LA RIPRODUZIONE MICROBICA

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1 5 LA RIPRODUZIONE MICROBICA 5.1. INTRODUZIONE Se un microrganismo incontra un ambiente naturale idoneo alla sua crescita o è introdotto in un ambiente artificiale, contenente tutti i fattori nutrizionali di tipo chimico-fisico necessari, attiva i processi biosintetici cellulari che permettono il rapido accrescimento di tutte le componenti che lo costituiscono. Nel momento in cui l entità dei processi biosintetici raggiunge l apice, la cellula comincia a dividersi. Il meccanismo riproduttivo, nella gran parte dei batteri, è costituito essenzialmente dalla scissione binaria, tuttavia in alcune situazioni sono stati evidenziati processi morfologicamente paragonabili alla gemmazione dei lieviti (fig. 5.2). Se come affermò Jacob il sogno di ogni cellula è quello di dividersi, si può convenire che la riproduzione cellulare rappresenta la logica conclusione di tutti i fenomeni biosintetici. Il processo riproduttivo può essere esaminato focalizzando l attenzione: sul singolo elemento cellulare al fine di evidenziarne gli aspetti citologici che ne sono alla base; sulla popolazione cellulare con particolare riferimento agli aspetti numerici. Tale suddivisione ha una finalità esclusivamente didattica, in quanto considera separatamente due aspetti che, in realtà, sono estremamente interconnessi CICLO RIPRODUTTIVO DEI PROCARIOTI Nella singola cellula microbica, prima che avvenga la divisione cellulare, si sviluppano meccanismi d accrescimento derivati da complessi processi biosintetici, che comportano la replicazione del DNA, la sintesi delle proteine, la sintesi della parete e delle altre componenti cellulari. A livello schematico si può considerare che alla base dell accrescimento cellulare ci sia la replicazione del DNA, FIGURA 5.1 Processo di scissione binaria in un batterio lofotrico. È evidenziato il piano di divisione equatoriale. FIGURA 5.2 Due esempi di processi di gemmazione in batteri a forma bastoncellare. 1

2 2 Le basi microbiologiche della Biochimica che nei batteri in pratica è continua e teoricamente illimitata. Questo processo è caratterizzato dalla separazione delle due catene polinucleotidiche del DNA in modo che, ognuna delle due, funga da stampo per la replica di una catena complementare. La conseguenza della replicazione del DNA è la formazione di due catene identiche tra loro e a quella originaria. Il meccanismo replicativo del DNA è relativamente semplice dal punto di vista concettuale, ma di grande complessità se esaminato nella sua dinamica molecolare. Se a livello cellulare la replicazione del DNA è l evento più eclatante, altri fenomeni importanti si svolgono contemporaneamente a essa. I dati ricavati dalle indagini biochimiche e microscopiche confermano che la fase più attiva della sintesi della membrana e della parete si sviluppa contemporaneamente all accrescimento cellulare e alla replicazione del DNA. La neosintesi della membrana, che determina l allontanamento dei due cromosomi, si svolge in direzione centripeta e comporta la formazione di un setto sul piano equatoriale della cellula. A questa fase segue la neosintesi della parete cellulare in direzione centripeta, con la conseguente formazione di una strozzatura, che termina con la divisione della cellula e la formazione di due cellule figlie. L accrescimento parietale si sviluppa secondo due meccanismi differenti: tipo streptococco. È una modalità tipica dei batteri Gram positivi (fig. 5.3); tipo salmonella. È una modalità tipica dei batteri Gram negativi. 1 I dati ricavati mediante l impiego di anticorpi verso i costituenti parietali marcati con fluorocromi, hanno messo in luce nel primo caso una crescita equatoriale, mentre nel secondo una crescita diffusa. Le modalità d accrescimento nei Gram negativi sono state oggetto di discussione per lungo tempo; negli anni 70, furono chiarite definitivamente con un indagine sperimentale che merita di essere citata. Le ricerche furono condotte, in particolare, su due batteri peritrichi come Salmonella typhimurium e Proteus vulgaris. La modalità di crescita della parete è stata chiarita coltivando questi organismi prima a una temperatura di 37 C (che permette una crescita ottimale) e in seguito a 44 C (consente la crescita, ma non la sintesi delle ciglia). Se l accrescimento parietale fosse stato limitato a un area, le ciglia sarebbero state presenti solo nella parte preesistente, mentre sarebbero state assenti in quella neosintetizzata. Si è visto invece che, dopo un incubazione prima a 37 C e poi a 44 C, le ciglia erano diradate, ma presenti in pratica su tutta la superficie cellulare. Ciò dimostrava in modo inequivocabile che l accrescimento parietale di questi microrganismi era distribuito in modo omogeneo su tutta la parete (accrescimento intercalare, fig. 5.4). L orientamento con cui avviene la divisione cellulare condiziona inevitabilmente la modalità di distribuzione degli aggregati cellulari nello spazio: se si mantiene secondo piani paralleli dà origine a raggruppamenti a coppia o a catena, in quest ultimo caso si ha anche la tendenza ad una separazione incompleta tra le cellule figlie (fig. 5.5); se si realizza secondo due piani tra loro perpendicolari dà origine a raggruppamenti a tetrade (fig. 5.6a); se avviene secondo tre piani tra loro ortogonali si producono ammassi cubici come le sarcine (fig. 5.6b); se si sposta secondo piani casuali, rivolti in qualsiasi direzione, si formano ammassi irregolari caratteristici degli stafilococchi (fig. 5.7) FIGURA 5.3 Crescita della parete tipo streptococco o equatoriale. La parete neoformata è rappresentata in azzurro. FIGURA 5.4 Accrescimento tipo Salmonella o intercalare. Anche in questo caso la parete neoformata è rappresentata in azzurro.

