CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS

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1 METODO NAZIONALE STANDARD CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS F 12 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Specialist and Reference Microbiology Division & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 1 di 12

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà Per aggiornata cortesia automaticamente. prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2004). Enumeration of Staphylococcus aureus. National Standard Method F 12 Emissione 1. & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 2 di 12

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD INDICE... 3 PROCEDURA MODIFICA SCOPO.. 5 INFORMAZIONE DI BASE PRINCIPIO DEFINIZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA PROCEDIMENTO PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E DILUIZIONI SEMINA ED INCUBAZIONE CONTEGGIO DELLE COLONIE PROVE DI CONFERMA CALCOLO DEI RISULTATI ESPRESSIONE DEI RISULTATI STRUTTURE DI RIFERIMENTO. 10 ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA PER IL CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 11 BIBLIOGRAFIA. 12 & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 3 di 12

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato F 12 Procedura Operativa Standard per il conteggio di Staphylococcus aureus Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio.modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 4/ Prima pagina Stato del Documento Ridisegnata Revisionato 4 Pagina della procedura di modifica Ridisegnata & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 4 di 12

5 PROCEDURE OPERATIVE STANDARD PER IL CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS INTRODUZIONE Scopo Il presente metodo per il conteggio di S. aureus è applicabile a tutte le matrici alimentari compresi i prodotti lattierocaseari impiegando la tecnica di conteggio in superficie delle colonie dopo incubazione a 37 C. Informazioni di base La presenza di S. aureus negli alimenti pronti al consumo è generalmente considerata indice di scarsa qualità igienica se il numero è eguale o superiore a 10 2 unità formanti colonie per grammo (ufc/g) 1. Conteggi inferiori indicano scarsa manipolazione mentre conteggi elevati possono essere associati a produzione di tossine con conseguenti intossicazioni alimentari. Il metodo consente conteggi di S. aureus di 20 ufc/g o superiori. Il metodo è basato sul BS 5763 Parte 7: ed è anche descritto nella Practical Food Microbiology 3. & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 5 di 12

6 1.0 PRINCIPIO Il metodo per il conteggio di S. aureus prevede la semina in superficie di un volume definito della diluizione 10-1 del campione di prova e di altre appropriate diluizioni decimali su un agar selettivo con incubazione a 37 C per 48 ore. Il calcolo del numero di ufc di S. aureus per grammo o ml di campione è definita dal numero di colonie tipiche e/o atipiche cresciute sul terreno selettivo e confermate successivamente dalle prove della DNasi e della coagulasi. 2.0 DEFINIZIONI Nel contesto di questo metodo lo Staphylococcus aureus è definito come un microrganismo che sviluppa colonie tipiche e/o atipiche sulla superficie del terreno selettivo descritto in questo metodo e che presenta reazioni positive nelle prove di conferma. 3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. Devono inoltre essere indossati occhiali di sicurezza e guanti resistenti ai prodotti chimici quando si manipola l acido cloridrico nel corso della prova della DNAsi. 4.0 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Bilancia con sensibilità di 0.1g Diluitore gravimetrico (opzionale) Stomacher Vortex Piastratore a spirale (opzionale) Termostato a 37 C ± 1 C Contatore di colonie (opzionale) Buste per Stomacher (sterili) Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare volumi fino a 10mL e 1mL (opzionale) Pipette (sterili con rilascio totale) 10mL e 1mL graduate in volumi di 0.1 ml (opzionale) Spatole (sterili, monouso) 5.0 TERRENI DI COLTURA Si possono utilizzare terreni disidratati pronti all uso disponibili in commercio con formulazione equivalente. Seguire le indicazioni della ditta produttrice. Diluente peptone salino (consente il maggior recupero di microrganismi) (DPS) Peptone Cloruro di sodio Acqua ph 7.0 ± 0.2 a 25 C 1.0 g 8.5 g 1 L & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 6 di 12

