ELEMENTI DI BASE. Valentina Ferrarini Bruno Iafelice

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1 SENSORI BIOLOGICI ELEMENTI DI BASE Valentina Ferrarini Bruno Iafelice DEIS - Dipartimento di Elettronica Informatica e Sistemistica ARCES Advanced Reserch Center on Electronic Systems Cosa e un sensore? Sensore : trasduttore che rileva i valori di una grandezza fisica [ ], o i suoi cambiamenti, e li trasmette a un sistema di controllo. fonte: Dizionario Garzanti della lingua italiana Sensor: a device that responds to a physical stimulus (as heat, light, sound, pressure, magnetism, or a particular motion) and transmits a resulting impulse (as for measurement or operating a control). fonte: M-W Dictionary

2 Sensori Biologici Fonte: H. Nakamura and I. Karube, Current research activity in biosensors, Anal Bioanal Chem (2003) 377 : Energia dai microrganismi

3 Electrical energy production from cells Conversion of chemical energy from food to electrical energy No need for complex plants, high temperatures Microbial fuel cells Energy as environmental sensor Influenced by availability of food and other chemicals Le batterie biologiche come sensori Glucosio ph Farmaci Biosensore Corrente caratterizzare i microrganismi stessi microrganismi differenti microrganismi stimolo diverso stesso stimolo

4 Respirazione C6H12O6 + 6O2 6 CO2 + 6 H2O G = kj Lavoro chimico Lavoro di trasporto Lavoro meccanico Adenosine triphophate (ATP) è la molecola più importante per il trasporto dell energia. ADP+H3PO4 ATP + H2O G =+30.6 kj CATENA ENZIMATICA Glicolisi Glucosio 2ADP 2ATP 2Ac. Piruvico 2 CO 2 2 Acetil CoA 2ADP 2ATP 4CO 2 2NAD + 2NADH 2NAD + 2NADH 6NAD +,2FAD 6NADH,2FADH 2 6H 2 O 34ATP 34ADP 6O 2 C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6 CO H 2 O G = kj 38 (H 3 PO 4 + ADP ATP+ H 2 O) G = (38 mol)( kj/mol) = ,8 kj 10 (NADH+ O 2 + H + NAD + + H 2 O) G = (10mol)(+60,5 kj kj/mol)= ,68 kj Efficienza ATP = 1162,8/ 2870= 40,5% Efficienza NADH = 2198,8/ 2870= 76,6%

5 Fermentazione (E.coli) Glucosio 2ADP 2ATP 2 Ac. Piruvico 2NAD + 2NADH Ac. Formico Etanolo Ac.lattico Ac.acetico Ac.succinico CO 2 H 2 2 (H3PO4 + ADP ATP+ H2O) G = (2mol)( kj/mol) = + 61,2 kj 2 (NADH+ Ac.piruvico + H + NAD + + Ac.lattico) G = (2mol)(+25,1 kj kj/mol) = kj Efficienza ATP = 61,2/ 2870 = 2.1% Efficienza NADH = 50/ 2870= 1.7% Microbial fuel cell

6 Microbial fuel cell : How does it work? ANODIC CHAMBER Proton exchange MEMBRANE cell Mediator reduced H + e - Mediator oxidized e - CATHODIC CHAMBER electrodes e - [FECN 6 ] 3- [FECN 6 ] 4- e - Microbial fuel cell : How does it work? The microbial fuel cell is constituted by two chambers separated by a semi-permeable membrane and it requires a water soluble mediator Redox mediators serve as electron shuttles that penetrate the bacterial cells, divert electrons from the respiration chain and transfer electrons to the fuel cell anode where, the reduced mediator is then electrocatalytically re-oxidized and is then free to repeat the cycle Cell metabolism produces protons in the anodic chamber, which may migrate through the proton selective membrane to the cathodic chamber where they are consumed by ferricyanide Fe 3- (CN) 6 and incoming electrons (via the external circuit) reducing it to ferricyanide Fe 4- (CN) 6

7 La pila di Bennetto E.Coli 10 8 cell/ml in PBS1X con Neutral Red Anaerobiosi (microaerofilia) 1 ciclo di 1 ora, solo tensione 1 ciclo di 1 ora, misura di corrente 1 ciclo di 3 ore, dopo l addizione di 1mmol di glucosio WT respirazione fermentazione 300 Current (microa) WT Glucose 1mmol Time (sec) Respirazione E. chimica E. elettrica 10 (NADH+ O 2 + H + NAD + + H 2 O) G = + 2,19868 kj Efficienza 0.02% E. Elettrica = I x V x tempo =292.17x 0.53 x 3600 =0.55 J Fermentazione 2 (NADH + Ac.piruvico + H + NAD + + Ac.lattico) G = 50,2 J E. Elettrica= I x V x tempo = x 0.53 x 7200 = 1,23 J Efficienza 2.4% Respirazione 10 (NADH+ O 2 + H + NAD + + H 2 O) G = + 2,19868 kj E. Elettrica = I x V x tempo = 313 x 0.53 x = 1,8 J Efficienza 0.08%

