Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUSL N. 6 Livorno, Italia 2

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1 Review Thrombocytopenia and new pharmacological treatments Giancarlo Maria Liumbruno 1, Giuliano Grazzini 2, Maria Laura Sodini 1 1 Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUSL N. 6 Livorno, Italia 2 Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUSL N. 2 Lucca, Italia Introduction Since 1906, the year in which James Homer Wright demonstrated that megakaryocytes generated platelets, up to then known as "blood dust", great advances have been made in the understanding of the molecular mechanisms controlling thrombopoiesis and in the knowledge of the structure and mechanisms of the cell receptor that regulates megakaryocytopoiesis and the production of platelets 1-4. Over 40 years ago Kelemen and colleagues predicted the existence of a potent growth factor specific for the megakaryocytic line, contained in the plasma of thrombocytopenic patients and animals, which they gave thenamethrombopoietin(tpo) 5. Thenextfundamentalstepwasthecloningofthemurine myeloproliferative leukemia retroviral oncogene (v-mpl) 6 ; this achievement opened the way to the cloning, in 1992, of the human homologue, the proto-oncogene c-mpl, which codes for the TPO membrane receptor (rtpo) 7. Finally, in 1994, TPO was isolated and cloned almost contemporaneously by five independent groups of researchers Subsequently it was demonstrated that this cytokine, besides playing a major role in megakaryocytopoiesis, from the formation of megakaryocytic colonies right up to the production of platelets, has pleiotropic effects on haematopoiesis. Following its cloning, various different forms of recombinant TPO were produced; two molecules in particular have been the subject of numerous pre-clinical and clinical studies: recombinant human TPO (rhutpo) Correspondence: Dr. Giancarlo Maria Liumbruno Viale Italia, Livorno, Italia giancarlo@liumbruno.it Introduzione A partire dal 1906, anno in cui James Homer Wright dimostrò che erano i megacariociti a generare le piastrine (PLT), fino ad allora conosciute come"polvere del sangue", sono stati fatti notevoli progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari che controllano la trombopoiesi e nella conoscenza della struttura e dei meccanismi di funzionamento del recettore cellulare che regola la megacariocitopoiesi e la produzione di piastrine 1-4. Oltre 40 anni fa Kelemen e collaboratori predissero l'esistenza di un fattore di crescita potente e specifico per la linea megacariocitaria, contenuto nel plasma di pazienti e animali piastrinopenici, per il quale coniarono il nome di trombopoietina(tpo) 5. La tappa fondamentale successiva fu costituita dalla clonazione dell'oncogene retrovirale della leucemia mieloproliferativamurina(v-mpl) 6 ;questascoperta,infatti, aprìlastradaallaclonazione, nel1992, dell'omologoumano, il protooncogene c-mpl, che codifica per il recettore di membranadellatpo(rtpo) 7. Nel 1994, infine, la TPO fu isolata e clonata quasi in contemporanea da cinque gruppi di ricercatori indipendenti È stato dimostrato in seguito che questa citochina, oltre ad avere un ruolo da protagonista nella megacariocitopoiesi, dalla formazione di colonie megacariocitarie fino alla produzione di PLT, ha un effetto pleiotropico sull'emopoiesi. Successivamente alla sua clonazione, sono state prodotte diverse forme di TPO ricombinante; due molecole in particolare sono state oggettodinumerosistudipre-clinicieclinici: latpoumana ricombinante (rhutpo) e il fattore di crescita e sviluppo megacariocitario umano ricombinante e pegilato (PEGrHuMGDF). A tutt'oggi, diversamente da quanto verificatosi con 265

2 GM Liumbruno et al and pegylated recombinant human megakaryocyte growth anddevelopmentfactor(peg-rhumgdf). Unlike the other growth factors, such as G-CSF and erythropoietin(epo), morethan10yearsafterbeingcloned, recombinanttpoisstillnotavailableforclinicaluse 13.The numerous studies carried out have, however, enabled a considerable acceleration in the understanding of the physiology and biology of thrombopoiesis and haematopoiesis in general 14. The pharmacological options for the treatment of thrombocytopenia range from cytokines with a general thrombopoietic potential to therapies that specifically act on the TPO receptor (synthetic forms of TPO and TPOmimetic agents). The subject of this review are the rtpo agonists which seem to be able to produce clinically significant results in the treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) and which are currently the focus of multiple lines of research. Cytokines with thrombopoietic action Thrombocytopenia is a problem commonly found during the treatment of patients with cancer or haematological diseases and is also present in other clinical situations, such as chronic liver failure, AIDS, liver transplantation and heart surgery. Transfusion therapy with platelet concentrates, which started in the 1960s with the commercial production of plastic bags, is still the treatment of choice for the acute phase of severe thrombocytopenia. In the last 20 years, numerous growth factors with thrombopoietic activity in vitro or in animal models, besides TPO, have been identified; these include granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM- CSF), G-CSF, EPO, leukemia inhibitory factor(lif), stem cell factor (SCF) (c-kit ligand or steel factor), IL-1β, IL-3, IL-6, IL-9 and IL In vitro studies have shown a synergistic role in various stages of megakaryocytopoiesis for SCF, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, EPO, LIF and TPO, although, in the animal models studied, only knocking out the genes for SCF and TPO has shown a negative impact on the production of megakaryocytes and platelets; it is not clear, at the moment, whether these results can be extrapolated to humans 17. Many of these molecules with thrombopoietic activity havebeenusedclinically, albeitoftenonlybriefly; examples, besides TPO, are IL-3, IL-6, SCF and other molecules, obtained by genetic engineering, such as: 1) the fusion protein between GM-CSF and IL-3 (PIXY321); 2) the so- altrifattoridicrescita, qualiilg-csfel'eritropoietina(epo), a oltre dieci anni dalla sua clonazione, la TPO ricombinante non è disponibile per impiego clinico 13. I numerosi studi condotti hanno però consentito una notevole accelerazione nella comprensione della fisiologia e biologia della trombopoiesi e dell'emopoiesi in generale 14. Le opzioni farmacologiche per il trattamento della piastrinopenia sono costituite dalle citochine con potenziale trombopoietico generale e dalle terapie attive sul recettore dellatpo(tposinteticheeagentitpo-mimetici). Oggetto di questa Rassegna sono gli agonisti del rtpo, i quali sembrano essere in grado di produrre risultati clinici significativi nel trattamento della porpora trombocitopenica idiopatica (PTI) e che sono, attualmente, al centro di molteplici filoni di ricerca. Citochine con azione trombopietica La piastrinopenia è un problema di comune riscontro nel trattamento di pazienti oncologici ed ematologici ed è presente anche in altri scenari clinici, come l'insufficienza epatica cronica, l'aids, i trapianti epatici o la cardiochirurgia. La terapia trasfusionale con concentrati piastrinici, sviluppatasi a partire dagli anni '60, con la produzione commerciale delle sacche di plastica, rimane attualmente il presidio terapeutico di elezione, in fase acuta, per le piastrinopenie gravi. Nell'ultimo ventennio, oltre alla TPO, sono stati identificati numerosi fattori di crescita con attività trombopoietica in vitro o in modelli animali; tra questi il GM-CSF, G-CSF, l'epo, illeukemiainhibitoryfactor(lif), lostem cell factor (SCF) (c-kit ligand o steel factor), l'il-1β,l'il-3,l'il-6,l'il-9el'il Studiinvitrohanno identificato un ruolo sinergico nelle varie fasi della megacariocitopoiesiperscf,il-3,il-6,il-11,g-csf,epo, LIF e TPO ma, nei modelli animali esaminati, solo l'eradicazione del gene per SCF e TPO ha mostrato un impatto negativo sulla produzione di megacariociti e PLT; non è chiaro, al momento, se questi risultati possano essere estrapolabiliall'uomo 17. Molte di queste molecole con attività trombopoietica hanno trovato un impiego clinico spesso effimero; tra queste, oltreallatpo, l'il-3, l'il-6, loscfealtremolecole, ottenute con tecniche di ingegneria genetica, quali: 1) la proteina di fusione tra GM-CSF e IL-3 (PIXY321); 2) la cosiddetta sintochina, un analogo dell'il-3 (SC-55494); 3) l'agonista del recettore dell'il-3 (Daniplestim); 4) il doppio agonista chimerico (DAC) dei recettori del G-CSF e 266