7 Acqua peptonata tamponata (APT) Peptone Cloruro di sodio Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph 7.2 ± 0.2 a 25 C 10.0 g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 L Agar Baird Parker Triptone Estratto di carne Estratto di lievito Piruvato di sodio Glicina Cloruro di litio Agar Emulsione di tuorlo d uovo Tellurito di potassio Acqua ph 6.8 ± 0.2 a 25 C 10.0 g 5.0 g 1.0 g 10.0 g 12.0 g 5.0 g 20.0 g 50 ml 0.1 g 1 L Agar sangue Agar Columbia o qualsiasi altro terreno di base disponibile con 5% di sangue di cavallo Agar DNasi Triptosio Acido desossiribonucleico Cloruro di sodio Agar Acqua ph 7.3 ± 0.2 a 25 C 20.0 g 2.0 g 5.0 g 12.0 g 1 L Soluzione di blu di toloudina Blu di toluidina Acqua 0.1 g 100 ml Acido cloridrico (1N) (opzionale) Reagenti per coagulasi Plasma di coniglio o qualsiasi altro prodotto del commercio idoneo per la prova della coagulasi. 6.0 PROCEDIMENTO 6.1 Preparazione del campione e diluizioni Seguendo la procedura descritta nello Standard Method F 2 Preparazione del Campione e delle Diluizioni preparare un omogeneizzato a 10-1 in diluente peptone salino (DPS) o in acqua peptonata tamponata (APT) e, se richieste, le successive diluizioni decimali in DPS. Per prodotti caseari seguire le procedure descritte nello Standard Method D 1- Preparazione del Campione e delle Diluizioni. & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 7 di 12

8 6.2 Semina ed incubazione Partendo dalla diluizione più elevata inoculare 0.5 ml di ciascuna diluizione al centro di una piastra asciutta di Baird- Parker (BP). Utilizzando una spatola sterile e partendo dalla diluizione più alta, distribuire l inoculo sulla superficie di ciascuna piastra il più presto possibile, facendo attenzione per non toccare i bordi. Se sono attesi conteggi elevati può essere utilizzato un piastratore a spirale (Standard Method F11). Lasciare le piastre sul banco di lavoro per circa 15 minuti per consentire l assorbimento dell inoculo nell agar. Capovolgere le piastre ed inserirle in termostato a 37 C per 48 ± 2 ore. 6.3 Conteggio delle colonie Prendere in considerazione le piastre con colonie tipiche di S. aureus fino a 150 unità. Le colonie tipiche appaiono nere, lucenti, convesse e con diametro fino a circa 3 mm, con una sottile zona di opacità circondata da un alone chiaro. Contare ed annotare il numero delle tipiche colonie. Negli alimenti di origine bovina, inclusi i prodotti caseari, si possono sviluppare colonie di S. aureus atipiche che non presentano opacità o chiarificazione. Per alimenti di questo tipo Contare ed annotare anche la presenza delle colonie atipiche. 6.4 Prove di conferma Isolare cinque colonie di ogni tipo (o tutte le colonie se meno di cinque) per le prove di conferma; su queste eseguire la prova della Dnasi e della coagulasi. Seminare ciascuna colonia in una piastra di agar DNasi ed in un settore di una di agar sangue. Inserire le piastre in un termostato a 37 C per ore. Esaminare le piastre di agar sangue per verificare che il ceppo sia puro e che l aspetto delle colonie sia compatibile con S. aureus: colonie color crema o dorate con diametro fino a 3 mm. Produzione di DNasi Inondare la superficie delle piastre Dnasi con soluzione di blu di toluidina (SBT) o acido cloridrico normale (HCL). Dopo circa 30 secondi eliminare l eccesso del reagente (SBT o HCL) in un contenitore per rifiuti chimici. Le reazioni positive si presentano nel modo seguente:- Soluzione di blu di toluidina: colonie circondate da una zona rosa su sfondo blu scuro. Acido cloridrico: colonie con una distinta zona di chiarificazione. Produzione di coagulasi Utilizzando l isolamento su agar sangue (AS) eseguire la prova della coagulasi su vetrino per i ceppi Dnasi positivi. Prima dell uso tenere il plasma di coniglio a temperatura ambiente (10-15 minuti) ed eseguire la prova nel modo seguente: - Depositare due gocce di acqua su un vetrino da microscopio ed mettere in ciascuna di esse una sospensione cremosa del ceppo isolato su AS. Mescolare un ansata del reagente coagulasi non diluito in una delle sospensioni. La presenza di coagulasi legata è dimostrata dalla comparsa entro 5-10 secondi di un aggregato microscopico e dall assenza di autoagglutinazione nella seconda sospensione. Per i prodotti del commercio seguire le istruzioni delle ditte produttrici Le diverse colonie sono confermate come S. aureus se presentano morfologia tipica su agar sangue e danno reazioni positive alle prove della Dnasi e coagulasi. Ceppi di controllo Per le prove di conferma devono essere usati controlli positivi e negativi. Controllo positivo: - S. aureus (ceppo Oxford) NCTC 6571 Controllo negativo - S. epidermidis NCTC & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 8 di 12