3 Capitolo 5. La riproduzione microbica 3 FIGURA 5.7 Se i piani di divisione sono tra loro casuali, si vengono a formare aggregati a grappolo. FIGURA 5.5 Se i piani di divisione sono tra loro paralleli, si formano aggregati a catena. a b FIGURA 5.6 Se i piani di divisione sono tra loro perpendicolari, si formano aggregati a tetrade o a cubo. anomalie replicative anche in Lactobacillus bifidus: questo batterio cresce in modo rapido e con normali processi divisionali nel latte umano, contenente un glucoside dell Nacetilglucosamina (componente parietale fondamentale), mentre nei terreni di coltura si sviluppa a stento e con la formazione di strutture filamentose, talora ramificate. Questi dati nel loro insieme evidenziano il ruolo della parete nella divisione cellulare. I batteri privi della parete cellulare, assumono una forma variabilissima, ma soprattutto hanno la forte tendenza a formare forme globose dotate all interno di numerose aree nucleari. Questo indica una replicazione del DNA, non seguita dalla divisione cellulare. In altre situazioni il DNA è circondato dalla membrana cellulare per formare strutture di ridottissime dimensioni, definite minime unità riproduttive Nelle condizioni presenti in natura la riproduzione microbica è influenzata da numerosi fattori biotici e abiotici dei quali è difficile definire il ruolo specifico. In laboratorio la situazione è completamente diversa, in quanto è possibile tenere costantemente sotto controllo ogni singola condizione ambientale; modificando di volta in volta ognuno dei parametri, possono esserne studiati gli effetti prodotti sulla crescita e definito il ruolo specifico. Le ricerche sviluppate e le conoscenze acquisite sul ruolo di ogni singolo fattore hanno un importante ricaduta pratica, poiché consentono di individuare i parametri nutrizionali e chimicofisici ottimali per la coltivazione di numerose specie microbiche Alcuni batteri appartenenti al genere Actinomycetales, dopo la divisione, producono movimenti post-divisionali che comportano la rotazione delle cellule figlie, con conseguente acquisizione di raggruppamenti a palizzata o a V. Nelle colture di laboratorio, il processo replicativo può assumere anche connotati particolari. In alcuni casi si assiste alla formazione di strutture filamentose delle cellule, che si accrescono dando luogo alla replicazione del DNA, senza che si produca la divisione cellulare. Il processo è ben evidente in Proteus vulgaris, che in vitro origina forme filamentose lunghe fino a 100 μ. Nelle colture si manifestano DINAMICA DELLE POPOLAZIONI MICROBICHE Aspetti matematici Di norma le cellule batteriche si riproducono asessualmente attraverso un processo di scissione (fissione) binaria. Se le condizioni ambientali sono favorevoli, da una singola cellula batterica sono originati due batteri che, a loro volta, si dividono con lo stesso meccanismo originando quattro elementi cellulari; in questo modo ogni singola cellula microbica dà origine a una popolazione che presenta un incremento di tipo esponenziale (fig. 5.8). La dinamica del processo può essere descritta dalla seguente relazione: N = 2n

4 4 Le basi microbiologiche della Biochimica Log della popolazione cellulare Tempo espresso in minuti risulta che n = logn Fin- logn 0 log2 Inoltre il tempo di generazione G) sarà: t G = n Ove t è il tempo intercorso, mentre n è il numero di generazioni prodotte. Se, ad esempio, il tempo intercorso è 6 h (360') ed il numero di generazioni 18, il tempo di generazione si ottiene in queto modo: G = 360' = 20' 18 mentre il tasso o velocità di crescta sarà: Popolazione cellulare Tempo espresso in minuti FIGURA 5.8 Rappresentazioni diagrammatiche dell accrescimento di una popolazione batterica in funzione del tempo. in cui N rappresenta il numero degli elementi di una popolazione, mentre ( n ) rappresenta il numero delle generazioni. prodotte. Nel caso di 6 generazioni il numero degli elementi cellulari originati da un unica cellula è costituito da: N = 2 6 = 64 Qualora il numero della popolazione iniziale sia uguale a N 0, la popolazione finale (N Fin ) sarà costituita da: N Fin = N 0 2 n Se la popolazione iniziale è costituita ad esempio da unità, dopo 6 generazioni avrà raggiunto il seguente valore: N Fin = N Fin = N Fin = = 1, Inoltre, note la popolazione iniziale e quella finale, è possibile calcolare il numero di generazioni (n) in quanto se: 2 n = N N fin 0 T = cioè il numero delle generazioni nell unità di tempo. Se ad esempio il tempo intercorso nella misurazione è di 6 h e il numero delle generazioni prodotte 18, il tasso (velocità) di crescita (T) all ora eqivale a: n t T = 18 = 3 6 pertanto in questa situazione il tasso di crescita, espresso come numero di generazioni all ora, equivale a DETERMINAZIONI QUANTITATIVE Le determinazioni quantitative dei microrganismi presenti in un campione, assumono un importanza rilevante in molte situazioni; si eseguono, ad esempio, per evidenziare l efficacia dei terreni di coltura e il ruolo dei singoli parametri di tipo chimico-fisico, per costruire una curva di crescita, per dosare le vitamine e gli aminoacidi in un prodotto, per determinare gli indici di contaminazione di un alimento. Una popolazione microbica può essere quantificata nella sua totalità (carica microbica complessiva o totale) o nelle sue componenti specifiche. Nel primo caso i microrganismi presenti sono determinati nel loro complesso, mettendoli in condizioni di crescere in terreni di coltura generale. Questo tipo di determinazione è del tutto teorica, poiché ogni microrganismo ha le sue esigenze nutrizionali e difficilmente quelle di tutti i microrganismi possono essere soddisfatte da un solo substrato nutrizionale. Nel secondo caso si quantificano i gruppi microbici dotati di particolari proprietà (carica microbica specifica). Piuttosto che ricercare i germi patogeni, spesso si ricercano i cosiddetti indici microbiologici, che sono di più agevole riscontro; un esempio di notevole importanza è rappresentato dai cosiddetti indici di contaminazione fecale, che si dimostrano molto sensibili e utili nella determinazione della qualità igienica di diversi prodotti alimentari e dell acqua. Tra gli indici di contaminazione fecale assumono una particolare importanza i coliformi totali, i coliformi fecali, gli enterococchi ed i clostridi solfitoriduttori.