3 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments called synthokine, an anologue of IL-3 (SC-55494); 3) the agonist of the IL-3 receptor (Daniplestim); 4) the chimeric, dual G-CSF and IL-3 receptor antagonist (SC70935, Leridistim); 5) the chimeric, dual TPO and IL-3 receptor agonist (Promegapoietin-1α). Combined therapeutic strategies have also been adopted, such as the use of IL-3 togetherwithg-csforgm-csf,oril-6andg-csf 15,16. The modest results obtained from the clinical use of interleukins is explained, in part, by the fact that their action on the multiple stages of thrombopoiesis is not their main or indeed only physiological function. Often, besides their modest favourable effect on thrombocytopenia, they have additional, considerable toxic side effects such as hyperbilirubinaemia, rapid production of anaemia, fever, fatigue, shivers, hypotension and headache. These complications, due to the pleiotropic effects of interleukins, have limited the clinical use of these cytokines 14. At present, only IL-11 is used in the USA ; this cytokine, with effects on many tissues (brain, spinal cord neurones, gut and testis) was isolated in and, as oprelvekin(neumega;wyeth/geneticinstitute, Cambridge, MA, USA), was approved in 1997 by the Food and Drug Administration (FDA) in the USA for the prevention of post-chemotherapy thrombocytopenia in adults with solid tumoursorlymphomas 19. Oprelvekin has not been shown to be able to reduce platelet transfusion needs in patients undergoing autologous bone marrow transplantation and has caused a higher incidence of side effects (tachycardia, hypotension, oedema) in this setting 16,19. For adults with adequate renal function(creatinine clearance >30 ml/min), therecommendeddoseis50µg/kg/die,startedfrom6to24 hours after chemotherapy and continued for days, until the platelet count (PC) exceeds 50x10 9 /L. It has been suggested that IL-11 should not be used for more than 21 days and that the cytokine treatment should be interrupted 2 days before the start of chemotherapy 19. Good results have recently been reported with the use ofoprelvekinatareduceddose(10 µg/kg/diefortwotwiceweekly cycles separated by an interval of 2 weeks) in patients with thrombocytopenia due to bone marrow failure [myelodysplastic syndromes(mds) and aplastic anaemia] and also in paediatric patients with solid tumours or lymphomas, although in these cases treated with standard doses 15,20,21. A not negligible incidence of side effects has been reported in the paediatric setting; in particular anti-il-11 antibodies have developed in 4% of the patients 20,21. dell'il-3(sc70935,leridistim);5) ildacdeirecettoridella TPOeIL-3(Promegapoietin-1α). Sonostateinoltreadottate strategie terapeutiche combinate, come l'utilizzo di IL-3 insiemeag-csfogm-csf,oppureil-6eg-csf 15,16. I modesti risultati, ottenuti con l'impiego clinico di queste IL, si spiegano anche con il fatto che la loro azione sul processo a stadi multipli della trombopoiesi non costituisce la loro principale ed unica funzione fisiologica. Spesso, inoltre, al modesto effetto favorevole sulla piastrinopenia, si sono aggiunti importanti effetti di tossicità collaterale quali iperbilirubinemia, anemizzazione rapida, febbre, fatigue, brividi, ipotensione e cefalea, imputabili all'effetto pleiotropico delle IL, che ne hanno condizionatoillimitatoimpiego 14. Attualmentesoltantol'IL-11èutilizzatanegliUSA ; questa citochina, con effetti su molti tessuti (cervello, neuroni del midollo spinale, intestino e testicolo), fu isolata nel eapprovatanel1997comeoprelvekin(neumega; Wyeth/GeneticInstitute, Cambridge, MA, USA) dallafda (Federal Drug Administration) degli USA, per la prevenzione della piastrinopenia post-chemioterapia negli adulti con tumori solidi e linfomi 19. Nei pazienti sottoposti ad autotrapianto di midollo osseo, invece, l'oprelvekin non ha evidenziato la capacità di ridurre il fabbisogno trasfusionale piastrinico e ha causato una maggiore incidenza di effetti collaterali (tachicardia, ipotensione, edemi) 16,19. Per gli adulti con funzionalità renale adeguata (clearance della creatinina >30 ml/min), la dose raccomandata è 50 µg/kg/die, da iniziare da 6 a 24 oredopo la chemioterapia e da proseguire per giorni, finché la conta piastrinica (CP) non supera le 50x10 9 /L. Altre indicazioni suggeriscono di non usare l'il-11 per più di 21 giorniediinterrompereiltrattamento2giorniprimadell'inizio della chemioterapia 19. Recentemente, sono stati riportati buoni risultati con l'impiego di oprelvekin, a dosaggio ridotto(10 µg/kg/die per 2 cicli bisettimanali, intervallati da 2 settimane di pausa), in pazienti con piastrinopenia da insufficienza midollare[sindrome mielodisplastica(smd) e anemia aplastica] e anche in pazienti pediatrici con tumori solidi o linfomi, trattati però con dosaggi standard 15,20,21 ;in ambito pediatrico è tuttavia segnalata una non trascurabile incidenza di effetti collaterali, tra i quali soprattutto la comparsa di anticorpi anti-il-11 nel 4% dei pazienti 20,21. La trombopoietina La TPO, mediante lo specifico recettore, stimola la cellula staminale emopoietica a indirizzarsi verso la linea 267

4 GM Liumbruno et al Thrombopoietin TPO, through its specific receptor, stimulates the haematopoietic stem cell towards the megakaryocyticplatelet line and also controls the proliferation and differentiation of megakaryocytes. In anucleated platelets, the action of TPO on its receptor is translated into control of platelet aggregation and secretion 22. TPO is a growth factor that is synthesised predominantly in the liver; its mrna can be found not only in the sites of its synthesis, such as the liver (parenchymal cells and the endothelium of sinusoids) and the kidney, but also in skeletal muscles, in the spleen, bone marrow, placenta and brain, although the physiological relevance of its presence in these sites is unknown 17,19. ThemoleculeofmatureTPOisformedof332aminoacids, divided into two regions. The N-terminal domain, which is the receptor site, is formed of a sequence of 153 amino acids that has 23% homology with the amino acid sequence of EPO; this domain contains two distinct receptor binding sites: onehighaffinity, theotherlowaffinity.thec-terminal domain is formed of a sequence of 179 amino acids, rich in carbohydrates, which is involved in the secretion and stability of TPO. TPO binds to its receptor with a stochiometric ratio of 1:2 and induces its dimerisation with consequent intracellular transduction of the differentiating and proliferative signals, through the activation of a complex network, which starts with the phosphorylation of the intracellular domain of the rtpo and various secondary signalling molecules such as: a) the JAK family kinases (an acronym derived from the original name just another kinase, then changed into Janus kinase); b) transcription factors called signal transducers and activators of transcription (STATs); c) phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K/Akt); d) Ras/MAPK (rat sarcoma virus/mitogen-activated protein kinase). The activation of these molecules gives rise to a signal that induces megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis 4, rtpo, also known as MPL (from myeloproliferative leucaemia), TPOR, CMPL and CD110, belongs to a superfamily of type I cytokine receptors and has two extracellular domains named CHR (cytokine receptor homology). TPO binds to the receptor through the distal CHRdomain,while it does not interactinanywaywiththe proximal domain; this has led to the hypothesis, albeit completely speculative, that there is another, as yet unidentified, cytokine that can interact with rtpo 19,4. The mechanisms that regulate the levels of TPO and the ways that this latter controls thrombopoiesis have been megacariocitaria-piastrinica e controlla anche la proliferazioneedifferenziazionedeimegacariociti;nelleplt anucleate, invece, l'azionedellatposulmedesimorecettore si traduce in un'azione di controllo su aggregazione e secrezione 22. La TPO è un fattore di crescita a sintesi prevalentemente epatica;ilsuornamèrilevabile,oltrecheneisitidisintesi, come il fegato (cellule parenchimali e endotelio dei sinusoidi) e il rene, anche nel muscolo scheletrico, nella milza, nel midollo osseo, nella placenta e nel cervello, ma non è noto quale sia il significato fisiologico di questa presenza 17,19. La molecola della TPO matura è costituita da 332 aminoacidi, suddivisi in due regioni. Il dominio N- terminale, che è il sito recettoriale, è costituito da una sequenza di 153 aminoacidi, con il 23% di omologia alla sequenza dell'epo; questo dominio contiene 2 distinti siti di legame con il recettore: uno ad alta affinità ed uno a bassa affinità. Il dominio C-terminale è costituito da una sequenza di 179 aminoacidi, ricca di carboidrati, che è implicata nella secrezione e nella stabilità della TPO. La TPO si lega al suo recettore con un rapporto stechiometrico pari a 1:2 e ne induce la dimerizzazione; ne consegue la trasduzione del segnale differenziativo e proliferativo a livello intracellulare, mediante l'attivazione di un di un complesso network, il quale ha inizio con la fosforilazione del dominio intracellulare del rtpo e di diverse molecole di comunicazionesecondariecome: a) lechinasidellafamiglia JAK (acronimo derivante dal nome originale just another kinase, poi trasformato in Janus kinase); b) i fattori di trascrizione denominati "trasduttori di segnale e attivatori della trascrizione" [signal transducers and activators of transcription (STATs)]; c) la fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K/Akt); d) la Ras/MAPK (rat sarcoma virus/mitogenactivated protein kinase). L'attivazione di queste molecole di comunicazione dà origine al segnale che induce la megacariocitopoiesi e la trombopoiesi 4, Il rtpo, noto anche come MPL (da myeloproliferative leukemia), TPOR, CMPL e CD110, appartiene alla superfamiglia dei recettori delle citochine di tipo I ed è dotatodi2dominiextracellularidenominatichr(cytockine receptor homology); il recettore, mediante il dominio CHR distale, lega la TPO, mentre il dominio prossimale non interagisce in alcun modo con la stessa; questo, secondo alcuni, potrebbe fare ipotizzare, sebbene in modo del tutto speculativo, l'esistenza di un'altra citochina, ancora non identificata, in grado di interagire con il rtpo 19,4. ImeccanismicheregolanoilivellidellaTPOelemodalità con le quali quest'ultima controlla la trombopoiesi, pur essendo stati identificati in modelli animali, si applicano 268

