Istituto Comprensivo Sandro Pertini Ovada

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1 Istituto Comprensivo Sandro Pertini Ovada

2 In campo microbiologico è di primaria importanza riuscire a coltivare e perpetuare i microrganismi in laboratorio e ciò è reso possibile solo dalla disponibilità di adeguati terreni di coltura. I terreni di coltura possono essere costruiti completamente impiegando componenti ben definiti chimicamente, si parla di TERRENI DEFINITI o SINTETICI oppure possono contenere costituenti come peptoni (derivati proteici), estratti di lievito o di carne di cui non si conosce l esatta composizione si parla di TERRENI COMPLESSI.

3 I vari terreni di coltura sono classificati in base alla funzione ed alla composizione come: TERRENI PER USO GENERICO, TERRENI ARRICCHITI con particolari nutrienti per stimolare la crescita di un determinato microrganismo, TERRENI SELETTIVI contengono sali biliari o coloranti basici come il blu di metilene che inibiscono la crescita dei gram + favorendo lo sviluppo dei gram -, TERRENI DIFFERENZIALI in grado di distinguere tra diversi gruppi di organismi. Il terreno di coltura può essere solidificato con l aggiunta di AGAR, un polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse.

4 I primi terreni di coltura erano liquidi e di difficile gestione, solo nel 1881 Koch usò terreni solidi derivati da fette di patate bollite e poi sterilizzati. Nello stesso periodo un collaboratore di Koch, Loeffler sviluppò un terreno che contenesse come ingrediente base un peptone e riscosse un buon successo. Data la passione per la fotografia di Koch, fu il primo a fare microfotografie ai batteri, ed essendo capace di prepararsi le lastre fotografiche con Sali d argento e gelatina, intuì che lo stesso metodo poteva essere usato per i terreni solidi, usò quindi il terreno con il peptone più che la gelatina ma vi erano numerosissimi svantaggi, la gelatina non resisteva alle alte temperature ed alcuni batteri erano in grado di idrolizzarla.

5 Nel 1882 fu usato per la prima volta l Agar già noto da molto tempo come agente solidificante nella preparazione della gelatina. Fu FANNIE HESSE la moglie di un collaboratore di Koch a suggerire l uso dell agar quando viene a conoscere le difficoltà incontrate con la gelatina. Fu un grande successo!!! Cinque anni più tardi nel 1877 JIULIUS RICHARD PETRI, un altro assistente di Koch inventò la piastra per coltura che porta il suo nome, da quel momento caddero in isolamento in disuso le piastre di vetro ricoperte di agar. Queste innovazioni resero possibile l isolamento di colture pure, che contenevano un solo tipo di batterio, dando un notevole impulso in tutti i campi della Batteriologia.

6 Le Colture Microbiche si ottengono seminando sulla superficie dell agar il materiale microbico che si deve analizzare, si parla di PIASTRATURA, ogni cellula potrà riprodursi sul terreno solido formando un agglomerato di microrganismi detto COLONIA. Esistono 3 tecniche di Piastratura: PIASTRA PER DIFFUSIONE: Tipo I: nel centro di una piastra contenente agar si semina una piccola quantità di una miscela microbica diluita e per mezzo di una spatola si stende uniformemente sul terreno, Tipo II: il campione originale viene diluito più volte in diverse provette e poi miscelato ad agar fluido, poi si versa la miscela su una capsula di Petri e si lascia raffreddare per permettere la solidificazione e la crescita delle colonie.

7

8 PIASTRA PER STRISCIO la miscela microbica viene seminata ai margini della piastra per mezzo di un ansa da inoculo quindi si stende con una serie di strisci (piastra grande E. coli, S. aureus)

9 I microrganismi che crescono su superfici solide tendono a formare colonie con particolari caratteristiche morfologiche: La crescita delle colonie è in genere più rapida lungo i margini, dove maggiore è il contenuto di ossigeno e nutrienti, poiché la parte centrale è più spessa e i prodotti tossici vengono eliminati con difficoltà

10 Materiale occorrente: Agar in polvere Acqua distillata Piastre Petri in plastica Provette Becher Bunsen Pipette pasteur Pipette di vetro Cotone Incubatore Vetrini Microscopio

11 Abbiamo preparato il Brodo di coltura (agar + acqua distillata) scaldando la soluzione su un Bunsen fino a completo dissolvimento dell agar. Il Brodo di coltura sarà il terreno su cui faremo crescere i batteri presi in esame. Abbiamo lasciato raffreddare il Terreno e posizionato le Piastre su una superficie piana, una volta raffreddato, con una pipetta graduata abbiamo prelevato circa 15ml di terreno e abbiamo riempito le Piastre.

12 Mentre il terreno si solidifica nelle Piastre, abbiamo preparato i tamponi per fare i nostri campionamenti. Ogni gruppo ha preso una bacchetta di vetro, del cotone umido e abbiamo passato questo tampone rudimentale sulle superfici che volevamo esaminare. Una volta fatto questo abbiamo messo il cotone in un becker con acqua distillata. Esempio di Tampone Sterile

13 Per piastrare i batteri presenti nel Tampone abbiamo preparato un Unità Ansa utilizzando una Pasteur di vetro e piegandola mediante riscaldamento su Bunsen. Unità Ansa Anse Sterili Per terminare la nostra esperienza abbiamo preso una piastra col terreno solidificato, poi con una pipetta si è prelevato un piccolo quantitativo della soluzione contente il cotone del Tampone e versato il liquido sul Terreno solido. Aiutandoci con l Unita Ansa abbiamo piastrato i batteri, richiuso la piastra e posta in Incubatore.

14 Dopo alcuni giorni abbiamo osservato la crescita delle colonie batteriche su ogni piastra. Prelevando con uno stecchino una piccola parte della colonia considerata e posta su un vetrino con alcune gocce di acqua distillata abbiamo osservato al microscopio i batteri presenti nelle superfici prese un esame.

15 Stafilococchi Escherichia Coli

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