5 Capitolo 5. La riproduzione microbica Prelievo, trasporto e trattamento del campione Le determinazioni quantitative sono eseguite su campioni umani, animali, vegetali e ambientali. Qualunque sia la provenienza, il campione deve possedere corretti requisiti statistici e microbiologici; in particolare deve essere ottenuto in modo casuale e la sua dimensione complessiva (massa o numero) deve essere rappresentativa del materiale da cui proviene. Il prelievo deve essere eseguito in condizioni d assoluta asepsi, evitando che in questa fase alla flora microbica naturalmente presente si aggiungano microrganismi diversi da quelli esaminati; al contempo il trattamento del campione deve essere appropriato onde evitare che siano danneggiati quelli presenti. Ad esempio, dovendo prelevare acqua di fonte, si deve sterilizzare alla fiamma l apertura del rubinetto, su cui si esegue la ricerca, e far scorrere l acqua per almeno un minuto. Il trasporto in laboratorio deve essere rapido e a temperature basse, onde impedire che i microrganismi si riproducano e che quindi si modifichi il contenuto microbico originario. Nel caso di campioni d acqua, tra il prelievo e il controllo microbiologico devono intercorrere poche ore e la temperatura del mantenimento non deve essere superiore ai 4-6 C. Il campione, una volta pervenuto in laboratorio, deve subire un trattamento idoneo al tipo d esame richiesto; in particolare se compatto (carne, pesce, ecc.) deve essere sottoposto a omogeneizzazione per ottenerne una sospensione. Dopo questa fase, spesso è necessario ricorrere all approntamento di diluizioni del campione. In questo caso devono essere impiegati diluenti, come ad esempio la soluzione isotonica e la soluzione di Ringer, che mantengono vitali i microrganismi presenti, senza che ne sia alterato il numero; deve essere evitato l impiego d acqua distillata e d acqua peptonata in quanto possono comportare, per motivi diversi, modificazioni della concentrazione microbica. I parametri microbiologici possono essere ricercati con diverse metodologie, la scelta di quella più idonea dipende essenzialmente dalle specifiche necessità. Schematicamente in laboratorio si ricercano: il numero degli elementi cellulari; la massa cellulare Determinazione del numero L esame che fornisce parametri quantitativi sulla flora microbica di un campione, è definito determinazione della carica microbica. Tale valutazione può essere ottenuta mediante metodologie fisiche o biologiche. Il significato delle due determinazioni è piuttosto diverso. Con le metodologie fisiche sono quantificati tutti gli elementi cellulari presenti nel campione, indipendentemente dal grado di vitalità. Con le metodologie biologiche, invece, sono presi in considerazione solo gli elementi cellulari in grado diriprodursi Conta fisica o totale Il conteggio fisico del numero degli elementi cellulari presenti in un campione può essere eseguito con diverse metodologie. Le principali sono: il conteggio microscopico, con la camera contaglobuli tipo Bürker o Thoma-Zeiss, e il conteggio con i contatori eettronici. Conteggio microscopico con camere contaglobuli FIGURA 5.9 Rappresentazione schematica della camera di Bürker con le relative componenti. 1) superficie del reticolo; 2) solco delimitante il rialzo centrale; 3) piano d appoggio del coprioggetti; 4) supporto della molletta; 5) molletta. Conta fisica o totale Conteggio microscopico con contatori elettronici a. Camere contaglobuli Sono costituite da piccole lastre di vetro, portanti al centro un rialzo rettangolare suddiviso in due superfici. Su ognuna delle superfici è inciso un fine reticolo. Il rialzo centrale è limitato a ognuno dei due lati maggiori da un solco; lateralmente a ogni solco è posto il piano d appoggio del vetrino coprioggetti, sollevato rispetto al piano del reticolo di 0,1 mm. Più esternamente sono posti i supporti di due mollette, che assicurano la perfetta aderenza del vetrino coprioggetti. In commercio esistono diversi tipi di camere contaglobuli; una delle più utilizzate è la camera di Bürker (figg. 5.9 e 5.10), impiegata soprattutto nella determinazio- Conta microbica Conta fisica o totale Conta biologica o vitale FIGURA 5.10 Camera di Bürker.

6 6 Le basi microbiologiche della Biochimica 1 mm 1/25 mm 2 1/100 mm 2 1/400 mm 2 Per il conteggio degli elementi cellulari si allestisce un idonea diluizione della sospensione microbica (ad esempio 1/100), che si depone in corrispondenza del bordo del vetrino coprioggetto. Per capillarità la sospensione si distribuisce sulla superficie incisa; dopo aver atteso la deposizione degli elementi cellulari sul reticolo, si contano le unità poste in non meno di cinque quadrati grandi o in non meno di venti rettangoli o quadrati piccoli. Nel calcolo del numero degli elementi cellulari presenti in ogni area, si contano solo gli elementi situati all interno delle linee e quelli presenti su due linee contigue, poste sempre nella stessa posizione (figg. 5.13a,b). Si calcola quindi il numero medio presente su un quadrato grande o su un rettangolo. FIGURA 5.11 Bürker. Caratteristiche del reticolo presente nella camera di ne del numero degli elementi figurati del sangue. Il reticolo della camera di Bürker delimita una superficie con un area di 9 mm 2 suddivisa in nove quadrati; ognuno di essi possiede un area di 1 mm 2 ed è delimitato da tre linee ravvicinate. Ogni mm 2 a sua volta è suddiviso da coppie di incisioni ortogonali in: quadrati grandi, quadrati piccoli e rettangoli. I quadrati grandi occupano un area di 1/25 di mm 2, i quadrati piccoli un area di 1/400 di mm 2 ed i rettangoli un area di 1/100 di mm 2 (figg e 5.12). a 1 mm FIGURA 5.12 Bürker. Modalità di suddivisione di ogni mm 2 della camera di b FIGURA 5.13 Nella determinazione del numero delle cellule si prendono in considerazione tutti gli elementi contenuti totalmente all interno delle linee delimitanti l area di riferimento e gli elementi collocati su due lati contigui. Si considerano soltanto e sempre i lati posti nella stessa posizione. Nel caso illustrato sempre il lato in alto e quello a destra.