5 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments identified in animal models but are applicable also in humans Thrombocytopenic mice, with levels of TPO up to ten times normal, show no changes in the expression of mrna for TPO in either the liver or the kidney and the induction of thrombocytosis does not cause a reduction in TPO mrna expression 28,29. These and other observations support the conclusion that most circulating TPO is synthesised in a constant manner by the liver and kidney, independentlyofthepc;aslongasthepcremainsnormal, onlyalimitedquantityofthetpoproducedisnotabsorbed by the circulating platelets and remains available to stimulate the production of new platelets. In contrast, in patients with an abnormal PC, the level of TPO in the circulation varies in inverse proportion to the number of platelets: this constitutes the stimulus that induces precursor cells and megakaryocytes to restore normal levels of platelets. This is a so-called sponge regulation model, originally described by De Gabriele and Penington in 1967 and subsequently revisited by Kuter and Rosenberg in 1995, according to which the main mechanism regulating the levels of TPO is based on its clearance by the platelets themselves In fact, after binding with the rtpo on platelets and megakaryocytes, the TPO is internalised and broken down; the endocytosis of the TPO-receptor complex interrupts the transduction of the proliferative signal at the intracellular level and, based on the rate of this, regulates both the number of rtpo expressed on the cell surface and the levels of TPO in the circulation. The inverse relationship between plasma levels of TPO and the numbers of circulating platelets is an example of feedback regulation, although there are some anomalies. In contrast to what happens with the control of red blood cells by EPO, there is no sensor of the amount of circulating platelets that controls the production of TPO; rather, the plasma level of this cytokine is determined by the rate of its clearance by the rtpo on platelets and megakaryocytes. Thus, in ITP, even in the presence of marked thrombocytopenia, there are normal, rather than increased, levels of TPO, because the break down of the TPO continues as a result of the poolofmegakaryocytesfromthehypertrophicbonemarrow. In myeloproliferative disorders, on the other hand, because of an abnormal rate of endo-exoctyosis of the rtpo and the consequent reduced extracellular expression of the receptor, there is reduced degradation of TPO, which is, therefore, present in the circulation at normal or even increased levels, despite increased numbers of platelets and megakaryocytes 13,14,17,19,22, The fact that platelets reduce the amount of circulating anche all'uomo Topipiastrinopenici,conlivellidiTPO fino a 10 volte quelli normali, non mostrano alcun cambiamento nell'espressione dell'rnam per la TPO a livello epatico o renale e, analogamente, l'induzione di piastrinosi non ne determina una riduzione 28,29. Queste e altre osservazioni supportano la conclusione che la maggior parte della TPO in circolo è sintetizzata in maniera costante da fegato e rene, indipendentemente dalla CP; finché quest'ultima si mantiene normale, solo una limitata quantità di TPO prodotta non viene assorbita dalle PLTin circolo e rimane disponibile per stimolare la produzione di nuove PLT; invece, neipazienticoncpalterate, sihaunavariazione del livello di TPO in circolo inversamente proporzionale al numero di PLT: questo costituisce lo stimolo che induce le cellule precursori ed i megacariociti a ripristinare normali livelli di PLT. Si tratta del cosiddetto modello di regolazione a spugna, descritto originariamente da De Gabriele e Penington nel 1967 e successivamente ripreso da Kuter e Rosemberg nel 1995, secondo il quale il meccanismo principalecheregolailivelliditpoèbasatosullaclearance della stessa da parte delle PLT Infatti, dopo il legame con il rtpo sulle PLT e sui megacariociti, la TPO viene internalizzata e degradata; l'endocitosi del complesso recettore-tpo interrompe la trasduzione del segnale proliferativo a livello intracellulare e, con il suo ritmo, regola sia il numero di rtpo espressi sulla superficie cellulare, che i livelli di TPO in circolo. La relazione inversa che esiste tra il livello plasmatico di TPO e il numero di PLTcircolanti è un esempio di regolazione a feedback, chepresentaperòalcuneeccezioni. Diversamente da quanto accade con il controllo dei globuli rossi da parte dell'epo, non esiste un sensore della quantità di PLT circolanti che controlla la produzione di TPO, ma il livello plasmatico di questa citochina è determinato dal ritmo della sua clearance da parte dei rtpo su PLT e megacariociti. Pertanto nella PTI, anche in presenza di una spiccata piastrinopenia, si riscontrano livelli di TPO normali, invece che aumentati, perché la degradazione della TPO prosegue ad opera del pool dei megacariociti midollari ipertrofico. Nei disordini mieloproliferativi, invece, a causa di un'anomalia nel ritmo di endo-esocitosi del rtpo e della conseguente ridotta espressione extracellulare dello stesso, si assiste ad una ridotta degradazione della TPO, presente in circolo a livelli normali o addirittura superiori alla norma, pur in presenza di un numero di PLT e megacariociti aumentato 13,14,17,19,22, Il fatto che le PLT riducano la TPO in circolo, assorbendola e degradandola, ha almeno due risvolti clinici. IlprimoèchelatrasfusionediPLTpuòrallentareilrecupero 269

6 GM Liumbruno et al TPO, by absorbing and degrading it, has at least two clinical consequences. The first is that platelet transfusions can slow down the recovery of megakaryocytes. The second is that the binding of TPO to circulating platelets can attenuate the response to endogenous TPO during myelosuppressive treatment. In fact, the first effect of cytotoxic treatment is not a drop in the PC, but rather reduced production of platelets by the megakaryocytes and their precursors, which are the first to be destroyed; given that the still circulating platelets bind and degrade the TPO, the plasma levels of the TPO increase only after several days, when the thrombocytopenia develops. This isthereasonwhytreatmentwithrecombinanttpo, ifstarted immediately after myelosuppressive therapy, canaccelerate haematopoietic recovery 17. Two molecules of recombinant TPO have been produced and studied in depth. rhutpo, produced in Chinese hamster ovary cells [Genentech (South San Francisco,CA,USA),Pharmacia&Upjohn(London,UK)], is a glycosylated molecule with an amino acid sequence identical to that of endogenous TPO but with a molecular weight of 90 kda, which is less than the 95 kda of the nativemolecule.peg-rhumgdf[amgen(thousandoaks, CA, USA), Kirin (Tokyo, Japan), Zymogenetics (Seattle, WA, USA)], on the other hand, is produced in strains of Escherichia coli; it is formed of the 163 amino acids of the amino-terminalpartofthenativetpomolecule(thereceptor site), to which a polyethyleneglycol fraction of 20 kda is conjugated, with the aim of increasing the molecule s halflife in the circulation and its potency, which is in fact 10 times greater than that of rhutpo 14, The clinical use of these molecules has produced effective responses in patients undergoing nonmyeloablative treatments, but disappointing results in myeloablative treatments, which reduces the potential market for these compounds and, therefore, the clinical interest in them. Other areas of potential use that have been identified are in the treatment of MDS, in thrombocytopenia due to liver failure or HIV infection, and in some sectors of transfusion medicine (mobilisation of stem cells, in vitro expansion of stem cells and productive plateletpheresis); finally, as a results of the anti-apoptotic effect of TPO, a potential radioprotective action has been notedinanimalmodels 14,40.On11 th September,1998Amgen withdrew pegylated TPO because it caused the development of IgG-type antibodies to PEG-rHuMGDF; since these antibodies were cross-reactive with endogenous TPO, they were able to neutralise this latter and, therefore, accentuate the thrombocytopenia because da parte dei megacariociti. In secondo luogo, il legame tra la TPO e le PLT circolanti può attenuare la risposta alla TPO endogena in corso di terapia mielosoppressiva. Infatti, il primo effetto della terapia citotossica non è un calo della CP, ma una ridotta produzione di PLT da parte dei megacariocitiedeiloroprecursori, chesonoiprimiadessere distrutti; dato che le PLT ancora circolanti legano e degradano la TPO, ne consegue che i livelli plasmatici della stessa si innalzano solo dopo diversi giorni, quando si instaura la piastrinopenia. Questa è la ragione per cui un trattamento con TPO ricombinante, se attuato subito dopo la terapia mielosoppressiva, può accelerare il recupero emopoietico 17. Le molecole di TPO ricombinante prodotte e studiate in modo più approfondito sono due. La rhutpo, prodotta in cellule di ovaio di criceto cinese [Genentech (South San Francisco,CA,USA),Pharmacia&Upjohn(Londra,UK)],è unamolecolaglicosilataconsequenzaaminoacidicaidentica aquelladellatpoendogenaeconpesomolecolareparia90 kda,inferioreai95kdadellamolecolanativa.ilpeg-rhumgdf [Amgen (Thousand Oaks, CA, USA), Kirin (Tokyo, Giappone), Zymogenetics (Seattle, WA, USA)] è prodotto invece in ceppi di Escherichia coli; esso è costituito dai 163 aminoacidi della porzione amino-terminale della molecola nativa di TPO (il sito recettoriale), ai quali è stata coniugata una frazione di polietilenglicole di 20 kda, allo scopo di aumentarnel'emivitaincircoloelapotenza, cheèinfatticirca 10voltesuperioreaquelladellarHuTPO 14, L'impiegoclinicodiquestemolecolehaevidenziatouna risposta efficace nei pazienti sottoposti a terapie nonmieloablative, maunadeludenteperformanceneitrattamenti mieloablativi, fattore questo determinante nella riduzione del potenziale mercato e, conseguentemente, dell'interesse clinico. Altre aree di potenziale utilizzo sono state identificate nella SMD e, nella piastrinopenia da insufficienza epatica o HIV-correlata, in alcuni settori della medicina trasfusionale (la mobilizzazione delle cellule staminali, l'espansione in vitro delle stesse o la piastrinoaferesi produttiva) e infine, a causa dell'effetto antiapoptotico della TPO, è stata segnalata, in modelli animali, la potenziale azione di radioprotezione 14,40. L'11 settembre 1998 la TPO pegilata fu ritirata dalla Amgen, perché causava l'insorgenza di anticorpi anti-pegrhumgdf di tipo IgG, che accentuavano la piastrinopenia perché cross-reattivi e in grado, quindi, di neutralizzare anche la TPO endogena, prodotta in quantità costante. La produzione di anticorpi da parte del PEG-rHuMGDF sembrerebbe essere imputabile più alla via di somministrazione sottocutanea (sc), che alla diversa 270

7 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments endogenous TPO is produced at a constant rate. The production of antibodies by PEG-rHuMGDF seems to be due more to the subcutaneous (sc) route of administration, than to its molecular conformation being different from that of rhutpo; since TPO is, in fact, also a potent mobiliser of dendritic cells, sc injection increases its immunogenicity 13,14,39.Antibodydevelopmenthasnotbeen described in patients treated with intravenously administered rhutpo, but a non-neutralising antibody was reported after sc administration 14. rhutpo continues to be developed as a therapeutic agent in China 19. The new pharmacological approaches Haematopoietic growth factors are glycoproteins with a molecular weight between 15 and 95 kda; their recombinant homologues have very high production costs, must be administered parenterally, and, furthermore, can cause the development of cross-reactive, neutralising antibodies. The creation of molecules differing from the endogenous growth factors, but able to bind to their specific receptors, is now a consolidated strategy for pharmaceutical companies 19. The process of developing TPO-mimetic agents is currently being pursued in three different sectors of research: a) peptide agonists; b) non-peptidyl agonists; c) antibodies against epitopes of rtpo. Peptide agonists The technique of phage display (PD), that is, the exposure of polypeptides on the surface of bacteriophages, enables the creation of a broad repertoire of ligands, from which the proteins with the desired characteristics can be selected. In this technique, nucleotide sequences coding for a library of mutant enzymes are inserted in frame with a gene coding for a phage coating protein, such that once the structure of the phage has been formed, the polypeptides coded for by the library are exposed on its surface. The subsequent selection of phagic particles that expose peptide ligands of specific receptors is based on affinity chromatography, in which the receptor is immobilised on a matrix or support. This technique has been found to be particularly suitable for identifying peptide ligands of various cytokines and receptors of growth factors. Kaushansky has recently published a review of this subject 43. The first rtpo agonists were synthesised in the second conformazione molecolare rispetto alla rhutpo; essendo, infatti, la TPO anche un potente mobilizzatore di cellule dendritiche, l'iniezione sc ne aumenterebbe l'immunogenicità 13,14,39.Losviluppodianticorpinonèstato invece descritto nei pazienti trattati con la rhutpo per via endovenosa, ma è stato segnalato un anticorpo non neutralizzante dopo somministrazione sc 14. La rhutpo continua ad essere sviluppata come agente terapeutico in Cina 19. I nuovi approcci farmacologici I fattori di crescita emopoietici sono glicoproteine con pesomolecolaretra15e95kda;iloroomologhiricombinanti hanno costi di produzione piuttosto elevati, devono essere somministrati per via parenterale e, inoltre, possono determinare l'insorgenza di anticorpi neutralizzanti crossreattivi. La creazione di molecole diverse dai fattori di crescitaendogeni, maingradodilegarsiairecettorispecifici, è ormai una strategia consolidata per le aziende farmaceutiche 19. Il processo di sviluppo degli agenti TPO-mimetici è attualmente orientato verso tre diversi settori di ricerca: a) gli agonisti peptidici; b) gli agonisti non-peptidici; c) gli anticorpi contro epitopi del rtpo. Gli agonisti peptidici La tecnica del phage display (PD), ossia l'esposizione di polipeptidi sulla superficie di batteriofagi, permette di creare ampi repertori di ligandi, dai quali si possono selezionare le proteine con le caratteristiche desiderate. Questa tecnica prevede che le sequenze nucleotidiche, codificanti per una libreria di enzimi mutanti, siano inserite in frame con un gene che codifica una proteina di rivestimento fagica, in modo che, una volta formatasi la struttura del fago, i polipeptidi codificati dalla libreria siano esposti sulla sua superficie. La successiva selezione delle particelle fagiche, che espongono peptidi ligandi di specifici recettori, si basa sulla cromatografia di affinità, nella quale il recettore sia stato immobilizzato su matrici o supporti. Questa tecnica si è rivelata di particolare efficacia per individuare ligandi peptidici di diverse citochine e recettori di fattori di crescita. Kaushansky ha recentemente pubblicato una Review sull'argomento 43. La sintesi dei primi agonisti del rtpo risale alla seconda metàdeglianni'90.cwirlaecollaboratori[affymaxresearch Institute(PaoloAlto, CA, USA), GlaxoWellcomeResearch 271