8 Electrical power production Experimental set-up: 100 µl, glucose as food E.coli as test strain (10 8 cells/ml) Circuit load 1 ko Cell treatments to improve energy production: Immobilization in agarose 100 µl Permeabilization Treatment No treatment Immobilization in Agarose Permeabilization with Triton X Current output (mean value) Methylen blue Neutral red 0,9 µa 1,2 µa 16 µa 18,2 µa 28,7 µa 32,4 µa How to improve the energy production? DNA as cell description code Tuning of cell energy production through DNA mutation Selective mutation DNA engineering Random mutation Chemical mutagenesis UV-c light mutagenesis Protoplast fusion

9 Tuning of the manufacturing engines E.Coli wild type UV Current assay Current Random mutagenesis DNA recombination through fusion of protoplasts A B Tuning of the manufacturing engines E.Coli wild type UV Current assay Current Random mutagenesis DNA recombination through fusion of protoplasts A B

10 Current assay algorithm Traditional way what can electronics do? Sample picking Parallel assay of ALL samples Data processing Current assay of the sample Are there more samples? Yes No Data processing Time reduction : from days to hours Current assay algorithm qeach well has an embedded sensor Ø No sample picking Ø High assay speed Ø and soon current assay and protoplast fusion in the same place 10

11 Screening system architecture Screening system architecture H cm H [FECN 6 ] 3- [FECN 6 ] 4- Well Channel

12 The biosensors array Plexiglass Transparency Biocompatibility Vapor sterilizing Gold Biocompatibility Corrosion-resistance Commonly used in PCB processing Plexiglass sheet: anode chamber Electrodes on PCB Proton exchange membrane Electrodes on PCB Plexiglass sheet: catode chamber Electrodes on PCB Proton exchange membrane ELEMENTI DI PROGETTO DI SENSORI BIOLOGICI Bruno Iafelice DEIS - Dipartimento di Elettronica Informatica e Sistemistica ARCES Advanced Reserch Center on Electronic Systems

13 FASI DI PROGETTO Tecnologia Identificazione della tecnologia/e utile Adattamento di tecnologie esistenti Studio di nuovi processi tecnologici Progetto del sensore Struttura Disegno 3d Scelta dei materiali Suddivisione del problema Elettrodi e piste Canali, viadotti e alloggiamento del campione biologico Modellizzazione e Simulazione Fenomeni fisici presenti : fenomeni trascurabili e fenomeni predominanti Modello circuitale Modello matematico Simulazione (es. Femlab) Scelta della Tecnologia Progetto Modellizzazione e Simulazione Test e Misura Test e Misura ELEMENTI TECNOLOGICI

14 Introduzione Individuare tecnologie esistenti in altri settori utili per la realizzazione di sensori biologici Integrazione e sinergia di tecnologie diverse: es. Packaging di dispositivi biomedicali e circuiti elettronici ibridi Caratterizzazione e scelta dei materiali Bio-compatibilita [2] Resistenza ai solventi Trasparenza Stabilita elettrochimica (metalli) [1,2] [1] M. Pourbaix, Electrochemical corrosion of metallic biomaterials, Biomaterials, vol. 5, pp , May [2] H. Zitter, Plenk H. Jr., The electrochemical behavior of metallic implant materials as an indicator of their biocompatibility, J. Biomed. Mater. Res., vol. 21(7), pp , Tecnologie Faremo riferimento alle seguenti tecnologie: Dry-film resist Molding con PDMS Tecnologia PCB con macchine controllo numerico (materiali non standard) }FLUIDICA e STRUTTURA Tecnologie PCB }RACCOLTA e TRATTAMENTO SEGNALI

15 Litografia Necessità di sagomare un film su un substrato Si trasferisce il disegno voluto da una maschera su uno strato di resist (una specie di emulsione fotografica) spalmato sul substrato. Ciò avviene attraverso due passi distinti: esposizione (alla luce UV, o agli elettroni, o ai raggi X, etc.) sviluppo, ovvero rimozione selettiva di alcune parti di resist, a seconda che siano state esposte o no La maschera di resist servirà come stampino nei processi seguenti, p. es. per proteggere determinate zone del wafer dall attacco di acidi La maschera è una lastra di quarzo, coperta da un sottile strato di cromo, nella quale è stato riprodotto il pattern voluto Componenti: Resist una sostanza di base (resina, polimero) non fotosensibile una sostanza fotosensibile, sensibile a una lunghezza d onda presente nello spettro UV usato. Deve permettere il procedere della reazione dalla superficie del resist fino alla superficie del substrato. Deve essere ben miscibile con la resina di base ed essere termicamente stabile un solvente per diminuire la viscosità e permettere la ricopertura del substrato