7 Capitolo 5. La riproduzione microbica 7 A questo punto, per ottenere il numero dei microrganismi per mm 2, si moltiplica il valore medio ottenuto per l inverso della frazione di mm 2 occupata dalla superficie presa in considerazione ( 25, 100). Si calcola quindi il numero per mm 3. Poiché la distanza tra il reticolo e il vetrino coprioggetti è 1/10 di mm, il volume sul quale è determinato il conteggio corrisponde a 1/10 di mm 3. Moltiplicando per 10 si ottiene il numero degli elementi cellulari presenti in un mm 3. Il prodotto del valore ottenuto per 10 3, consente la determinazione del numero per cm 3 (cc). Consideriamo ora una situazione pratica. Avendo approntato una diluizione 1/100 di un campione, si determini il numero complessivo degli elementi cellulari presenti su un cc. Se dal conteggio degli elementi cellulari presenti sui quadrati grandi scelti a caso sono stati ottenuti ad esempio i seguenti risultati: 1) 17 2) 13 3) 16 4) 14 5) 15 si calcola il valore medio per quadrato dividendo la somma ottenuta per il numero dei quadrati (cinque) prei in considerazione: N = = Si calcola, quindi, il numero di elementi cellulari in 1 mm moltiplicando il valore medio per l inverso della frazione di mm 2 relativa alla superficie scelta nella determinazione; in questo caso (1/25 25): Nmm 2 = = 375 Si calcola il numero delle cellule in 1 mm 3 ; dato che la distanza tra il reticolo e il vetrino coprioggetti è 1/10 di mm il valore precedentemente determinato (375) è relativo al volume di 1/10 di mm 3. Quindi si moltiplica per 10: N/mm 3 = = 3750 = 3, Qualora sia richiesto il numero degli elementi cellulari per cc, si moltiplica il valore precedentemente ottenuto per 10 3 : N/cc = 3, = 3, Dato che è stata approntata una diluizione, il valore ottenuto dovrà essere moltiplicato per l inverso della diluizione; nel caso dell esempio riportato, la diluizione è stata 1/100, quindi il valore ottenuto in precedenza deve essere moltiplicato per 100 (10 2 ). N campione = 3, = 3, Nel campione di partenza il numero complessivo di microrganismi presenti è pertanto: 3, Riassumendo il numero complessivo degli elementi cellulari presenti nel campione esaminato si ottiene in questo modo: N campione = N medio 1/frazione dell area contata /dil N campione = = 3, FIGURA 5.14 Schema di contatore elettronico: il passaggio di un elemento cellulare determina l interruzione del fascio elettronico e viene trasformato in valore numerico. Questo tipo di determinazione è relativamente semplice e soprattutto immediata; tuttavia perché sia corrispondente alla realtà è necessario che sia approntata un idonea diluizione del campione e che le operazioni siano eseguite in modo corretto. Come tutte le determinazioni fisiche, il conteggio con la camera contaglobuli non fornisce indicazioni circa la vitalità degli elementi cellulari esaminati, per cui il suo impiego è modesto b. Contatori elettronici In alternativa alle determinazioni microscopiche possono essere impiegati i contatori elettronici (fig. 5.14); con tali strumenti si contano migliaia di cellule in pochi secondi. Nella conta elettronica il campione è opportunamente diluito e inviato attraverso un capillare in uno spazio situato tra due elettrodi. Ogni elemento cellulare che attraversa questo spazio interrompe il fascio elettronico; ogni interruzione è rilevata da un apposito sensore e trasformata in valore numerico. La corrispondenza tra il numero degli elementi cellulari e il numero dei segnali prodotti è garantita dalla diluizione e dal fatto che il conteggio è eseguito su un capillare, in cui gli elementi cellulari tendono a disporsi isolatamente. Anche i contatori elettronici sono impiegati in modo limitato nelle determinazioni microbiologiche; sono poco precisi, in particolare, se si opera con cellule di piccole dimensioni, quali quelle batteriche Conta biologica È largamente utilizzata, poiché fornisce i dati più significativi. Comprende diverse metodologie; le più impiegate sono quelle che consentono la determinazione delle unità microbiche in grado di riprodursi e di formare le colonie (UFC o Unità Formanti Colonie) per piastrazione. Il presupposto di partenza è convenzionale, in quanto si assume che ogni colonia derivi da un singolo elemento microbico (figg. 5.15, 5.16 e 5.17). La determinazione richiede sempre campioni in sospensione. Nell eventualità siano compatti, i campioni esaminati devono essere omogeneizzati, impiegando soluzione di