8 GM Liumbruno et al half of the 1990s. In 1997, Cwirla and colleagues[affymax ResearchInstitute(PaoloAlto, CA, USA), GlaxoWellcome Research Institute(Research Triangle Park, NC, USA)], by searching L-peptide libraries with the PD technique, chose 30 small peptides. These peptides had no sequence homology with endogenous TPO, but were not only able to bind in vitro to human and murine rtpo, expressed by cell lines, but also to activate the receptor by dimerisation. The peptides were grouped into two families on the basis of their amino acid sequence homology. One of the smallest peptides (14 amino acids), AF12505, was dimerised by covalent bonding to a lysine residue in order to increase its potency; the dimer (AF13948) thus obtained was 4,000 times more effective than the monomer at activating the celllinesexpressingrtpo, reachingthepotencyofrhutpo, despite being about one tenth of the size of this latter. Thus, on the basis of molecular weight,af13948 is ten times more potent than rhutpo. The greater potency of the dimer, compared to the monomer, adds further support to the role of dimerisation of rtpo in the mechanism of action of these peptides. Furthermore, AF13948 was able to stimulate invitro proliferationofbonemarrowprogenitor cells and maturation of megakaryocytes in humans as well as increase the PC in animal models 44,45. Almost at the same time Kimura et al. 46, in Japan (Hokuriku Seiaku Research and Development Division, Katsuyama, Fukui), isolated a family of peptides which was verysimilar, both intermsofstructureandabilitytoactivate rtpo, to one of the two families described by Cwirla and colleagues 44. Two years later, in 1999,AF13948 was modified by an amino acid substitution to produceaf15075, which was then conjugated with a 20 kda fraction of polyethyleneglycol, with the aim of reducing its in vivo immunogenicity, giving rise to the pegylated peptide GW GW was used in pre-clinical studies in animalmodels, producingfavourableresultsfromthepoints of view of both immunogenicity and its thrombopoietic effect, even if, for parity of dose, the haematological responsedifferedinthevariousanimalspecies 16, These peptides have not, however, passed the pre-clinical stage of testing. AMG531, thenewtpo-likeagentproducedbyamgen (OncologyDevelopment, ThousandOaks, CA, USA), arose from a combination between peptides and antibodies and is also known as apeptibody; this protein is, in fact, formed of a random sequence of peptides, which activate the rtpo, conjugated to a carrier domain formed of the Fc fragment of the immunoglobulins, which has the function of Institute, Research Triangle Park, NC, USA)] nel 1997, vagliando delle librerie di L-peptidi con la tecnica del PD, selezionarono 30 piccoli peptidi, senza alcuna omologia di sequenzaconlatpoendogena,ingradononsolodilegarsi in vitroal rtpo umano e murino, espresso su linee cellulari, maanchediattivarlomediantedimerizzazione.questipeptidi eranoraggruppabiliinduefamiglie, sullabasedell'omologia nella sequenza aminoacidica. Uno dei peptidi più piccoli (14aminoacidi),l'AF12505,fudimerizzato,mediantelegame covalente ad un residuo di lisina, allo scopo di aumentarne lapotenza; ildimero(af13948) cosìottenutoera4.000volte più potente, rispetto al monomero, nell'attivare le linee cellulari esprimenti i rtpo e raggiungeva la potenza della rhutpo, pur avendo dimensioni pari a circa 1/10 rispetto ad essa; l'af13948 dunque, sulla base del peso molecolare, si rivelava 10 volte più potente rispetto alla rhutpo. L'incremento di potenza del dimero, rispetto al monomero, suffragaulteriormenteilruolodelladimerizzazionedelrtpo nel meccanismo d'azione di questi peptidi. L'AF13948 era, inoltre, in grado di stimolare in vitro la proliferazione delle celluleprogenitricimidollarielamaturazionedimegacariociti umani, nonché di innalzare la conta delle PLT in modelli animali 44,45. QuasicontemporaneamenteKimuraetal. 46,inGiappone (Hokuriku Seiaku Research and Development Division, Katsuyama, Fukui), isolarono una famiglia di peptidi molto simili, sia per la struttura, che per la capacità di attivare il rtpo, ad una delle due famiglie descritte da Cwirla e collaboratori 44. A distanza di circa due anni, nel 1999, l'af13948 fu modificato, con una sostituzione aminoacidica, ottenendo l'af15075, il quale fu poi coniugato con una frazione di polietilenglicole di 20 kda, allo scopo di ridurne l'immunogenicità in vivo, dando luogo al peptide pegilato GW Il GW fu impiegato in studi pre-clinici su modelli animali, ottenendo risultati favorevoli sia sotto il profilo dell'immunogenicità, che per l'effetto trombopoietico, anche se la risposta ematologica differiva, a parità di dose, nelle varie specie animali 16, Questi peptidi non hanno comunque superato la fase di sperimentazione pre-clinica. L'AMG 531, il nuovo agente TPO mimetico prodotto dallaamgen (Oncology Development, Thousand Oaks, CA, USA), nasce invece dalla combinazione tra peptidi e anticorpi ed è anche conosciuto come peptibody; questa proteina è, infatti, costituita da una sequenza random di peptidi, che attivano il rtpo, coniugata ad un dominio carrier, costituitodalframmentofcdelleimmunoglobuline, che ha la funzione di aumentare l'emivita del farmaco in 272

9 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments prolonging the half-life of the drug in the circulation. The peptide sequence has no homology with endogenous TPO but nevertheless has, in common with this, the ability to bind to the rtpo, giving rise to potent stimulation of megakaryocytopoiesis in vitro. This translates in vivo, 3-5 days after parenteral administration (intravenous or sc), into a dose-dependent increase in the PC; the latency in the response is similar to that for other rtpo ligands and reflects the time necessary for megakaryocytes to complete cytoplasmic and nuclear maturation and to produce platelets. The tolerability, after parenteral administration to healthy volunteers in a phase I study, was found to be good. The different amino acid composition, compared to endogenous TPO, limits the problem of the development of antibodies against TPO In 2003 Bussel and colleagues presented the results of a phase I/II (dose-finding/safety) trial onamg 531. This study enrolled pre- and post-splenectomy adults with ITP andapc<30x10 9 /L,ifuntreated,or<50x10 9 /L,ifreceiving steroid therapy; the median PC was 11x10 9 /L. Six cohorts of four patients were treated with different doses ofamg 531(0.2,0.5,1,3,6and10µg/kg);thesubjectswereobserved for 15 days after the first dose and then a second dose was given on day 15 or day 22 unless the PC had not exceeded 50x10 9 /L. The patients were followed-up for 8 weeks after the last dose of AMG; no anti-amg 531 or anti-tpo antibodies were detected. The most frequently found side effect was a mild to moderate headache. With the dose of 3µg/kgeightof12patients(67%)reachedaPC>50x10 9 /L, which was at least double their baseline values, and five outoftheseeightresponders(63%)hadapc>150x10 9 /L 53. In 2004 Kuter et al. presented the results of a phase II trial in 21 patients with ITP, who had a median PC of 16x10 9 /Lprior to treatment withamg 531. The patients were treated with weekly doses of 1 µg/kg or 3µg/kg for 6 weeks and then followed-up for a further 6 weeks; the aim was to reach a PC between 50 and 450x10 9 /L. The median time to a response was 8 days; 7/8 patients (88%) treated with the lower dose reached the target PC, compared to 3/7 (38%) in the group treated with the higher dose; in this latter group the PC in another two patients exceeded the level of 450x10 9 /L. The treatment was interrupted early in three of the 21 patients: in two because of an excessive rise inthepcoverthelimitof450x10 9 /Landinone,inthegroup treated with placebo, because of intracranial haemorrhage. No changes were found in the monitored haematological parameters, coagulation tests or clinical chemistry. Headache, occurring in 29% of the patients, was confirmed to be the main side effect. circolo. La sequenza peptidica non ha alcuna omologia con la TPO endogena e ha, in comune con essa, la capacità di legarsi al rtpo, dando luogo ad una potente stimolazione della megacariocitopoiesi in vitro. Questo si traduce in vivo, dopo 3-5 giorni dalla somministrazione parenterale (endovenosa o sc), in un incremento dose-dipendente della CP; la latenza nella risposta è simile a quella di altri ligandi del rtpo e riflette il tempo necessario ai megacariociti per completare la maturazione citoplasmatica e nucleare e produrre le PLT; la tollerabilità, dopo somministrazione parenterale a volontari sani in uno studio di fase I, si è rivelata buona; la diversa composizione aminoacidica rispetto alla TPO endogena ha limitato il problema dell'insorgenza di anticorpi anti-tpo Nel 2003 Bussel e collaboratori hanno presentato un trial di fase I/II(dose-finding/safety) sull'amg 531. Questo studio riguardava adulti con PTI pre- e post-splenectomia concp<30x10 9 /L,senontrattati,o<50x10 9 /L,seinterapia steroidea; la CP mediana era pari a 11x10 9 /L; 6 coorti di 4 pazienti furono trattati con dosi diamg 531 differenziate (0,2;0,5;1;3;6e10µg/kg);dopolaprimasomministrazione, seguì un'osservazione di 15 giorni e un'ulteriore dose, al 15 o 22 giorno, a meno che la CP non avesse superato 50x10 9 /L.Ipazientisonorimastiinfollow-upper8settimane dopol'ultimasomministrazionediamg; nonèstatarilevata l'insorgenzadianticorpianti-amg531oanti-tpo; l'effetto collateralepiùfrequentementeriscontratoèstataunacefalea da lieve a moderata. Con la dose di 3 µg/kg 8/12 pazienti (67%) hanno raggiunto una CP >50x10 9 /L, e comunque raddoppiata rispetto ai valori di base, e 5/8 dei responder (63%)unaCP>150x10 9 /L 53. Nel 2004 Kuter et al. hanno presentato un trial di fase II in 21 pazienti con PTI, con CP mediana, prima del trattamentoconamg531,paria16x10 9 /L;ipazientifurono trattati con dosi settimanali di 1 µg/kg o 3 µg/kg per 6 settimane e poi seguiti per ulteriori 6 settimane; l'obiettivo eraquellodiraggiungereunacptra50e450x10 9 /L;iltempo mediano di risposta fu di 8 giorni; 7/8 pazienti(88%) trattati con il dosaggio inferiore raggiunsero la CP target, rispetto a 3/7 (38%) nel gruppo trattato con dosaggio superiore; in quest'ultimo gruppo addirittura altri 2 pazienti superarono il limite di 450x10 9 /L. Il trattamento fu interrotto precocemente in 3 pazienti su 21: in 2 per eccessivo rialzo dellacpoltreillimitedi450x10 9 /Leinuno,appartenenteal gruppo trattato con placebo, per emorragia intracranica. Nonfuronoriscontratealterazionideiparametriematologici e dei test di coagulazione o di chimica clinica monitorati; la cefalea, riscontrata nel 29% dei pazienti, si confermava l'effetto collaterale principale e, anche in questo studio, 273