16 Resist positivo e negativo Meccanismi di funzionamento del resist positivo la resina di base è inerte rispetto alla luce e resistente ai processi di attacco il componente fotosensibile non è inizialmente solubile nello sviluppo tuttavia la solubilità aumenta di 100 volte, una volta esposto alla radiazione lo sviluppo quindi scioglie la parte di resist che è stata esposta; la restante parte non reagisce con la sostanza di sviluppo (developer), non lo assorbe, ed è lasciata invariata lo sviluppo è costituito da soluzioni alcaline (es. NaOH)

17 Meccanismi di funzionamento del resist negativo la luce ultravioletta provoca cross-linking, formazione di legami fra polimeri e allungamento della catena polimerica come per il resist positivo, esiste una dose minima (mj/cm2) a cui questo fenomeno avviene la nuova struttura non è più solubile nello sviluppo. Lo sviluppo non scioglie la frazione esposta, ma la permea e la fa gonfiare (perdita di risoluzione) lo sviluppo è costituito da solventi organici Tipi di resist Liquid-resist in forma liquida, si depone per spinning (e possibile regolare lo spessore della deposizione, da 0.1µm) Dry-resist in forma solida, si depone per laminazione (sono disponibili resist di vari spessori, da 30µm a 100µm)

18 Dry Film Resist (DFR) ORDYL SY300 APPLICATION METHODS ORDYL SY 300 PROCESS CONDITION SY 300 Speed m/min (f/min) 0,5-2,0 ( 1,6-6,5 ) Lamination Pressure bar (PSI) 1,0-2,5 ( ) Temperature C ( F) ( ) Sensitivity Exposure mj Stouffer steps 6-9 Development Paddle or dipping method BMR Developer SK - 4 Permanent Dry Film for MEMS and IC packaging Special Solvent developable High Resolution Excellent heat resistance Excellent chemical resistance High dimension stability BIO-COMPATIBLE Stripping ( only before post bake) BMR Stripper EG Temperature C ( F) ( ) Temperature C ( F) BMR Rinse SA 150 ( 302 ) Post Bake Time min GRADES AND DIMENSIONS Type designation Dry-film thickness Film width Film length ORDYL SY roll each box From 15 to 50 µm mm 30 m (0.6 2 mils) 7,87" - 9,84-13" inch 98,42 feet fonte ElgaEurope Fotolitografia con dry-film resist Laminazione Esposizione Sviluppo Etching Stripping

19 Microfluidica con dry-film resist (1) q Disegno al CAD e realizzazione della maschera Ø Stampanti laser e phaser Ø Flashmask q Laminazione sul substrato Ø Manuale Ø Laminatore q Esposizione ai raggi UV della superficie opportunamente mascherata Dry-resist Substrato Raggi UV Flashmask q Sviluppo q Bonding con un secondo substrato Il resist modellato delinea la struttura microfluidica Microfluidica con dry-film resist (2) q Contorni netti e pareti molto verticali q Possibilita di bonding con un secondo substrato q Basso costo Fotografie eseguite al microscopio elettronico, cortesia Paul Vulto q Uso del resist per sviluppo di Strutture Microfluidiche per: introdurre, trasportare e recuperare un campione cellulare [1, 2] [1] P.Vulto, N. Glade, L. Altomare, J. Bablet, G. Medoro, Leonardi, A. Romani, I. Chartier, N. Manaresi, M. Tartagni, R..Guerrieri, DRY FILM RESIST FOR FAST FLUIDIC PROTOTYPING, Micro Total Analysis Systems 2004, vol. 2, pp. 43 [2] P. Vulto, N. Glade, L. Altomare, J. Bablet, L. Del Tin, G. Medoro, I. Chartier, N. Manaresi, M. Tartagni, R. Guerrieri, Microfluidic channel fabrication in dry film resist for production and prototyping of hybrid chips, Lab on a Chip,

20 e per concludere fonte Tecnologia PCB a controllo numerico Quick Circuit 5000 T-Tech: Delinea piste Esegue fori Incide i contorni Materiale standard: FR4 (rame su fibra di vetro) Splindle Converter Controller Piano di fresatura PC con software IsoPro

21 Quick Circuit 5000 T-Tech Gruppo di fresatura/foratura e particolare del mandrino e del piede di fine foro. drill bit contour router endmill milling tools Tool di fresatura/foratura.