8 8 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 5.15 Deposizione del campione liquido. N UFC camp/ml = 25 1/ 0,1 = = 1250 La situazione tuttavia non è mai così semplice. Ad esempio spesso il numero dei batteri è talmente elevato, che anche la semina di piccole quantità dei campioni comporta la crescita confluente delle colonie; questo non permette di ricavare dati quantitativi di qualche significato. Approntando diluizioni a scalare di 10 in 10, è possibile ottenere, tra le diverse diluizioni, una che fornisca dati interpretabili. In altre situazioni la carica microbica è talmente bassa, che solo impiegando grandi quantità della sospensione può essere ottenuto un numero significativo di colonie. In tal caso sono impiegate apparecchiature dotate di membrane filtranti con una porosità di circa 0,45 μ. Con questa metodica tutti gli organismi dotati di una struttura cellulare (batteri, lieviti, protozoi, ecc.) possono essere trattenuti tra le maglie delle membrane stese e in seguito contati. Conteggio delle UFC in piastra Carica microbica elevata Carica microbica bassa Conteggio dopo diluizioni a scalare Conteggio dopo semina diretta Conteggio dopo filtrazione su membrana FIGURA 5.16 Deposizione dell agar fuso ad una temperatura di C. FIGURA 5.17 Conteggio del numero delle colonie mediante apparecchio contacolonie dopo una fase di incubazione. Ringer, soluzione isotonica o acqua peptonata. Dalle sospensioni, devono essere allestite colture in piastra sulle quali si determina il numero delle colonie formate dopo un opportuna incubazione. Se sono stati seminati 0,1 ml di un campione liquido e si ottengono 125 colonie, il numero complessivo delle stesse presenti su un ml del campione è ottenuto moltiplicando il numero delle colonie per il reciproco della quantità seminata e cioè: a. Conteggio dopo diluizioni a scalare È una metodologia utilizzata su campioni liquidi o compatti sottoposti a omogeneizzazione (carne, prodotti ittici, ecc.) con carica microbica piuttosto elevata. Procedendo a una serie di diluizioni a scalare, si ottiene una progressiva diminuzione della concentrazione microbica, che consente la crescita isolata delle colonie. In seguito, con opportuni calcoli matematici, è possibile risalire alla carica microbica del materiale di partenza. Il procedimento di lavoro è relativamente complesso e richiede una serie di operazioni che, eseguite in condizione di sterilità, possono essere riassunte in questo modo: approntamento delle diluizioni; semina in piastra; incubazione; lettura dei risultati; calcolo del numero delle UFC/ml. Approntamento delle diluizioni. Dopo aver accuratamente mescolato il campione con pipetta sterile (figg. 5.18a,b), se ne trasporta 1 ml in una provetta contenente 9 ml di diluente sterile (soluzione isotonica, soluzione di Ringer o acqua peptonata). Si cambia pipetta, si mescola e si ottiene una prima diluizione: 1/10 (10 1 ). Si trasporta 1 ml dalla prima diluizione a una seconda provetta, contenente ancora 9 ml di diluente sterile: 1/100 (10 2 ); si cambia ancora pipetta, si mescola accuratamente e si ottiene la seconda diluizione. Si procede nello stesso modo fino a raggiungere diluizioni idonee al campione esaminato e al tipo d esame richiesto. Negli alimenti molto contaminati è necessario raggiungere diluizioni fino a Semina in piastra. Dopo aver approntato le diluizioni si procede alla loro semina in una serie di piastre contenenti un agar nutritivo (fig. 5.18c), idoneo al tipo di microrganismo esaminato. Se si ricerca la carica microbica complessiva, è impiegato un terreno a uso generale, pertanto non selettivo, come ad esempio il plate count agar che permette la crescita di forme microbiche batteriche e funginee più disparate. Se, al contrario, è ricercata la carica di gruppi mi-

9 Capitolo 5. La riproduzione microbica 9 a b c d e FIGURA 5.18 Alcune fasi dell allestimento delle colture per la determinazione della carica microbica mediante diluizioni a scalare. crobici specifici, devono essere impiegati terreni di coltura selettivi adatti al germe ricercato. Se si esegue la semina in superficie, sul terreno devono essere seminati 0,1-0,2 ml delle singole diluizioni, cambiando di volta in volta la pipetta impiegata nel trasporto. Il quantitativo deposto, è disteso mediante una spatola (figg. 5.18d,e) sterilizzata alla fiamma e opportunamente raffreddata. Si può ricorrere anche alla semina in agar fuso; in tal caso si depone 1 ml di ogni diluizione sul fondo delle piastre impiegate e si ricopre con l agar fuso. Per evitare danni ai microrganismi s impiegano terreni agarizzati raffreddati a una temperatura compresa tra 42 e 45 C; si mescola accuratamente e, prima dell incubazione, si attende il raffreddamento dell agar. Incubazione. Dopo l asciugatura delle superfici seminate o il raffreddamento dell agar fuso, le piastre vengono chiuse e poste in camera di incubazione dopo essere state rovesciate per impedirne la disidratazione. Le temperature e i tempi d incubazione dipendono dalle specie microbiche ricercate. Lettura dei risultati. Terminata l incubazione, le piastre sono esaminate una ad una. Tra esse, se si tratta di lieviti, viene scelta quella con un numero di colonie comprese tra le 15 e le 150; se si tratta di batteri, quella che ne contiene tra le 30 e le 300. La lettura può essere eseguita mediante osservazione diretta o con l aiuto di strumenti contacolonie (fig. 5.19), che facilitano il conteggio delle UFC presenti. Calcolo delle UFC del campione. A questo punto si può risalire al numero presuntivo delle UFC del campione. In pratica i dati occorrenti in questa determinazione sono: il numero delle UFC contate in piastra; la diluizione a cui è stato eseguito il conteggio (dil.); la quantità seminata (q.s.). Se il campione di partenza è costituito da materiale compatto, deve essere tenuta in considerazione l entità FIGURA 5.19 Apparecchio contacolonie.

10 10 Le basi microbiologiche della Biochimica PRINCIPALI FASI DELLA METODOLOGIA DELLA DILUIZIONE A SCALARE DI 10 IN 10 DILUIZIONI A SCALARE 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml Campione 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml SEMINA IN PIASTRA INCUBAZIONE (Tempi e colture specifiche per ogni tipo di microrganismo ricercato) ESAME DELLE COLTURE ED ELABORAZIONE MATEMATICA FIGURA 5.20 Tecnica delle diluizioni a scalare di 10 in 10. Il campione in esame è adeguatamente miscelato. Un ml della sospensione ottenuta è trasferito in una provetta contenente 9 ml di diluente sterile. Si cambia pipetta, si mescola e si ottiene una diluizione 1/10 (10 1). Si mescola, si trasferisce 1 ml dalla diluizione 1/10 ad una seconda provetta, si cambia pipetta, si mescola e si ottiene una diluizione 1/100 (10 2). Si continua fino a raggiungere le diluizioni idonee al tipo di campione esaminato (negli alimenti si giunge fino a ). Conclusa la diluizione si passa alla semina in superficie dell agar (0,1 ml) o in agar fuso a 45 C (1 ml). Si pongono le piastre seminate in incubazione secondo i tempi e le temperature richieste dai gruppi microbici ricercati. Si contano le colonie scegliendo la piastra contenente colonie (se lieviti) o colonie (se batteri). Si risale al numero delle UFC del campione in rapporto al numero di colonie contate, alla diluizione a cui è stata eseguita la conta ed alla quantità seminata. della diluizione necessaria per fluidificarlo e approntarne le diluizioni. L omogeneizzazione è ottenuta aggiungendo, a un determinato volume (peso) del campione, un volume triplo del diluente; in questo modo, pertanto, è ottenuta una diluizione ¼. Consideriamo ora come esempio esplicativo la seguente Imbuti filtranti FIGURA 5.21 Beuta per la raccolta del filtrato Sistema di filtrazione su membrana. Pompa aspirante