10 GM Liumbruno et al In this study, too, no development of anti-amg 531 or anti-tpo antibodies was detected 54. Contemporaneously, Newland et al. presented another phase I study in which fourcohortsoffourpatientswithitp(withapc<30x10 9 /L, ifuntreated,or<50x10 9 /L,ifreceivingsteroidtherapy)were treated with two single doses of 30, 100, 300 or 500 µg AMG531,repeatedafter15days,or22,ifthePConday15 was >50x10 9 /L; the patients were followed-up for 8 weeks after the last dose. The aim was to double the baseline PC and to reach a PC between 50 and 450x10 9 /L.This study, which confirmed the previous findings of tolerability and lack of immunogenicity ofamg 531, suggested dosing the drug according to the weight of the patient and identified the dose of >1µg/kg as the most appropriate for increasing the PC in patients with ITP 55. More information on the side effects of long-term treatment are beginning to emerge, albeit in abstract form, presented at theamerican Society of Hematology Congress in December 2005 and at the IX European Symposium on Platelet and Granulocyte Immunobiology, heldinjune2006.amg531, afterabout3 years of trials and almost 200 patients treated with favourable outcomes, has shown good efficacy in patients with ITP, in whom it has produced stable responses lasting more than 48 weeks; indeed, there are now patients who have been receiving long-term weekly sc maintenance therapy for about 2 years. In the context of a generally good tolerability and safety profile, the most frequently reported side effects are bone pain and headache in a flulike syndrome, worsening thrombocytopenia in three cases, a rise in lactate dehydrogenase level in one case and a few cases of myelofibrosis, reversible 3 months after interrupting treatment, in patients treated long-term. The formation of reticulin has been attributed to the production of cytokines by the megakaryocytes accumulated in the bone marrow. No cases of antibody formation have been reported Following the favourable results of the first trials in patients with ITP, interest has also been given to thrombocytopeniarelatedtolymphomas, solidtumoursand MDS.At present there are 11 trials involvingamg 531 listed in one of the main public international registries, which covers the role of a worldwide archive of clinical trials, that is, the registry of the "National Institutes of Health" in the USA.Two trials in ITPstarted in 2005 have been completed: one was a phase I/II study, the other a phase II study. Enrolment in three phase III trials in ITP, begun in 2005, has been closed; one is an extension study on patients already enrolled in previous trials, the second involves patients refractory to splenectomy, while the third non fu rilevata l'insorgenza di anticorpi anti-amg 531 o anti-tpo 54. Contemporaneamente Newland et al. presentarono un altro studio di fase I nel quale 4 coorti di 4 pazienti con PTI (concp<30x10 9 /L,senontrattati,o<50x10 9 /L,seinterapia steroidea) venivano trattate con 2 singole dosi di AMG 531, paria30, 100, 300o500µg, daripetersidopo15giorni, oppure22,selacpal15 giornoera>50x10 9 /L;dopol'ultima somministrazione seguiva un follow-up di 8 settimane. L'obiettivo era quello di raddoppiare la CP di base e raggiungerevaloridiplttra50e450x10 9 /L.Questostudio confermava quanto già evidenziato in tema di tollerabilità e immunogenicità, suggeriva di dosare il farmaco in base al peso e individuava nella posologia >1µg/kg la più idonea ad aumentare le PLT nei pazienti con PTI 55. Maggiori informazioni sugli effetti collaterali del trattamento a lungo termine cominciano a intravedersi in lavori, anche se sotto forma di Abstracts, presentati al Congresso del dicembre 2005dell'AmericanSocietyofHematologyealIXSimposio Europeo sull'immunobiologia Piastrinica e Leucocitaria, tenutosi nel giugno L'AMG 531, dopo circa tre anni di trials e quasi 200 pazienti trattati con esito favorevole, ha mostrato una buona efficacia nei pazienti con PTI, nei quali ha prodotto una risposta stabile nel tempo per oltre 48 settimane; ci sono attualmente pazienti in terapia di mantenimento settimanale sc a lungo termine da circa 2 anni. Tra gli effetti indesiderati segnalati, pur nell'ambito di una buona tollerabilità e sicurezza, i più frequenti sono dolori ossei e cefalea tipo flu-like syndrome, aggravamento della piastrinopenia in 3 casi, innalzamento dell'ldh in un caso e pochi casi di mielofibrosi reversibile, dopo 3 mesi dall'interruzione della terapia, in pazienti trattati a lungo termine. La formazione di reticolina è stata imputata alla produzione di citochine da parte dei megacariociti accumulatisi a livello midollare; non sono stati segnalati casi di insorgenza di anticorpi Dopo i risultati favorevoli, registrati nei primi trials su pazienti con PTI, l'interesse si è spostato anche verso la piastrinopenia correlata a linfomi, tumori solidi e SMD. Attualmente, l'elenco dei trials sull'amg 531, reperibile in unodeiprincipaliregistriinternazionalipubblici, chericopre il ruolo di archivio globale delle sperimentazioni cliniche, cioè il registro dell'nih(national Institutes of Health) degli USA, comprende 11 trials. Sono stati completati 2 trials iniziati nel 2005 nella PTI, dei quali uno di fase I/II e uno di fase II. Hanno chiuso l'arruolamento tre trials di fase III nella PTI, iniziati nel 2005: uno riguardava uno studio di prolungamento su pazienti già arruolati in precedentitrials, il secondo riguardava pazienti refrattari alla splenectomia, 274

11 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments is being conducted on patients who have not yet been splenectomised. Six trials are still recruiting patients: a) one phase I/II trial on patients treated with carboplatin for (advanced stage) cancer of the gastrointestinal tract, genito-urinary apparatus, gynaecological system or head and neck: this trial began inaugust 2005 and aims to enrol 18 patients; b) one phase I/II trial in patients with non- Hodgkin s lymphoma, started in March 2006, which aims to enrol 36 patients; c) four phase II trials: one on Japanese patients with ITP, started in February 2006 and intended to enrol 16 patients; one on patients with relapsed aggressive lymphoma started in January 2006; one on patients with low- to moderate-risk MDS, started in January 2006 and aiming to enrol 55 patients; and, finally, one on patients with MDS treated with hypomethylating drugs, started in August The latest peptide agonist to appear on the scene is a pegylated molecule produced by Johnson & Johnson (Pharmaceutical Research and Development, Beerse, Belgium). Cerneus and colleagues recently presented the results of a phase I study conducted in 40 healthy volunteers who were randomised to receive a single dose of the drug as an intravenous bolus; the doses investigated were 0.375, 0.75, 1.5, 2.25 and 3µg/kg; the increase in PC peaked days after the injection, then returned to baseline values after 3-4 weeks. The mean values of the peak PC ranged from 315x10 9 /L, with the lowest dose, to 685x10 9 /L, with the highest dose. The only side effects seen were headache and fatigue. There were no reports of the development of specific antibodies 61. Non-peptidyl agonists The non-peptidyl agonists of rtpo are small organic molecules which, compared to the peptide agonists, have the advantages of oral bioavailability and of being highly unlikely to cause immunogenicity 62. The screening strategies for these molecules are based on functional tests on cell lines that express the functioning receptor; the compounds found to be active on the receptor are then evaluated with in vitro and in vivo biological tests. The main difference with respect to the PD technique which identifies peptides that bind to the receptor, but that may not have the desired biological activity is that the molecules identified with the functional tests, besides being ligands for the specific receptor, have the desired biological activity, that is, the ability to activate the receptor 43.About 1 year after the synthesis of the two families of peptide agonists of rtpo by Cwirla et al. 44, it was again Kimura mentre il terzo è stato condotto su pazienti non ancora splenectomizzati. Sei trials stanno ancora arruolando pazienti: a) 1 trial di fase I/II su pazienti trattati con carboplatino per neoplasie (in stadio avanzato) gastrointestinali, genito-urinarie, ginecologiche o della testa e del collo: questo trial è iniziato nell'agosto 2005 e prevede di arruolare 18 pazienti; b) un trial di fase I/II in pazienti con linfoma non-hodgkin, iniziato nel marzo 2006 e che prevede di arruolare 36 pazienti; c) quattro trials di fase II: 1 su pazienti giapponesi con PTI, iniziato nel febbraio del 2006 e che prevede di arruolare 16 pazienti; 1 su pazienti con linfoma aggressivo recidivante, iniziato nel gennaio 2006;1supazientiaffettidaSMDarischiobasso-intermedio, iniziato nel gennaio 2006 e che prevede di arruolare 55 pazienti; 1 su pazienti affetti da quest'ultima patologia e trattaticonfarmaciipometilanti,iniziatonell'agosto L'ultimo agonista peptidico apparso sulla scena è una molecola pegilata prodotta dalla Johnson & Johnson (Pharmaceutical Research and Development, Beerse, Belgio). Cerneus e collaboratori hanno recentemente presentato i risultati di uno studio di fase I su 40 volontari sani randomizzati a ricevere una singola dose in bolo endovenoso; i dosaggi esplorati erano 0,375; 0,75; 1,5; 2,25 e3µg/kg; ilpiccodiinnalzamentodellacpvenivaraggiunto dopo10-12giorni,perpoiritornareaivaloridibasedopo3-4 settimane. I valori medi del picco piastrinico variavano da 315x10 9 /L, con la dose inferiore, a 685x10 9 /L, con la dose superiore. Gli effetti collaterali riscontrati erano solo cefalea e fatigue; non è stata segnalata l'insorgenza di anticorpi specifici 61. Gli agonisti non-peptidici Gli agonisti non-peptidici del rtpo sono piccole molecole organiche che, rispetto a quelli peptidici, hanno il vantaggio della biodisponibilità orale e dell'improbabile immunogenicità 62. Le strategie di screening di queste molecole sono basate su test funzionali su linee cellulari che esprimono il recettore funzionante; i composti identificati come attivi sul recettore vengono successivamente valutati con test biologici in vitro e in vivo. La differenza principale rispetto alla tecnica del PD - che permette di identificare peptidi che, pur legandosi al recettore, possono non avere l'attività biologica desiderata - è che le molecole identificate con i test funzionali, oltre ad essere ligandi dello specifico recettore, hanno l'attività biologica ricercata, cioè la capacità di attivarlo 43. Dopo circa un anno dalla sintesi, da parte di Cwirlaetal,delle2famigliediagonistipeptidicidelrTPO 44, 275

