili per ogni grado di liberta torsionale 3 2x100 possibili conformazioni esplorate/sec Tempo richiesto per esplorare tutte le conformazioni: t = 20 x 10 9 anni! Le proteine si devono ripiegare seguendo un cammino definito, caratterizzato da conformazioni via via piu stabili (diminuizione di G)

8 Fasi del folding Fase veloce burst iniziale: buona parte delle strutture secondarie sono realizzate entro pochi millisec dall inizio del folding. Guidata dal collasso idrofobico, che espelle molecole d acqua dal core della proteina in ripiegamento (misurato con fluorescenza di ANS, CD, maggiore protezione nello scambio H/D). Il burst porta al molten globule, contenente buona parte della struttura secondaria attesa, e con raggio di girazione 5-15% maggiore di quello della proteina folded. Catene laterali relativamente libere.

9 Fasi del folding Stabilizzazione delle strutture secondarie, e formazione dei proto-domini ( ms). Strutture ancora in parte fluttuanti; conformeri in interscambio. Stabilizzazione della struttura terziaria finale; espulsione definitiva di molecole d acqua; formazione di tutti i legami idrogeno... (richiede diversi secondi; a seconda della complessita della proteina). Il processo di folding e considerato gerarchico, nella sua essenza. ΔG folding caratterizzato da valori bassi (-5, -10 kcal/mol)

10 (D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., W.H. Freeman & Co., 2005)

11 Page 285 Folding funnels. Rugged energy surface. La rappresentazione considerata piu verosimile

12 (C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern, Biochimica, 3 ed., Casa Editrice Ambrosiana, 2004)

13 (C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern, Biochimica, 3 ed., Casa Editrice Ambrosiana, 2004)

14 PDI ridotta catalizza il riarrangiamento di ponti S-S non-nativi Protein Disulfide Isomerase: PDI Riaggiustamento dei ponti S-S in RNAsi A in 2 min

15 (D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3 ed., John Wiley & Sons, 2004)

16 X-Ray structure of GroEL (E.coli). Side view perpendicular to the 7-fold axis D. apicale D. interm. ATPγS D. equat. 7 x 2 x 547 res. Simm. D 7 (72) Page 292

17 X-Ray structure of the GroEL-Gro-ES-(ADP)7 complex. Page Å Å3

18 (D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3 ed., John Wiley & Sons, 2004)

19 (D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3 ed., John Wiley & Sons, 2004)

20 MALATTIE CONFORMAZIONALI A) dipendenti da amiloide B) dipendenti da prioni A) circa 20 malattie umane, spesso fatali Depositi amiloidi Alzheimer Encenfalopatie (TSE) Amiloidosi sistemiche (cuore, fegato, reni) Fibrille amiloidi Struttura cross-beta

21 Modello schematico di aggregazione in fibrille amiloidi

22 Fibrilla amiloide (intera, a sinistra) composta da 4 β sheets Page 307 diametro ca. 10 nm

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24 Human Apolipoprotein A-I Leu174Ser Variant

25 Human Apolipoprotein A-I Leu174Ser Variant

26 Malattie amiloidi Lisozima (amiloidosi viscerale familiare) Transtiretina (polineuropatia amil. familiare) β2-microglobulina (artropatia da emodialisi) Fibrinogeno (amiloidosi renale ereditaria)

27 Malattia di Alzheimer Malattia neurodegenerativa dell eta senile Placche (costituite da fibrille amiloidi, composte da Aβ) nel tessuto cerebrale, associate a neuroni morti/danneggiati Neurofibrille nel corpo delle cellule neuronali (proteina Tau iperfosforilata,originale dei microtubuli)

28 PROTEINA β-amiloide Aβ (40 42 residui) costituisce la placche amiloidi. Aβ deriva dalla Aβ precursor-protein (βpp), una proteina transmembrana di 770 res., forse ad attivita recettoriale. Aβ viene liberato dall azione di due proteasi associate alla membrana (β-secretasi e γ- secretasi). Aβ neurotossica per iniezione in cervelo di ratto.