11 Capitolo 5. La riproduzione microbica 11 a b d c FIGURA 5.22 Alcune fasi della determinazione della carica microbica con la filtrazione. situazione: alla diluizione 10 3 sono state determinate 105 colonie batteriche; il campione di provenienza era compatto e la semina è stata eseguita in superficie con 0,1 ml della sospensione. N UFC camp/ml = 105 1/qs 1/dil 4 N UFC camp/ml = 105 1/0,1 1/ N UFC camp/ml = N UFC camp/ml = = 4, N UFC camp/ml = 4, Il campione esaminato ha una concentrazione di microrganismi equivalente a 4, UFC/ml. Il valore determinato è naturalmente del tutto orientativo. Questa metodologia è piuttosto sensibile e in grado di rivelare anche concentrazioni microbiche molto modeste. È influenzata dalle modalità con cui si opera; per una maggiore affidabilità dei risultati è opportuno eseguire controlli in doppio. È largamente impiegata nella determinazione della carica microbica di molti alimenti come carne, latte e pesce (fig. 5.20) b. Conteggio dopo filtrazione È una metodologia largamente impiegata nella determinazione della carica di campioni liquidi a bassa concentrazione microbica. Richiede un apparecchiatura (fig. 5.21) costituita da una pompa aspirante, collegata a un supporto sormontato da una serie di imbuti sterili, al cui interno sono poste le membrane filtranti (fig. 5.22a). Durante la filtrazione, il liquido esaminato è aspirato attraverso le stesse e raccolto all interno di una beuta. Gli imbuti (figg. 5.22b,c) e le membrane filtranti devono essere necessariamente sterili;

12 12 Le basi microbiologiche della Biochimica per questo motivo ora si utilizzano membrane monouso sterili, oltre che imbuti termoresistenti i quali, di volta in volta, devono essere sottoposti a un ciclo di sterilizzazione in autoclave a 121 C per 15'-20'. L elemento fondamentale del sistema è costituito da membrane filtranti dotate di una porosità di circa 0,45 μ. Consentono la filtrazione di grandi quantità di liquidi, trattenendo tra le proprie maglie i microrganismi contenuti. Le membrane poste su appositi substrati nutrizionali (fig. 5.22d) e incubate per tempi e temperature adeguati, permettono la crescita dei microrganismi sotto forma di colonie di cui può essere determinato il numero. Per raggiungere un simile risultato, le membrane devono essere posizionate sulla superficie di terreni agarizzati al termine della filtrazione o, in alternativa, su dischi assorbenti imbevuti di un terreno nutrizionale adatto. Si procede quindi a un incubazione protratta per i tempi e le temperature adeguati alla crescita delle specie ricercate. Le sostanze nutritive, diffondendosi per capillarità attraverso le membrane, consentono la proliferazione microbica con la formazione di colonie visibili. Per calcolare il numero delle UFC contenute nel volume unitario del campione (1 ml), si divide il numero delle colonie contate per il volume filtrato espresso in ml. La filtrazione permette l esame di elevati volumi di liquido, purché sia presente un quantitativo piuttosto basso di materiale in sospensione. Nel caso contrario le membrane filtranti si otturerebbero in breve tempo e porterebbero alla formazione di patine, con la conseguente difficoltà di quantificare il numero effettivo delle colonie microbiche. Se la concentrazione microbica è elevata si ha la crescita di un numero eccessivo di colonie sulle membrane filtranti; in tale situazione, prima della filtrazione si deve procedere a una diluizione a scalare di 10 in 10. In questo caso il numero delle UFC/ml del campione è determinato dividendo TABELLA 5.1. Tabella per il calcolo del numero più probabile (MPN) Numero dei tubi positivi su Limiti fiduciali al 95% MPN per 100 ml 3 da 10 ml 3 da 1 ml 3 da 0,1 ml Inferiori Superiori , , ,

13 Capitolo 5. La riproduzione microbica 13 Lactose broth (LB) Estratto di carne g 3 Peptone 5 Lattosio 5 NaCl 5 Acqua distillata ml 1000 ph finale 6,9 Brilliant green bile 2% broth (BGBB) Peptone g 10 Lattosio 10 bile di bue (purificata) 20 verde brillante 0,0133 acqua distillata ml 1000 ph finale 7,4 il numero delle UFC contate sulla membrana per il volume filtrato e, poiché è stata effettuata una diluizione, moltiplicando il valore ottenuto per l inverso del fattore di diluizione. Consideriamo il seguente esempio: sulla membrana filtrante sono state rilevate 80 UFC, provenienti da un volume filtrato di 100 ml dopo una diluizione 1/10. Il numero delle UFC del campione/ml sarà pertanto: N UFC camp/ml = UFC: volume filtrato (1/dil) N UFC camp/ml = 80 : 100 1/10 1 N UFC camp/ml = 80 : N UFC camp/ml = 8 Questa metodologia è impiegata nella determinazione della carica microbica nell acqua e in altri liquidi che, per loro natura, presentano un contenuto di materiale in sospensione molto basso. È particolarmente indicata nella ricerca della carica delle specie microbiche contenute a basse concentrazioni. Assume particolare importanza nella determinazione dei cosiddetti indici di contaminazione fecale (coliformi totali, coliformi fecali, enterococchi, clostridi solfitoriduttori) c. Conta biologica in terreni liquidi Con questa metodologia si ricerca lo sviluppo dei microrganismi in terreni di coltura liquidi, esaminandone la comparsa della torbidità e di particolari caratteristiche metaboliche. È impiegata insieme al metodo delle membrane filtranti nella ricerca dei coliformi totali e fecali nelle acque o in diversi alimenti come latte e carne; in questo caso il terreno di coltura impiegato è il brodo lattosato (LB). Esistono essenzialmente due metodiche che permettono di quantificare i coliformi totali. Prenderemo in considerazione la metodica semplificata, che assume il significato di presunta contaminazione fecale. Nel procedimento di lavoro, sono impiegate tre serie di provette con 10 ml di brodo lattosato (a doppia concentra- Semina del campione In sospensione 10 ml del campione + 10 ml di brodo lattosato a doppia concentrazione 1 ml del campione + 10 ml di brodo lattosato 0,1 ml del campione + 10 ml di brodo lattosato Incubazione a 36 C per h Lettura dei risultati (sono positivi i tubi con presenza di gas nella campanella) FIGURA 5.23 Metodo dell MPN (Most Probable Number). Il calcolo si ottiene consultando l apposita tabella.