12 GM Liumbruno et al and colleagues in Japan who demonstrated in vitro on cell lines that two non-peptidyl molecules derived from benzodiazepineswereabletocompetewithtpoforbinding to the rtpo and that one of these stimulated, in vitro, the proliferation of a human leukemic cell line which expresses rtpoandis,therefore,sensitivetohumantpo(ut-7/tpo). This demonstrated for the first time that also non-peptidyl compounds that bind to rtpo can act as TPO-mimetics 63. In2001,Duffyetal.(GlaxoSmithKline,Collegeville,PA, USA) demonstrated that non-peptidyl molecules with a molecular weight below 500 Da, derived from hydrazinonaphthalene and azonaphthalene, acted as TPO-mimetics on cell lines in vitro 64. The following year, the same researchers identified the pharmacophores, that is, the critical regions responsible for the pharmacological action of some non-peptidyl molecules with TPO-like activity, derived from thiosemicarbazone and from naphthimidazole 65,66. These molecules have not, however, been shown to be able to produce platelets in in vivo animal models and have not yet overcome the pre-clinical phase of development, despite intense research, also focused on identifying the relationship between the molecular structure and biological activity. Recently, the three elements essential for a pharmacophore with potent TPO antagonist activity were identified in a series of small molecules, derived from benzimidazole, which are active in vitro on TPO-sensitive cell lines. These three elements are a lipophilic domain and an acidic moiety on the opposite end of the molecule, separated by a heteroatom metal chelate in the central portion 67. Inagaki and colleagues 68 were the first, in July 2004, to describe a non-peptidyl molecule with in vivo TPO-like activity in animal models. This molecule, synthesised in Japan by the "Japan Tobacco Inc. Central Pharmaceutical ResearchInstitute" inosaka, wasnamedjtz-132andfrom a chemical point of view is an (S)-7-hydroxyimino-3-(3- methyl-[1, 2, 4]oxadiazol-5-yl)-5-propyl-4, 5, 6, 7- tetrahydrobenzo[c]thiophene-1-sulphonamide. This rtpo agonist was identified by screening, in cell proliferation tests, a library of over 100,000 chemical compounds; the UT-7/TPO cell line was used for this purpose. JTZ-132 was shown to be able to stimulate, in vitro, the growth and differentiation of both murine and human megakaryocytic progenitor cells; furthermore, after sc administration, it was abletostimulatemegakaryocytopoiesisandthrombopoiesis in vivo, in two different murine models in which myelosuppression was induced by X-ray irradiation or by bulsulphan treatment. It was also demonstrated that JTZ- ancora Kimura e collaboratori, in Giappone, hanno dimostrato, su linee cellulari in vitro, che due molecole non-peptidiche, derivate dalle benzodiazepine, sono in grado di competere con la TPO per il legame con il rtpo e che una di queste stimolava, in vitro, la proliferazione di una linea cellulare di leucemia umana, che esprime il rtpo edèpertantosensibileallatpo umana(ut-7/tpo): questo testimoniava, per la prima volta, che anche un composto non-peptidico, legandosi al rtpo, poteva fungere da TPO-mimetico 63. Nel 2001 Duffy et al. (GlaxoSmithKline, Collegeville, PA, USA) hanno dimostrato che molecole non-peptidiche di peso molecolare inferiore a 500 Da, derivate dall'idrazinonaftalene e dall'azonaftalene, agivano da TPOmimetici su linee cellulari in vitro 64. L'anno successivo gli stessiautori hanno identificato i farmacofori, cioè le regioni critiche responsabili dell'azione farmacologica, di alcune molecole non-peptidiche con attività TPO-mimetica, derivate del tiosemicarbazone e del naftimidazolo 65,66. Queste molecole non hanno però dimostrato di essere in grado di produrre PLT in modelli animali in vivo e, a tutt'oggi, non hanno ancora superato la fase di sviluppo pre-clinico, nonostante l'intensa ricerca sviluppatasi, anche per identificare il rapporto tra struttura molecolare e attività biologica. Recentemente, in una serie di piccole molecole derivate del benzimidazolo, attive in vitro su linee cellulari TPO sensibili, sono stati identificati i tre elementi essenziali per un farmacoforo con potente attività TPO-agonista: un dominio lipofilo e una frazione acida dalla parte opposta della molecola, separati da un eteroatomo metallo-chelato nella parte centrale 67. Inagaki e colleghi 68 sono stati i primi, nel luglio 2004, a descrivere una molecola non-peptidica con attività TPO-mimetica, invivo,sumodellianimali.questamolecola è stata sintetizzata in Giappone dal "Japan Tobacco Inc. Central Pharmaceutical Research Institute" di Osaka, è stata denominata JTZ-132 e, dal punto di vista chimico, è un (S)-7-idrossimino-3-(3-metil-[1, 2, 4]ossadiazolo-5-yl)-5- propil-4, 5, 6, 7-tetraidrobenzo[c]tiofene-1-sulfonamide. Questo agonista del rtpo è stato identificato selezionando, intestdiproliferazionecellulari, unalibreriadioltre composti chimici; a questo scopo è stata utilizzata la linea cellulare UT-7/TPO. Lo JTZ-132 si è rivelato in grado di stimolare, in vitro, la crescita e la differenziazione di cellule progenitricimegacariocitarieditopoeumane; inoltreèstato in grado di stimolare, dopo somministrazione sc, la megacariocitopoiesi e la trombopoiesi in vivo, in 2 diversi modelli animali di topi, nei quali veniva indotta una mielosoppressioneconirradiazionemedianteraggi-x, ocon 276

