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1 Elettroforesi Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. A qualunque ph diverso dal pi le proteine hanno una carica netta quindi, se poste in un campo elettrico, migrano verso l elettrodo di carica opposta. mobilita delle molecole: q= carica della molecola E= potenziale elettrico Forza che muove gli ioni f= coefficiente frizionale R f = mobilita relativa delle proteine: rapporto tra la distanza percorsa dalla proteina rispetto a quella percorsa dal colorante R f = qe/ f dipende dalla massa e dalla forma della molecola che migra, e dalla viscosita del mezzo

2 Elettroforesi Supporto: deve essere resistente; privo di carica e stabile in un ampio ambito di temperatura, ph e osmolarita ; deve avere una porosita controllata e regolabile in modo preciso. Gel di poliacrilamide: sono i mezzi di supporto piu utilizzati poiche chimicamente inerti si formano facilmente polimerizzando l acrilamide la porosita puo essere controllata variando la percentuale di acrilamide e/o il rapporto tra monomero e dimero che forma legami trasversali nel processo di polimerizzazione. Acrilamide: monomero solubile in acqua Metilene bisacrilamide: contiene due doppi legami che nelle reazioni di polimerizzazione formano legami trasversali con catene adiacenti di poliacrilamide

3 Elettroforesi Polimerizzazione: meccanismo a catena di radicali liberi Ammonio persolfato radicali instabili SO 4 - radicali liberi TEMED acrilamide POLIMERIZZAZIONE

4 SDS-PAGE Utilizza il detergente anionico sodio dodecil solfato, che si lega con grande affinita alle proteine: ogni 2 aa legano una molecola di SDS. Azione SDS: la carica negativa acquisita con il legame di SDS e molto maggiore della carica della proteina nativa, che diventa insignificante; denatura le proteine in forma lineare, essendo in grado di spezzare quasi tutte le interazioni non covalenti. Si aggiunge mercaptoetanolo per ridurre i legami disolfuro R f = qe/ f dipende dalla massa e dalla forma della molecola che migra, e dalla viscosita del mezzo Denaturando le proteine con il detergente anionico sodio dodecil solfato la separazione si basa esclusivamente sulle dimensioni delle catene polipeptidiche.

5 SDS-PAGE Applicazioni seguire il corso della purificazione di proteine. Permette di evidenziare i contaminanti, ad es dovuta a piccole quantita di molte proteine o quantita abbastanza grande di una particolare proteina. determinazione della massa molecolare di catene polipeptidiche. Si utilizzano proteine di massa molecolare nota e si determina la mobilita relativa (Rf): si divide la distanza migrata dalla proteina per la distanza migrata dal colorante. Esiste una relazione lineare tra mobilita relativa e logaritmo del peso molecolare della proteina. determinare la concentrazione di una proteina nelle cellule (ad es. in particolari condizioni fisiologiche) grazie al successivo western blot.

6 SDS-PAGE Caratteristiche rapida: elettroforesi e colorazione richiedono un giorno sensibile: blu di coomassie: 0.1 µg di proteine silver stain: da 10 a 100 volte piu sensibile risoluzione: si possono distinguere proteine che differiscono in massa di circa il 2%

7 Nota bene: Il meccanismo di separazione nell elettroforesi su gel e diverso da quello della cromatografia per filtrazione su gel. Filtrazione su gel: molecole escluse dall interno dei granuli, le molecole piu grandi eluiscono per prime; Elettroforesi su gel: sostanza reticolata che agisce da setaccio, in cui le forze di attrito diminuiscono la mobilita delle molecole piu grandi. a>b>c Le molecole piu grandi migrano piu lentamente di quelle piu piccole.

8 Blotting Il blotting e stato eseguito per la prima volta da Southern nel 1975 con il trasferimento di DNA dal gel di agaroso alla membrana di nitrocellulosa. Successivamente il blotting e stato applicato all RNA (Northern) e alle proteine Western blot Western blotting Tecnica che permette di rivelare e quantificare proteine che reagiscono con un anticorpo specifico. In questa tecnica le proteine, dopo esser state frazionate in SDS-PAGE, vengono trasferite su membrana grazie ad un campo elettrico trasversale che le forza a migrare dal gel sulla membrana a cui aderiscono.

9 Western blotting 1. Blocking: nel processo di trasferimento rimangono dei siti liberi sulla membrana, che vengono bloccati rivestendo la membrana con una miscela di proteine non specifiche. Questo evita il legame non specifico dell anticorpo su tali siti. Si utilizza latte o BSA. 2. Incubazione con anticorpo primario: la membrana viene immersa in una soluzione che contiene l anticorpo contro la proteina di interesse. Poiche tutti i siti della membrana che legano proteine sono bloccati, l anticorpo aderisce alla membrana solo se si lega con il suo antigene specifico. Di solito viene incubato o/n a 4 C

10 Western blotting 3. Lavaggi: permettono di eliminare dalla membrana l anticorpo in eccesso che non ha aderito al proprio antigene. La membrana viene lavata, agitando energicamente su basculante, con una soluzione contenente un detergente (tween 20). E importante cambiare diverse volte tale soluzione. 4. Incubazione con anticorpo secondario: la membrana viene immersa in una soluzione che contiene un anticorpo in grado di reagire con qualunque anticorpo della stessa fonte biologica del primario. Es: anticorpo primario di rabbit anticorpo primario di mouse secondario: goat anti rabbit secondario: goat anti mouse 5. Lavaggi: permettono di eliminare dalla membrana l anticorpo in eccesso che non ha aderito alle immunoglobuline dell anticorpo primario. Si utilizza la stessa soluzione con detergente utilizzata nello step 3; l ultimo lavaggio avviene invece in TBS perche il tween 20 puo inibire la reazione utilizzata per la rivelazione della proteina.

11 Western blotting 6. Rilevazione della proteina: l anticorpo secondario e accoppiato covalentemente ad un enzima che catalizza una reazione cromogena quando la membrana viene incubata con il substrato dell enzima accoppiato. Questo metodo fornisce una rivelazione molto sensibile della proteina!!!

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