9 7.0 CALCOLO DEI RISULTATI I conteggi devono essere eseguiti, se possibile, usando diluizioni che consentono lo sviluppo sulla piastra di 15 o più colonie. Calcolare il numero di S. aureus per grammo o ml nel modo seguente: - Numero di S. aureus per grammo = Numero di colonie tipiche confermate Numero di colonie tipiche saggiate x Numero di colonie conteggiate Volume saggiato x diluizione aggiunto a Numero di colonie atipiche confermate Numero di colonie atipiche x Numero di colonie conteggiate Volume saggiato x diluizione 8.0 ESPRESSIONE DEI RISULTATI Se non sono rilevati microrganismi alla diluizione 10-1 refertare nel modo seguente: Inferiore a 20ufc/g o ml Se il numero di microrganismi ricercati è compreso fra 10 e 99 per grammo refertare: a ufc/g o ml ove a è un numero compreso fra 20 e 99 Se il numero di microrganismi ricercati è pari a 100 o superiore per grammo o ml, refertare con un numero prima ed uno dopo il punto decimale espresso in potenza a base 10 nel modo seguente: a x 10 b ufc/g o ml ove a non è mai inferiore a 1.0 o superiore a 9.9 e b rappresenta l appropriata potenza di dieci. Arrotondare il numero per eccesso se l ultima cifra è uguale o superiore a 5 e per difetto se l ultima cifra è 4 o minore: esempio 1920 ufc per g o ml è repertato come 1,9 x 10 3 ufc/g o ml ufc per g o ml è repertato come 2.4 x 10 5 ufc/g o ml & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 9 di 12

10 9.0 STRUTTURE DI RIFERIMENTO In alcune circostanze come durante un epidemia o per non conformità di prodotti lattiero-caseari 4 con i regolamenti di igiene o per potenziali livelli di rischio in altri prodotti alimentari 1, può essere necessario eseguire ulteriori ricerche sui ceppi isolati. La tipizzazione fagica dei ceppi isolati e la ricerca di enterotossina nell alimento possono risultare appropriate. Strutture di riferimento sono disponibili presso i seguenti laboratori nazionali di riferimento: Tipizzazione fagica Staphylococcus Reference Unit, Laboratory of HealthCare Associated Infection, SRMD, Colindale Ricerca dell enterotossina. Food Safety Microbiology Laboratory, SRMD, Colindale & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 10 di 12

11 Allegato: Diagramma di flusso che illustra la procedura per il conteggio di Staphylococcus aureus Preparare una diluizione del campione 10-1 Omogeneizzare con stomacher Se richiesto preparare diluizioni successive in diluente peptone salino A partire dalla diluizione maggiore seminare 0.5 ml di ciascuna diluizione al centro di una piastra di Baird Parker Distribuire l inoculo su ciascuna piastra utilizzando una spatola sterile Incubare a 37 C per 48 ore in aerobiosi Contare le tipiche colonie (e qualsiasi colonia atipica per alimenti di origine bovina) Eseguire isolamenti su agar DNAsi ed agar sangue ed incubare a 37 C per ore Eseguire la prova della coagulasi su vetrino sui ceppi DNasi positivi Calcolare il numero totale di S. aureus per grammo o ml & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 11 di 12

12 BIBLIOGRAFIA 1 PHLS. Microbiological guidelines for some ready-to-eat foods at the point of sale: an expert opinion from the Public Health Laboratory Service (PHLS). PHLS Microbiology Digest 1996, 13 : British Standards Institution. BS5763. Methods for microbiological examination of food and animal feeding stuffs. Part 7 - Enumeration of Staphylococcus aureus by colony count method. London : BSI, Roberts D, Hooper W, Greenwood M.(Eds) Practical Food Microbiology, London : PHLS, The Dairy Products (Hygiene) Regulations Statutory Instrument No London :HMSO,1995 & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveillance Unit, CDSC. Pagina 12 di 12