Purificazione e determinazione di proteine

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1 Corso di insegnamento Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti Purificazione e determinazione di proteine O H N R O H N Cu 2+ N H O R N H O N N O- O O- O Acido bicinconico Lezione n.xxi

2 Estrazione (solubilizzazione) della proteina Per estrarre una proteina occorre solubilizzarla per i successivi passaggi di purificazione. proteine proteine proteine extracellulari intracellulari di membrana separazione disintegrazione disintegrazione dalle cellule cellulare cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto) isolamento della frazione cellulare isolamento della frazione di membrana, solubilizzazione tecniche cromatografiche (logica nella sequenza)

3 Isolamento della frazione cellulare Centrifugazione frazionata

4 Solubilizzazione delle proteine di membrana

5 Purificazione - tecniche cromatografiche (Logica nella sequenza) 1. Passaggio iniziale ad alta capacità ed alta purificazione (cromatografia affinità) 2. Sequenza di passaggi disposta in modo da utilizzare direttamente il materiale ottenuto da un passaggio per quello successivo, senza troppe manipolazioni (scambio ionico, prima di RP, o gel filtrazione quando c è anche bisogno di un cambio di tampone) 3. Non impiegare mai più passaggi che sfruttano le medesime proprietà della proteina.

6 Sviluppo dei passaggi per il cambiamento di tampone e la concentrazione del campione Precipitazione (entrambi) Filtrazione (entrambi) Cromatografia per gel filtrazione (cambio tampone) Dialisi (cambio tampone) Guarni- Provetta di recupero Camera di caricamento Campione concentrato Membrana Supporto inerte zione Campo centrifugo Ultrafiltrato

7 Celle Amicon

8 Conservazione della proteina Congelamento -80 C. Aggiunta di eventuali agenti criogenici (glicerolo). Nota: verificare che la proteina d interesse non sia sensibile alle basse temperature; conservare aliquote numerate per evitare il deperimento da congelamento/scongelamento

9 Monitoraggio della purificazione Unità internazionale (UI) di un enzima = quantità di enzima in grado di convertire una µm di substrato in prodotto in un minuto (in condizioni definite) Attività specifica = unità totali di enzima nella frazione quantità totale di proteine nella frazione Grado di purificazione = attività specifica della frazione attività specifica iniziale Resa = unità di enzima nella frazione x 100 unità di enzima nella preparazione iniziale Un processo di purificazione è buono quando l attività specifica aumenta

10 Tabella di purificazione di un enzima Passaggio di purificazione Volume della frazione (ml) Proteine totali (mg) Attività (Unità) Attività specifica* (unità/mg proteine) Estratto crudo Precipitazione con solfato d ammonio (60%) Cromatografia a scambio cationico Gel- filtrazione Cromatografia di affinità Attività specifica= Unità enzimatiche mg di proteine

11 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA TOTALE Per la determinazione della concentrazione totale di proteina in una miscela sono disponibili molte tecniche. Parecchi di questi metodi non forniscono un concentrazione assoluta ma relativa rispetto ad uno stock di proteina standard che viene usata per la preparazione di una retta di taratura (spesso, per il basso costo, la facile reperibilità etc., si utilizza come standard l albumina da siero bovino, o BSA).

12 Il Metodo Per la determinazione della concentrazione proteica di una soluzione incognita, si costruisce innanzitutto una retta di taratura con quantità crescenti di albumina da siero bovino (BSA) che viene abitualmente utilizzata come riferimento. Vengono anche preparati un campione che non contiene BSA (detto bianco) e due aliquote (in L) del campione CX. n. provetta BSA 2 mg/ml ( L= 2 g) BSA (2 g) Campione X ( L) H 2 O ( L) Reagente ( L) 0 (bianco) o CX CX I campioni si incubano per un determinato tempo, poi...

13 595 nm 1- Lettura dei campioni, incluso il bianco; 2- costruzione della retta di taratura, con i campioni di BSA, utilizzando le letture a 595 nm, sottratte del valore del bianco; 3- interpolazione dei valori di assorbimento, anch essi sottratti del valore del bianco, dei campioni proteici a [X] (in doppio); 4- lettura sull ascissa della quantità di Lowry Assay Standard Curve Protein amount vs. Absorbance g proteine contenuta nel campione X (esprimendo la concentrazione in mg/ml ) A a Protein ( g) L intensità di colore aumenta all aumentare della quantità di proteine (osservazione qualitativo); La lettura dell assorbimento ed il ricorsi della retta di taratura ci fanno avere la QUANTITÀ di proteine (dato quantitativo).