14 14 Le basi microbiologiche della Biochimica zione nella prima serie di tre provette), contenenti campanelle di vetro Durhan. Ogni serie è seminata con quantità decrescenti del campione su base decimale: nella prima serie di provette sono seminati 10 ml del campione, 1 ml nella seconda serie, 0,1 ml nella terza serie. Di ciascuna delle tre serie, dopo incubazione a 37 C per 24 ore, si rileva il numero delle provette positive (con produzione di gas che si accumula nella campanella). In base alla sequenza numerica ottenuta, si determina su un apposita tabella il numero più probabile (Most Probable Number) in un volume del campione, in relazione al fattore di diluizione. Nell esempio riportato dallo schema relativo alla figura 5.23, alla combinazione di tre tubi positivi nella prima serie (3), due nella seconda serie (2) e uno nella terza serie (1), corrisponde un valore di MPN di 150 coliformi totali. La prova con LB è da considerare di tipo presuntivo. I tubi positivi (con presenza di gas) devono essere sottoposti a prova di conferma in brodo lattosio bile verde brillante (vedi a lato la composizione dei terreni LB e BGBB) mediante incubazione a 36 C per h. Sulla base delle positività si riporta il valore come MPN/100 ml del campione Determinazione della massa La valutazione quantitativa di una popolazione microbica può essere condotta con metodologie che, in alternativa alla determinazione del numero degli elementi cellulari, ricercano la massa o sono in relazione con la stessa Determinazione del peso secco La determinazione del peso secco è utilizzata prevalentemente nella microbiologia industriale; in questo tipo di determinazione il materiale microbico deve essere accuratamente lavato e sottoposto a essiccamento in stufa a secco a 100 C, per eliminare completamente l acqua presente. Una volta completata la disidratazione, si calcola il peso secco espresso in mg/ml di sospensione Determinazione turbidimetrica Tra le metodologie che permettono di calcolare la massa microbica, quella turbidimetrica è la più impiegata. Questa metodologia operativa può essere riassunta nel modo seguente: le cellule presenti in sospensione producono una torbidità, per l assorbimento della luce, proporzionale alla massa microbica presente; di conseguenza la luce che oltrepassa una sospensione di microrganismi è tanto più bassa quanto più alta è la concentrazione del materiale microbico (fig. 5.24). Con tecniche spettrofotometriche e turbidimetriche è possibile quantificare la torbidità delle colture. Oc cor re ricordare che le misurazioni effettuate sono soggette a notevoli variazioni in rapporto alla dimensione, alla forma e allo stato degli aggregati cellulari. La lettura ottimale si ha con un numero delle cellule/ml compreso tra 10 7 e ; entro questi valori esiste una corrispondenza tra la densità ottica (torbidità) e la massa cellulare (mg di peso secco/ml). Non esiste, invece, un rapporto tra torbidità e numero di cellule microbiche in sospensione LA CURVA DI CRESCITA MICROBICA La dinamica di una popolazione microbica, introdotta in un terreno di coltura adatto alla sua proliferazione, segue un andamento caratteristico in cui sono evidenziabili alcune fasi che, nel loro complesso, sono indicate come curva di crescita. Per la costruzione di tale curva sono necessarie rilevazioni scaglionate nel tempo, derivate dall applicazione dei metodi biologici e fisici descritti in precedenza. È evidente che la curva ottenuta, impiegando metodologie fisiche come quelle che misurano la massa, è diversa da quella basata sulla determinazione del numero delle UFC. Il riferimento che si è preso in considerazione in questa sede è basato su determinazioni, a scadenze fisse, del numero delle UFC. I dati numerici ottenuti sono stati espressi come valori logaritmici e riportati nelle ordinate Lo strumento è regolato al 100% della trasmittanza Sorgente luminosa Filtro monocromatore Provetta con acqua distillata Fotocellula La lettura sullo strumento fornisce valori inferiori al 100%; più torbida è la sospensione, più basso è il valore della lettura Sorgente luminosa Filtro monocromatore Provetta contenente la sospensione microbica Fotocellula FIGURA 5.24 Schema rappresentativo del metodo turbidimetrico.