22 Macchine a controllo numerico e biosensori Adattabilità alla realizzazione di sensori biologici Lavora materie plastiche: plexiglass e teflon Protocolli di processo Esegue canali, viadotti, Usare i software CAD per i PCB

23 Protocollo di fabbricazione : struttura in plexiglass q Disegno al CAD q Esecuzione dei fori q Fresatura Ø rimozione della maggior parte del materiale per delineare le forme 800 µm q Rifinitura Ø planarizza Ø esecuzione dettagli Errori Ripetizione con disallineamento 600 µm Ordine delle maschere Ø Fori à Fresatura v.s Ø Fresatura à Fori 900 µm Sovrapposizione di maschere 800 µm 800 µm Velocita di esecuzione Ø Rotazione Ø Movimento Residui di lavorazione 23

24 Confronto tra le due tecnologie 1cm Fotolitografia con Dry-resist Tempo di fabbricazione: 30 ore Spessori ottenibili: µm Risoluzione: 40 µm Utilizzo di sostanze chimiche Tecnologia PCB a controllo numerico Tempo di fabbricazione: 1 2 ore Spessori ottenibili: 10 µm 3 mm Risoluzione: 100 µm PDMS Poly (dimethyl siloxane) Material characteristics: viscous optically transparent rubbery biocompatible easy and rapid for device development cost effective low quantity processing mechanically stable thermally stable (-45 C to 200 C) dielectric stability (epsilon=2.65) hydrophobic gas permeable courtesy Daniele Gazzola

25 PDMS Poly (dimethyl siloxane) Applications: biomedical devices, disposable products, chemical sensors, microfluidics based systems MEMS courtesy Daniele Gazzola PDMS Poly (dimethyl siloxane) Chemistry: courtesy Daniele Gazzola

26 PDMS Poly (dimethyl siloxane) Soft lithography: DFR 1 start with a rigid substrate Substrato (vetro) PDMS 2 produce the mold using standard photoresist processing 3 pour and cure PDMS 4 separate the PDMS device from the mold 5 complete the device by bonding the PDMS with a substrate courtesy Daniele Gazzola Esempio REALIZZARE UNA BATTERIA BIOLOGICA Usare le tecnologia del Dry-Resist e una macchina a controllo numerico da prototipizzazione per creare un sensore basato sul principio di una Batteria biologica alimentata a Batteri.

27 Schema tradizionale della batteria Contributo della tecnologia a controllo numerico Struttura in plexiglass Camere anodica 100 mm 3 Camere catodica 100 mm 3 Scheda PCB Elettrodi Guida per la membrana: spessore 180 µm Piste per portare i segnali all esterno

28 Contributo della litografia con dry-resist Double bonding con la struttura in plexiglass Plexiglass Tenuta stagna Realizzazione di microcanali e viadotti per introdurre il campione biologico Passivazione della PCB Dry-resist PCB Plexiglass: Maschere di processo

29 PCB: Maschere di processo Dry-resist: Maschere di processo Maschera fotolitografica PCB

30 Risultato finale 1 cm SENSORI BIOLOGICI ATTIVITA DI RICERCA IN CORSO Responsabile dei progetti: Prof. Roberto Guerrieri Valentina Ferrarini Bruno Iafelice DEIS - Dipartimento di Elettronica Informatica e Sistemistica ARCES Advanced Reserch Center on Electronic Systems

31 Chi siamo? Microbiologi Ingegneri Elettronici Perche lavoriamo insieme? cm µm 10 mm 1 µm 50 µm nm nm 65 nm 2015 Year 45 nm lls Ce s elle gan r O Process Logic transistors Logic transistors Technology (nm) / µm2 in 104 µm source: International Technology Roadmap for Semiconductors, (2003 edition) 31

32 Linee di ricerca Fuel Cells Mutagenesi Sensori Impedenziometrici Le problematiche che affrontiamo Progetto di schede Biologia molecolare Software: acquisizione ed elaborazione dati Ricerca di test marcatori Tecnologia Compatibilita Biologica dei materiali Modellizzazione Fluidica 32

33 Cosa offriamo? Tesi e Tirocini Dal software all hardware Dalla progettazione alla misura Possibilità di acquisire competenze strumenti cad software di simulazione software di modellizzazione interdisciplinari conoscenze in campo biologico Contatti Per informazioni contattare : Bruno Iafelice Valentina Ferrarini ARCES Advanced Reserch Center on Electronic Systems DEIS Dipartimento di Elettronica Informatica e Sistemistica Viale Pepoli, 3/2 Bologna

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