13 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments 132 activates rtpo in the same way as endogenous TPO does, that is, through phosphorylation of the receptor, which subsequently triggers the complex cascade of intracellularsignals. Inthese in vivoexperimentsanincrease inredcellswasalsoseen,presumablyduetothesupportive role that TPO plays in erythropoiesis and, therefore, reflecting the TPO-like activity of the molecule 68. Inthemeantime,Erickson-Milleretal.(GlaxoSmithKline) had described SB , a derivative of hydrazine with a molecular weight of Da, identified from among cell lines sensitive to TPO (UT-7/TPO and BAF-3/TPO). In vitro, this molecule behaves as an agonist of the rtpo, stimulating megakaryocytopoiesis and platelet production but, unlike JTZ-132, it is specific for platelets from human andchimpanzees 62. The same species specificity was subsequently found in another compound with a molecular weight of 442 Da, SB ; this molecule, like the others, was obtained bysearchingalibraryof260,000smallmoleculeswithatposensitivecellline(baf-3/tpo).inthiswayaclassoftpomimetic molecules was identified: the diazonaphthalene sulphonic acids. These were subsequently chemically modified giving rise to a series of biphenyl carboxylated compounds with excellent pharmacokinetic properties and, aboveall,oralbioavailability. SB (eltrombopag)was thenselectedfromover200analoguestobeusedinclinical studies, because of its excellent results in cell proliferation tests with the BAF-3/TPO and UT-7/TPO cell lines, and its markedcapacitytostimulatemegakaryocytedifferentiation in cultures of human bone marrow cells Furthermore, SB , unlike rhutpo, does not cause activation of platelets 73. Jenkins et al. used eltrombopag in a phase I trial on 72 healthy male volunteers in the United Kingdom. The drug, in oral capsules, was administered once on the firstdayandthen(afteraweekofwashout) dailyfor10 days; various doses were used: 5, 10, 20, 30, 50, and 75 mg/die. Eltrombopag was well tolerated and the most frequently reported side effect was mild to moderate headache. Doses from 30 mg/die upwards for 10 days caused a dosedependent increase in the PC; the maximum peak increase in platelet numbers occurred between day 14 and day 16, and, followingthedoseof75mg/die, itsmeanvaluereached 357x10 9 /L, with the mean increase being 118x10 9 /L. The safety, pharmacokinetics and pharmacodynamic properties of the drug would allow research on its use to be extended to productive plateletpheresis 58,74,75. Eltrombopag is currently the object of five different international, multicentre trials for which enrolment is still underway. In February 2005 a phase II trial intending to trattamento con busulfano. Gli Autori hanno anche dimostrato che lo JTZ-132 attiva il rtpo in modo analogo alla TPO endogena, mediante la fosforilazione del recettore, che successivamente innesca la complessa cascata di segnali intracellulari. In questi esperimenti in vivo è stato rilevato anche un aumento dei globuli rossi, riferibile al ruolo di supporto che la TPO esprime nei confronti dell'eritropoiesi, e che riflette, dunque, l'attività TPO-mimetica della molecola 68. NelfrattempoErickson-Milleretal.(GlaxoSmithKline), avevano descritto l'sb , un derivato dell'idrazina del peso molecolare di 424,5 Da, identificato vagliando linee cellularisensibiliallatpo(ut-7/tpoebaf-3/tpo).questa molecola si comporta in vitro come agonista del rtpo, stimolando megacariocitopoiesi e piastrinopoiesi, ma, a differenzadellojtz-132, haunaspecificitàdispecielimitata allepltumaneediscimpanzé 62. La medesima specificità di specie è stata successivamente riscontrata anche in un altro composto delpesomolecolaredi442da,l'sb ;questamolecola, analogamente alle altre, è stata ottenuta selezionando una libreria di piccole molecole con una linea cellulare TPO sensibile (BAF-3/TPO). In questo modo è stata inizialmente identificata una classe di molecole TPOmimetiche:gliacididiazonaftalensulfonici.Questiultimisono stati successivamente modificati chimicamente, originando una serie di composti bifenil carbossilati, con parametri farmacocineticiottimalie, soprattutto, biodisponibilitàorale. L'SB (eltrombopag), è stato quindi selezionato, tra oltre 200 analoghi, per essere sottoposto a studi clinici, grazie alla sua ottimale risposta nei test di proliferazione cellulare, conlelineebaf-3/tpoeut-7/tpo, eall'elevata capacità di stimolare la differenziazione dei megacariociti, incolturedicellulemidollariumane L'SB inoltre, a differenza della rhtpo, non determina attivazione delle PLT 73. Jenkins et al. hanno utilizzato l'eltrombopag in un trial di fase I su 72 volontari maschi sani nel Regno Unito. Il farmaco, in capsule orali, è stato somministrato una volta il primo giorno e poi (dopo una settimana di washout) quotidianamente per 10 giorni; sono stati impiegati vari dosaggi: 5, 10, 20, 30, 50, 75 mg/die.l'eltrombopagèstato ben tollerato e l'effetto collaterale più frequentemente descritto è stato una cefalea lieve-moderata. Le dosi da 30 mg/die in su per 10 giorni determinavano un aumento dosedipendente della CP; il picco massimo di aumento delle PLTsi verificava tra il 14 e 16 giorno e si attestava, per il dosaggiodi75mg/die,suvalorimedidi357x10 9 /L,conun incrementomedioparia118x10 9 /L.Lasicurezzadelfarmaco, la farmacocinetica e la farmacodinamica potrebbero fare 277

14 GM Liumbruno et al enrol 422 patients with thrombocytopenia and HCV-related hepatitis was started; another phase II trial, opened inapril 2005 for patients with advanced stage solid tumours treated withthree-weeklycyclesofcarboplatinandplaclitaxel, plans to recruit 164 patients.also inapril 2005 a phase II/III trial, on patients with refractory ITP, was started: 99 patients should be enrolled in this study. One year after this study, recruitment started for an observational phase I study on the tolerability and safety of an oral dose of 50 mg/die in healthy volunteers and in patients with mild, moderate and severe liver failure. This study aims to enrol 32 volunteers. Finally, in June 2006, the EXTEND study (Eltrombopag extended Dosingstudy) was started: this is a continuation study aimed at enrolling 200 patients with ITP already recruited in previous trials on eltrombopag 60. A phase II multicentre trial on SB is currently underway in Italy in which doses of 50, 75 and 100 mg are being administered to cancer patients treated with multiple cycles of chemotherapy. Meanwhile, another multicentre phase II study, using the same drug administered to patients with ITP, at doses of 30, 50 and 75 mg once daily for 6 weeks, is currently awaiting approval 76. In 2004, Kalota and colleagues (GlaxoSmithKline) presented another molecule, derived from hydrazone, with in vitro TPO-mimetic activity: SB The pre-clinical data on this small molecule have provided the rationale for evaluating it, and its related analogues, in clinical studies 77. In fact, in June 2005, GlaxoSmithKline and its partner company, Ligand Pharmaceuticals(San Diego, CA, USA), announced the start of clinical development for SB , which is currently being used in phase I trials 19,78. Research carried out in Japan in the last two years has produced three other non-peptidyl agonists of rtpo, which are still in the phase of pre-clinical development. Suzuki et al. (Drug Discovery Research, Astellas PharmaInc.Tsukuba, Ibraki) havedescribedym477, anew molecule which is active when administered orally and, as evaluated in in vivo animal models, is species-specific for humans and chimpanzees 79. Nakamura and colleagues (Biological Research Laboratories, Nissan Chemical Industries, Saitama), who had previously synthesised SB by screening a library of about 50,000 molecules on TPO-sensitive cell lines, synthesised NIP-004, or the molecule of 5-[(2-{1-[5- (3,4-dichlorophenyl)-4 hydroxy-3- thienyl]ethylidene}hydrazino)carbonyl]-2- thiophenecarboxylic acid. Thiscompoundhasamolecularweightof455Daanda strong specificity for the human species. NIP-004 has estendere la ricerca anche al settore della piastrinoaferesi produttiva 58,74,75. L'eltrombopag è attualmente oggetto di cinque diverse sperimentazioni multicentriche internazionali, per i quali è ancora in corso l'arruolamento. Nel febbraio 2005 è iniziato un trial di fase II, che si propone di arruolare 422 pazienti con piastrinopenia e epatite HCV-correlata; un altrotrial di fase II, iniziato nell'aprile 2005 e rivolto a pazienti con neoplasie solide in fase avanzata, trattati con cicli trisettimanali di carboplatino e placlitaxel, mira a reclutare 164 pazienti. Nell'aprile 2005 è stato, inoltre, intrapreso un trial di fase II/III, su pazienti con PTI refrattaria, con l'obiettivo di arruolare 99 pazienti.adistanza di un anno da quest'ultimo studio, è iniziato il reclutamento per una sperimentazione osservazionale di fase I, su tollerabilità e sicurezza della dose orale di 50 mg/die, in volontari sani e pazienti con insufficienza epatica lieve, moderata o grave. Questo studio ha l'obiettivo di arruolare 32 volontari. Infine, nel giugno 2006, è stato dato inizio allo studio EXTEND (Eltrombopag extended Dosing study): si tratta di uno studio di proseguimento che mira ad arruolare 200 pazienti conptigiàreclutatiperprecedentitrials sueltrombopag 60. Attualmente, in Italia, è in corso un trial multicentrico difaseiisull'sb , somministratoalladosedi50, 75e 100 mg a pazienti oncologici, trattati con cicli multipli di chemioterapia; è invece in attesa di approvazione un altro studio multicentrico di fase II sul medesimo farmaco, somministratoapazienticonpti,alledosidi30,50e75mg una volta al giorno per 6 settimane 76. Kalotaecollaboratori(GlaxoSmithKline)nel2004hanno presentato un'altra molecola, derivata dall'idrazone, con attivitàtpo-mimeticainvitro: l'sb Idatipre-clinici di questa piccola molecola hanno fornito il razionale per la valutazione della stessa, o di suoi analoghi consimili, in studiclinici 77.Infatti,nelgiugno2005,laGlaxoSmithKlinee la sua azienda partner, la Ligand Pharmaceuticals (San Diego, CA, USA), hanno annunciato l'avvio dello sviluppo clinicoperl'sb , cheattualmenteèutilizzatointrials di fase I 19,78. Dalla ricerca condotta nell'ultimo biennio in Giappone provengono altri 3 agonisti non-peptidici del rtpo, i quali sono ancora nella fase di sviluppo pre-clinico. Suzuki et al. (Drug Discovery Research, Astellas Pharma Inc.Tsukuba, Ibraki) hanno descritto l'ym477, una nuova molecola attiva per via orale, dotata di specificità di specie per l'uomo e lo scimpanzé, valutatain vivoin modelli animali 79. Nakamuraecolleghi(BiologicalResearchLaboratories, Nissan Chemical Industries, Saitama), che avevano 278