15 Capitolo 5. La riproduzione microbica 15 Logaritmo N. elementi cellulari/ml A B C D E F G H Tempo in ore FIGURA 5.25 Rappresentazione diagrammatica della curva di crescita batterica. A) latenza; B) crescita della popolazione; C) crescita esponenziale; D) rallentamento della crescita; E) fase stazionaria; F) iniziale decremento; G) rapido decremento; H) estinzione. di un sistema d assi cartesiani nelle cui ascisse sono inseriti, invece, i tempi in cui sono state effettuate le singole determinazioni. L andamento della curva di crescita (fig. 5.25) di ogni popolazione microbica evidenzia otto fasi: latenza, crescita della popolazione, crescita esponenziale, rallentamento della crescita, fase stazionaria, decremento della popolazione, decremento rapido ed estinzione. Latenza. In questa fase si ha un adattamento dei microrganismi alle nuove condizioni ambientali. Non si ha una variazione significativa della popolazione microbica; gli elementi cellulari sono in una fase in cui si ha un attiva biosintesi ed un aumento del contenuto degli acidi nucleici. Crescita della popolazione. Le cellule cominciano a dividersi; il numero dei microrganismi prodotti supera quelli morti. Si ha un iniziale incremento della popolazione microbica. Crescita esponenziale. In questa fase si raggiunge la massima velocità di crescita. La popolazione aumenta con una progressione geometrica, in quanto tutti gli elementi cellulari sono in replicazione. A questo punto può essere determinato il tempo medio di generazione, che è influenzato dalla composizione del terreno di coltura ed è proprio di ogni specie microbica. Escherichia coli, nei terreni di coltura non selettivi, presenta un tempo medio di generazione di 20 minuti a 37 C; Mycobacterium tubercolosis, invece, alla stessa temperatura si riproduce in circa 12 ore. Con si de rando che gran parte delle specie batteriche ha un tempo medio di generazione di minuti, può essere facilmente rilevato che, con una dinamica del genere, una specie batterica dopo 24 ore raggiungerebbe 72 generazioni e una popolazione complessiva di miliardi di miliardi di unità e 150 tonnellate di massa batterica secca. Gli incrementi successivi porterebbero a valori teorici assolutamente impensabili. Rallentamento della crescita. In condizioni normali l aumento della popolazione microbica causa un impoverimento dei nutrienti e un accumulo di sostanze di rifiuto che, in breve tempo, limitano l incremento della popolazione. Fase stazionaria. Alla fine del rallentamento della crescita la popolazione raggiunge la massima concentrazione e, per un tempo limitato, si mantiene in equilibrio numerico. In questa fase il numero degli elementi cellulari che muore controbilancia il numero degli elementi cellulari di nuova formazione. Da questo punto in poi si evidenzia una sostanziale differenza tra le determinazioni biologiche e quelle fisiche. Tutte le metodologie fisiche, come il conteggio numerico, la turbidimetria o il calcolo della massa, portano a valori più elevati rispetto a quanto calcolato con le metodologie biologiche. Ciò è conseguente al fatto che nelle determinazioni fisiche sono contate tutte le cellule, indipendentemente dalla loro vitalità. Iniziale decremento. La popolazione cellulare inizia a decrescere con una velocità progressivamente crescente. Il numero delle cellule che muore a questo punto supera il numero delle cellule riprodotte. Rapido decremento. È una fase in cui si ha una rapida diminuzione della popolazione. Estinzione. È la fase in cui si raggiunge la morte completa della popolazione microbica. Una parte delle cellule batteriche va incontro all autolisi e gli elementi morti non sono compensati dalla produzione di nuovi elementi cellulari. La progressione verso la sterilizzazione della coltura procede molto lentamente, tanto che l estinzione completa (variabile in rapporto alla specie batterica e al tipo di terreno impiegato) richiede diverse settimane e, in alcune condizioni, mesi o anni (Mycobacterium tubercolosis). È inoltre chiaro che nel caso dei batteri sporigeni la sterilizzazione della coltura non è raggiungibile.

16 16 Le basi microbiologiche della Biochimica QUESITI DEL CAPITOLO 5 1) Qual è il comune meccanismo riproduttivo dei batteri? 2) Quali sono i principali eventi che si presentano durante la crescita cellulare? 3) Si illustri la modalità dell accrescimento parietale tipo streptococco. 4) Si illustri la modalità dell accrescimento parietale tipo salmonella. 5) In che modo l orientamento del piano di divisione influenza la distribuzione degli aggregati cellulari? 6) Se una popolazione batterica è formata da unità, qual è la sua entità dopo 10 generazioni? 7) Se una popolazione microbica è costituita da unità e si riproduce per scissione binaria ogni 30 minuti, quali dimensioni numeriche raggiunge dopo 24 ore? 8) Quali accorgimenti devono essere adottati al momento del prelievo del campione, se devono essere eseguiti controlli microbiologici di tipo quantitativo? 9) Quali accorgimenti devono essere adottati durante il trasporto in laboratorio per eseguire controlli microbiologici di tipo quantitativo? 10) Che cosa s intende per conta fisica (o totale) e per conta biologica? 11) Per quale motivo sono preferibili le determinazioni biologiche rispetto a quelle fisiche? 12) Si descriva la camera contaglobuli di Bürker. 13) Si illustri la tecnica per il conteggio numerico mediante la camera contaglobuli di Bürker. 14) Che cosa s intende per UFC? 15) Che cosa s intende per carica microbica complessiva e per carica microbica specifica? 16) Si descriva la modalità di determinazione della carica microbica mediante il metodo delle diluizioni a scalare di 10 in ) Si calcoli il numero delle UFC/ml su un campione liquido avendo contato nella diluizione colonie ed avendo seminato in superficie 0,1 ml. 18) Si calcoli il numero delle UFC/g di un campione di carne avendo contato nella diluizione colonie ed avendo seminato in superficie 0,1 ml. 19) Che cosa s intende per semina in superficie e per semina nell agar fuso? 20) Quali caratteristiche deve possedere una membrana filtrante per batteriologia? 21) Le membrane filtranti per batteriologia consentono una completa sterilizzazione del materiale filtrato? 22) Si descrivano le caratteristiche dell apparecchiatura che permette la filtrazione batterica. 23) Si descriva la tecnica per la determinazione della carica microbica mediante filtrazione. 24) Che cosa s intende per MPN? 25) Si descriva il procedimento con cui viene determinato l MPN. 26) Si illustrino le diverse tecniche con cui viene determinata la massa microbica. 27) Si descriva l andamento della curva di crescita di una popolazione microbica. 28) Per quale motivo le determinazioni fisiche e biologiche danno una curva di crescita diversa?