29 PROTEINA β-amiloide Lenta deposizione di placche amiloidi (10% popolazione di 65 anni, 50% popolazione di 85 anni) Alzheimer precoce: forme mutanti di βpp maggiormente suscettibili di proteolisi Sindrome Down: trisomia del cromosoma 21, ove co-localizza il gene per βpp pazienti Down sviluppano Alzheimer entro il 40 anno di eta, per eccesso di produzione di Aβ

30 PROTEINA β-amiloide La variante apoe4 della apolipoproteina E (trasporto del colesterolo) e un fattore di rischio per l Alzheimer. apoe4 favorisce l aggregazione di Aβ, portando ad una maggior densita di placche amiloidi nel cervello. Non sono note terapie efficaci contro l Alzheimer (possibilita : inibizione delle secretasi o interferenza con la formazione delle fibrille a partire da Aβ solubile).

31 Malattie da PRIONI Scrapie, BSE, Kuru, Creutzfeldt-Jacob Neuroni caratterizzati da marcati vacuoli aspetto spongiforme TSE (encefalopatie spongiformi trasmissibili). Non attivano risposte immunitarie Malattie lente (richiedono anni) Inoculazione di campioni proteici in cervello di ratto come test di laboratorio.

32 BSE, mad cow disease, malattia della mucca pazza

33 Malattie da PRIONI L agente dello scrapie e inattivato da reattivi diretti verso le proteine, e non da quelli diretti vesro gli acidi nucleici. PRION: proteinaceous infective protein lacking nucleic acid. PrP: agente dello scrapie, proteina di 280 residui, prev. idrofobici, ancorata alla membrana del nerone via glycosylphosphatidyl-inositol (GPI).

34 Malattie da PRIONI Prp-n e il gene codificante per PrP. Diffuso in tutti i vertebrati e negli invertebrati (es. Drosophila). E ugualmente espresso negli animali sani e in quelli affetti da neuropatie. L inattivazione di Prp-n non da luogo ad un fenotipo evidente. PrP potrebbe essere un normale recettore di segnale associato alla membrana

35 Malattie da PRIONI L inoculazione in ratto indica che PrP SC induce la conversione di PrP C nella forma patologica (appunto PrP SC ). Mutazioni del gene Prp-n nell uomo sono associate a malattie neurodegenerative (fam. CJD, GSS, FFI).

36 Struttura 3D di PrP C (res ) 98 res. N-ter disordinati 110 res strutturati in un dominio contenente 3 α-eliche e 2 β-strands. PrP C e PrP SC sono chimicamente identiche (nessuna mod. post-traslazionale). PrP C e PrP SC differiscono sostanzialmente per strutture IIria e III-ria. La conversione di PrP C PrP SC e autocatalitica (ma puo intervenire un chaperone non identificato). PrP C e PrP SC alla lunga sono proteolizzate nella cellula. PrP C viene completamente digerita. PrP SC e poco suscettibile alle proteasi PrP (kda) per perdita di 67 residui N-ter. PrP aggrega spontaneamente in fibrille.

37 Page 311 Prion protein conformations. (a) The NMR structure of human prion protein (PrP C ).

38 Page 311 Prion protein conformations. (b) A plausible model for the structure of PrPSc.

39 Page 307 Amyloid fibrils. (a) An electron micrograph of amyloid fibrils of the protein PrP

40 BSE in the UK 1985 Bovine spongiform encephalitis 1993 peak (3000 BSE cases/month) Cattle food based on scrapie-infected sheep meat and bones 5-year incubation Ban on feeding ruminants with ruminat-derived protein material Higher temperatures for food manufacturing Rapid exit from crisis (slaughtering thousands of bovines) At least 110 humans infected by bovine meat before the year Developed CJD.

41 un sito della Societa ITaliana per l Amiloidosi, dove si possono trovare informazioni di cararttere generale sulle amiloidosi Sistemiche e la loro diffusione.

42 Phe E15 Phe B9 Leu G12 42