15 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments shown TPO-agonist activity in vitro and in vivo after sc administration, in mice subjected to xenotransplantation and, therefore, able to produce human platelets Finally, using proliferation tests on the UT-7/TPO cell line, Sakai and the same Nakamura and their colleagues selected strains of a marine fungus, Basipetospora sp.; in this way they identified four molecules, derived from xanthocillin X, which showed agonist activity for rtpo in the in vitro studies conducted, 83. Antibodies Oneoftheapproachesaimedatovercomingtheproblem of the immunogenicity of recombinant TPO is that of producing agonist antibodies, which dimerise the receptor and cause signal transduction at the level of the target cell 84,85.In1998Dengetal.producedamurinemonoclonal antibody, named BAH-1, against the rtpo of human megakaryoctes, which expressed its agonistic activity by stimulating megakaryocytopoiesis in vitro. This bivalent antibody dimerised the rtpo without, however, binding to the same site as TPO. Its in vivo stimulation of megakaryocytopoiesis in animal models was, however, limited, perhaps because of species specificity 86. In 2003 Su and colleagues (Alexion Pharmaceuticals Inc., Cheshire, CT, USA) developedanewclassofmodified antibodies, which contain a TPO-like peptide inserted into the variable region. In vitro, these antibodies bound to rtpo and stimulated the proliferation and differentiation of megakaryocytes. In vivo, they were able to accelerate recovery of the PC in animal models of chemotherapyinduced thrombocytopenia. The lack of structural homology between the peptide introduced into the antibody and the TPO should reduce the risk of immunogenicity and cross-reactivity with endogenous TPO 87.Thisantibodyis,however,stillinapreclinicalstage of development 88. Orita and colleagues (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd., Fuji-Gotemba Research Laboratory, Shizuoka, Japan) have introduced the so-called minibody (MB) agonists of rtpo, producing these starting from an IgG type antibody to rtpo 89. MB are dimeric antibody fragments, with dimensions similar to those of the Fab fragment of IgG, which should dimerise the rtpo more efficiently than the whole IgG, precisely because of the removal of the possible steric hindrance between the Fc portion of the IgG and the receptor; they are produced by genetic engineering and formedofthevariable regions oftheheavychain(vh)and the light chain (VL) of IgG. MB are divided into diabodies, precedentementesintetizzatoanchel'sb , vagliando una libreria di circa molecole su linee cellulari TPO sensibili, hanno sintetizzato il NIP-004, ovvero la molecola dell'acido 5-[(2-{1-[5-(3,4-diclorofenil)-4 idrossi-3- tienil]etilidene}idrazino)carbonil]-2- tiofenecarbossilico. Questo composto ha un peso molecolare di 455 Da e una stretta specificità per la specie umana. Il NIP-004 ha rivelato attività TPO-agonista, in vitro e in vivo, dopo somministrazione sc, in modelli animali, costituiti da topi sottoposti a xenotrapianto e, pertanto, in grado di produrre PLTumane Sakai e lo stesso Nakamura e i loro collaboratori, infine, hanno selezionato, con test di proliferazione sulla linea cellulare UT-7/TPO, dei ceppi di un fungo marino, la Basipetospora sp.; in questo modo hanno identificato 4 molecole, derivate dalla xantocillina X, che, negli studi in vitrocondotti,hannomostratoattivitàagonistaperilrtpo 83. Gli anticorpi Uno degli approcci volti a superare il problema dell'immunogenicità della TPO ricombinante è stato quello diprodurreanticorpiagonisti, iqualidimerizzanoilrecettore e determinano la trasduzione del segnale a livello delle cellule bersaglio 84,85. Nel 1998 Deng et al. hanno prodotto un anticorpo monoclonale murino, denominato BAH-1, rivolto contro il rtpo delle cellule megacariocitarie umane, che esprimeva la sua attività agonista stimolando la megacariocitopoiesi in vitro. Questo anticorpo bivalente dimerizzava il rtpo senza però legarsi allo stesso sito della TPO. La sua attività di stimolo della megacariocitopoiesi in modelli animali in vivo era però limitata, forse dalla specificità di specie 86. Nel 2003 Su e collaboratori (Alexion Pharmaceuticals Inc., Cheshire, CT, USA) hanno sviluppato una nuova classe di anticorpi modificati, che contenevano un peptide TPO-mimetico inserito nel contesto della regione variabile. In vitro, questi anticorpi si legavano al rtpo e stimolavano la proliferazione e la differenziazione dei megacariociti. In vivo, erano in grado di accelerare il recupero della CP in modelli animali di piastrinopenia da chemioterapia. La mancanza di omologia strutturale, tra il peptide inserito nell'anticorpo e la TPO, dovrebbe ridurre, inoltre, il rischio di immunogenicità e cross-reattività con la TPO endogena 87.Atutt'oggiperòquestoanticorpoèancora nella fase di sviluppo preclinico 88. Orita e colleghi (Chugai Pharmaceutical Co. Ltd., Fuji- GotembaResearchLaboratory, Shizuoka, Giappone) hanno introdotto i cosiddetti minibody (MB) agonisti del rtpo, 279

16 GM Liumbruno et al if the bond between the antibody fragments is not covalent, and single chain variable region fragment antibodies [sc(fv)2], if the fragments are bound covalently 90. In vitro, these MB, both the diabodies and the sc(fv)2, have shown an agonistic activity very similar to that of TPO in tests of proliferation and differentiation on human and monkey cells,. Furthermore, in the in vivo evaluation on an animal model, one of these MB, VB22B sc(fv)2, significantly increased the PC, without causing the development of antibodies against endogenous TPO.Another MB, TA136 sc(fv)2, has shown agonist activity, in vitro, for two types of mutant rtpo, derived from patients with congenital amegakaryocytic thrombocytopenia. This finding, besides demonstrating that the binding site of antibodies to the rtpo does not necessarily have to be same as that for endogenous TPO, could suggest that there is a therapeutic strategy for patients with disorders caused by dysfunctional receptors 89. Itistobehopedthat,inthenearfuture,itwillbepossible to demonstrate the therapeutic efficacy of these antibodies in clinical studies. Table I reports the new rtpo agonists and their current stage of clinical development. Conclusions After the disappointing clinical debut of recombinant TPO, more than 10 years after its cloning, the discovery of peptide and non-peptidyl agonists of rtpo and the production of modified and unmodified agonist antibodies seem to be giving a new impulse and fresh hopes for the pharmacological treatment of thrombocytopenia. These new therapies appear to be free of the problem of immunogenicity, which was one of the major reasons for abandoning the development of recombinant TPO. The goal of clinical use seems to be approaching for drugs such asamg 531 and eltrombopag, which have now reached phase III trials. Furthermore, the use of these drugs might be extended beyond ITP to the treatment of thrombocytopenia secondary to chemotherapy for solid tumours, MDS and liver failure. Wider clinical experimentation on these two molecules will also provide further information on their potential adverse effects. The discovery of these new drugs has undoubtedly contributed to improving the understanding of the biological and molecular mechanisms underlying thrombopoiesis; the identification of new agonists, with different chemical structures, is a process that, thanks to producendoli a partire da un anticorpo di tipo IgG contro il rtpo 89. I MB sono, infatti, frammenti anticorpali dimerici, con dimensioni simili al frammento Fab dell'igg, che dovrebbero dimerizzare in modo più efficiente il rtpo rispetto all'igg intera, proprio in virtù della rimozione del possibileimpedimentostericotrailframmentofcdell'igge il recettore; sono prodotti con tecniche di ingegneria genetica e sono costituiti dalle regioni variabili della catena pesante (VH) e della catena leggera (VL) dell'igg; si distinguono in diabody, se il legame tra i frammenti anticorpali è non covalente, e in single chain variable region fragment antibody [sc(fv)2], se i frammenti sono legati in modo covalente 90. Questi MB, sia i diabody che gli sc(fv)2, hanno mostrato in vitro, in test di proliferazione e differenziazione su linee cellulari umane e di scimmia, un'attività agonista molto simile a quella della TPO. Inoltre, nella valutazione in vivo su modello animale, uno di questi MB, il VB22B sc(fv)2, ha aumentato in modo significativo la CP, senza determinare insorgenza di anticorpi contro la TPOendogena. UnaltroMB, ilta136sc(fv)2, hamostrato, invece, attività agonista, in vitro, con 2 tipi di rtpo mutati, derivati da pazienti affetti da trombocitopenia congenita amegacariocitica; questo, oltre a dimostrare che il sito di legame degli anticorpi sul rtpo non deve necessariamente essere lo stesso della TPO endogena, potrebbe fare intravedere una strategia terapeutica per pazienti con patologie causate da disfunzioni di recettori 89. È auspicabile che, in un futuro prossimo, sia possibile dimostrare l'efficacia terapeutica di questi anticorpi anche in studi clinici. Nella tabella I sono riepilogati i nuovi agonisti del rtpo e la loro attuale fase di sviluppo clinico. Conclusioni Dopo il deludente esordio della TPO ricombinante sullo scenario clinico, a oltre 10 anni dalla sua clonazione, la scoperta degli agonisti peptidici e non-peptidici del rtpo e la produzione di anticorpi agonisti, modificati e non, sembrano essere in grado di dare nuovo impulso e nuove speranze al trattamento farmacologico della piastrinopenia. Queste nuove terapie sembrano esenti dal problema dell'immunogenicità, chehagiocatounruolonondisecondo piano nell'abbandono della TPO ricombinante. Il traguardo dell'utilizzo clinico sembra essere più vicino per farmaci come l'amg 531 e l'eltrombopag, i quali sono arrivati ormai aitrials di fase III e per i quali sembra potersi prospettare anche un allargamento dell'impiego, oltre che 280

17 Thrombocytopenia and new pharmacological treatments Table I New rtpo agonists Class Name Phase of clinical development Peptide agonists AMG531 (Amgen) Phase III trial Pegylated peptide (Johnson & Johnson) 61 Phase I trial Non-peptidyl agonists JTZ-132 (Japan Tobacco Inc.) 68 Pre-clinical development SB (eltrombopag) (GlaxoSmithKline) 60,69-76 Phase III trial SB (GlaxoSmithKline) 19,77,78 Phase I trial YM477 (Astellas Pharma Inc.) 79 Pre-clinical development NIP-004 (Nissan Chemical Industries) Pre-clinical development Xanthocillins 1-4 (Nissan Chemical Industries) 83 Pre-clinical development Antibodies against epitopes Modified antibody (peptides in the Fab) of the rtpo (Alexion Pharmaceuticals) 87,88 Pre-clinical development Minibody [diabody and sc(fv)2] (Chugai Pharmaceuticals) 89 Pre-clinical development genetic engineering and molecular biology, currently seems almost unstoppable. Besides producing new molecules, this stimulates the characterization of the different binding sites and various methods of activating the rtpo, for each new agonist identified, thus contemporaneously providing a further impulse to the design and synthesis of new molecules. It does, therefore seem that William Osler s complaint, madein1892,ofalackofanefficient,reliabletreatmentfor purpura, might soon lose its validity after having remained true (at least in some aspects) for over a century 91. Acknowledgements The authors thank ProfessorAlberto Grossi, lecturer at the School of Specialisation in Haematology at the University of Florence, for his supervision of this manuscript. nella PTI, anche nelle piastrinopenie secondarie a chemioterapiapertumorisolidi,smdeinsufficienzaepatica. Lasperimentazioneclinicaallargatasuquesteduemolecole contribuirà ad approfondire, inoltre, le informazioni anche sui possibili effetti collaterali. La scoperta di questi nuovi farmaci ha sicuramente contribuito a migliorare la comprensione dei meccanismi biologici e molecolari alla base della trombopoiesi; l'identificazione di nuovi agonisti, con strutture chimiche diverse, è un processo che, grazie all'ingegneria genetica e alla biologia molecolare, attualmente sembra quasi inarrestabile. Questo, oltre alla produzione di nuove molecole, stimola a caratterizzare, per ogni nuovo agonista identificato, i diversi siti di legame e le varie modalità di attivazione del rtpo, fornendo contemporaneamente un ulteriore impulso alla progettazione e sintesi di nuove molecole. Sembra dunque che l'affermazione del 1892 di William Osler, ilqualelamentavalamancanzadiunaterapiaefficace e affidabile per la porpora, dopo aver mantenuto la sua validità (seppure limitatamente ad alcuni aspetti), per oltre un secolo, si stia avviando verso una definitiva archiviazione 91. Ringraziamenti Gli autori ringraziano il Professor Alberto Grossi, docente alla Scuola di Specializzazione in Ematologia dell'università di Firenze, per la supervisione del manoscritto. 281

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