14 Metodo del biureto Il reagente chiave è una soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente solfato di rame(ii) diluito. Quando la soluzione è aggiunta alla proteina, il rame si può legare alle proteine, formando un complesso colorato (si ritiene che tale complesso includa la coordinazione contemporanea di 4 gruppi peptidici con un unico ione rame). Compare un colore viola-bruno ( max =540 nm) che ovviamente sarà proporzionale alla concentrazione totale dei legami peptidici e dunque di proteina. Biureto Si forma riscaldando l'urea a C. Reagisce con la soluzione fortemente alcalina di tartrato contenente solfato di rame(ii) diluito. Da ciò deriva il nome dato al metodo.

15 O H R O H N N Cu 2+ N N H O R H O Complesso formato dal rame, con colore viola-bruno Il metodo è generale (anche se i residui di prolina non reagiscono ) e molto riproducibile. Purtroppo, la sensibilità è bassa: non consente in genere di misurare concentrazioni proteiche <1 mg/ml.

16 Metodo di Lowry (reattivo di Folin-Ciocalteu) Molto usato, soprattutto nel passato. La miscela da saggiare viene dapprima portata in ambiente alcalino (ph ) e fatta reagire con citrato o tartrato di rame(ii). Dopo un certo tempo (necessario probabilmente per consentire la complessazione del rame da parte delle proteine) si aggiunge la miscela di Folin-Ciocalteau (sviluppato inizialmente per la determinazione della tirosina e quindi poi per fenoli e polifenoli), il cui componente attivo è rappresentato da una miscela di sodio molibdato, fosfato e tungstato. Con l andare del tempo si sviluppa un colore scuro, che tende al blu in presenza di proteina (in assenza, il colore tende al marrone). L intensità della colorazione blu (lettura a 660 nm), sarà proporzionale alla concentrazione di proteina.

17 Non è chiaro perché il colore blu si sviluppi, è possibile che gli acidi fosfomolibdotungstici formino dei complessi misti con rame e proteina. Poiché la presenza e quantità dei residui aromatici (in particolare, tirosinici) influenzano fortemente per lo sviluppo del colore, sembra più probabile che il meccanismo coinvolga una riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + da parte di questi residui, seguita da una reazione dello ione rameoso con gli acidi fosfomolibdotungstici. Svantaggi: richiede tempi di incubazione precisi; inoltre alcuni tamponi (come il MES) ed altre sostanze possono interferire; infine, poiché il contenuto in tirosine può influenzare la colorazione, le risposte al saggio possono variare abbastanza a seconda del tipo di proteine presenti.

18 Metodo dell acido bicinconinico BCA- un saggio molto simile a quello di Lowry, con la differenza che il rame(ii) anziché in associazione con il reagente di Folin-Ciocalteau si usa in associazione con l acido bicinconinico. Si ritiene che la riduzione dello ione Cu 2+ a Cu + sia qui seguita dall associazione dello ione rameoso con l acido, con formazione di un complesso che assorbe fortemente a 562 nm (colore viola-blu). Il saggio presenta la stessa variabilità da proteina a proteina già vista per il Lowry, ma è più riproducibile e un po più sensibile. N N O- O O- O Acido bicinconico

19 Metodo di Bradford Si basa sull interazione non-covalente di un colorante (il Coomassie Brilliant Blue R-250) con le proteine. Il saggio viene effettuato a ph acido. Il colorante si lega primariamente ai residui basici ed aromatici, e la formazione di questi complessi determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 a 595 nm, che può essere misurato spettrofotometricamente. Anche se diverse proteine possono dare risposte alquanto diverse in questo saggio, la sua semplicità ed elevata sensibilità (<0.1 mg/ml) fa sì che sia largamente usato. Il Coomassie Blue si usa anche per evidenziare le bande proteiche nella gel elettroforesi. Coomassie Brilliant Blue R-250

20 Silver staining Questa tecnica è usata normalmente per colorare proteine nella gel elettroforesi, nel caso sia richiesta una elevata sensibilità. Assorbimento nel vicino UV La presenza degli anelli aromatici di tirosina e triptofano fa sì che le proteine presentino un assorbimento di luce nel vicino ultravioletto, con massimo a circa 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare varia ovviamente da proteina a proteina (dipende dal numero e dalla posizione degli amminoacidi aromatici), ma in genere può essere calcolato con buona approssimazione partendo dalla sequenza amminoacidica. Va tenuto presente che molte altre sostanze possono assorbire nel vicino ultravioletto, e quindi condizionare i risultati della misura; fra queste gli acidi nucleici, che però hanno un massimo di assorbimento a 260 nm. A volte, nelle prime fasi di purificazione di una proteina, può essere utile verificare il rapporto tra gli assorbimenti a 280 e 260 nm, per verificare se e quanto una data frazione di proteina sia contaminata da acidi nucleici.

21 Assorbimento ultravioletto 280 nm Può rappresentare un ottima tecnica quando non si ha alcuna idea della concentrazione di un campione che deve essere assolutamente recuperato. Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e sensibili; La determinazione si basa sull assorbimento specifico degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano; La misura è soggetta a interferenza da altri componenti cellulari e in particolare acidi nucleici; Il metodo non è molto sensibile e presuppone l uso di cuvette di quarzo; Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e la misura è molto rapida.

22 1. Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone 2. Misurare l assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo 3. Cambiare lunghezza d onda a 260 nm, fare lo zero con acqua o tampone 4. Misurare l assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo 5. Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione proteica [Proteina] (mg/ml) = 1.55*A *A260

23 Peso secco. Mentre la maggior parte dei metodi visti sopra vanno benissimo per misure relative (ad es., per seguire l aumento di attività specifica di un enzima durante la purificazione), quando si vogliano effettuare esperimenti chimici accurati con una proteina pura è necessario misurare direttamente il peso secco di un campione desalinizzato della proteina. La proteina viene dializzata estensivamente contro acqua distillata o contro un tampone volatile (ad es, carbonato d ammonio) e poi disseccata sotto vuoto, a C in presenza di un agente disseccante (ad es., solfato di Ca) finché il peso non si stabilizza (= tutta l acqua è stata rimossa).

24 Metodo Kjeldahl Per lunghi anni, la quantità di proteine (proteina grezza) di alimenti è stata calcolata sulla base del contenuto di AZOTO totale. Il metodo Kjeldahl è d altra parte il metodo di elezione per la determinazione del contenuto di AZOTO. Questo valore viene poi moltiplicato per un fattore per ottenere la quantità di proteine. Questo metodo si basa su due assunzioni: i) carboidrati e grassi alimentari non contengono azoto; ii) la quasi totalità dell azoto presente negli alimenti deriva dagli amminoacidi delle proteine. Sulla base delle prime determinazioni, il contenuto medio di N nelle proteine era di circa il 16% (160g/1000g), che ha portato all uso del calcolo Nx6,25 (1/0,16= 6,25). Tuttavia non tutto l azoto che si può titolare è presente nelle proteine, ma anche in amminoacidi liberi, nucleotidi, creatina e colina. Inoltre, il contenuto di azoto di alcuni amminoacidi (come % in peso) varia in relazione al peso molecolare dell amminoacido ed al numero di atomi di azoto in essi contenuti [da uno a quattro a seconda degli amminoacidi: tutti uno ad eccezione di Lys/ Gln/Asn (2), His (3), Arg (4)].

25 Sulla base di queste considerazione, in realtà il contenuto di N nelle proteine varia da 5,26 (1/0,19) a 7,69 (1/0,13). Gli attuali fattori sono riportati nella seguente Tabella Origine Alimen to Fattore Origine Alimento Fattore Animale Uova 6,25 Vegetale Grano Chicco intero 5,83 Carne 6,25 Crusca 6,31 Latte 6,38 Endosperma 5,70 Vegetale Orzo 5,83 Ricino 5,30 Mais 6,25 Fagioli (vari tipi) 6,25 Miglio 5,83 Soia 7,71 Avena 5,83 Noccioline 5,46 Riso 5,95 Segale 5,83 Sorgo 6,25

26 Metodo Kieldhal (1) Digestione + H 2 SO 4 concentrato + catalizzatore = azoto convertito in ione ammonio. (2) Neutralizzare con NaOH per ottenere NH 3 (3) distillare NH 3 e intrappolare in acido borico. (4) Titolare con acido cloridrico.

27 Espressione dei risultati Calcolare il contenuto di sostanze azotate per 100 g di sostanza secca (s.s.) con la formula: V x N x F x Sostanze azotate % s.s. = E x (100 - U) dove: V = ml di acido 0,1 N (6.9); N = 0, (grammi di azoto corrispondenti a 1 ml di acido 0,1 N); E = peso del campione in grammi; U = umidità percentuale del campione; F = fattore di conversione dell'azoto in sostanze azotate, eguale a: 5,70 per grano e segale; 5,95 per riso; 6,25 per mais e orzo. Il fattore 6,25 viene anche usato nelle etichette nutrizionali e per i prodotti cerealicoli in miscela.

28 Metodo Kjeldhal svantaggi: non tutto l azoto viene dalle proteine. Purine Pirimidine DNA, RNA, ecc. Urea Molti tessuti vegetali contengono > 50% N non proteico % N 6.25 = % Proteina

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