Effetti precoci dell alto glucosio sui segnali di fosforilazione in un modello retinico in vitro

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Tommasa Natale
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1 Effetti precoci dell alto glucosio sui segnali di fosforilazione in un modello retinico in vitro Marika Villa Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze Istituto Superiore di Sanità

2 Background Il diabete altera la funzione e la struttura di tutti i tipi cellulari retinici, coinvolgendo sia il comparto vascolare, sia le componenti neurogliali La funzione neuroretinica sembra compromessa in una fase molto precoce, ancora prima dell insorgenza di lesioni retiniche vascolari clinicamente evidenti Il metabolismo del glucosio in eccesso è in grado di indurre l attivazione di diverse vie intracellulari di trasduzione del segnale correlate fra loro e in grado di potenziarsi a vicenda

3 Fosforilazione delle proteine meccanismo regolatorio importante nella trasduzione del segnale intracellulare processo reversibile avviene su diversi residui aminoacidici; i più comuni sono serina, treonina e tirosina ATP ADP Serina Treonina Tirosina Proteina OH PROTEIN CHINASI Proteina fosforilata O O - P O - O - PROTEIN FOSFATASI P i

4 Sistema Renina-Angiotensina (RAS) Ang II AT 1 R Fosforilazione residui in tirosina p130cas FAK c-src JAK2 Shc-Grb2-Sos STAT Attivazione fosfolipasi PLC-γ Pyk2 Ras Attivazione MAPK IP IP 3 3 ERK1/2 Ca 2+ CREB L attivazione dell AT 1 R dell Ang II è associata ad un aumento della fosforilazione di residui tirosinici in specifiche proteine

5 Sistema Renina-Angiotensina (RAS) e retinopatia diabetica RAS è attivato nella Retinopatia Diabetica (RD) sia in modelli sperimentali sia nell uomo il blocco di RAS conferisce retinoprotezione sia in modelli sperimentali di diabete sia nei pazienti Prorenina Angiotensinogeno Renina ANG I ACE ANG II AT 1 AT 2 i componenti di RAS sono presenti a livello tutti i citotipi retinici

6 Scopo Analizzare gli effetti precoci dell alto glucosio sui segnalidifosforilazionein tirosina in particolare correlati al Sistema Renina Angiotensina, in un modello sperimentale di Retinopatia Diabetica

7 Disegno sperimentale Protocollo sperimentale Colture tissutali di retina di ratto in DMEM per 48 ore: Normale Glucosio (NG: 5.5 mm) Alto Glucosio (HG: 30 mm) Mannitolo (M: 5,5 mm G + 24,5 mm) ± ACE-inibitore (Enalaprilat) (EPR: 200 µm) Parametri retina inserto Polietilenpreptalato (PET) Fosforilazione in Tyr Fosfatasi in Tyr ptyr c-src (Tyr 416) pplcγ1 (Tyr783) ppyk2 (Tyr 402) Western blot attività chinasica immunoistochimica saggio enzimatico

8 Effetto dell HG sulla fosforilazione in Tyr delle proteine Gaddini et al, submitted

9 Effetto dell HG sull attività di src Ang II AT 1 R JAK2 p130cas FAK c-src Shc-Grb2-Sos STAT PLC-γ Pyk2 Ras IP IP 3 3 ERK1/2 Ca 2+ CREB Gaddini et al, submitted

10 Effetto dell HG sulla fosforilazione di Pyk2(Tyr402) e di PLCγ1(Tyr783) Ang II AT 1 R JAK2 p130cas FAK c-src Shc-Grb2-Sos STAT PLC-γ Pyk2 Ras IP IP 3 3 ERK1/2 Ca 2+ CREB Gaddini et al, submitted

11 Effetto dell HG sull attività delle fosfatasi in Tyr 350 Attività fosfatasica (% di controllo) n= NG HG M

12 Effetto dell enalaprilat sulla fosforilazione in Tyr delle proteine e sull espressione dell AT 1 R Gaddini et al, submitted

13 Effetto dell enalaprilat sull attivazione di src, PLCγ1 e fosfatasi in Tyr 350 Attività fosfatasica (% di controllo) n= NG HG M HG + enalaprilat Gaddini et al, submitted

14 Sommario Retine esposte ad alto glucosio per tempi brevi mostrano aumento dei segnali di fosforilazione in tirosina: RAS correlate Aumento di proteine fosforilate in tirosina Aumento di fosforilazione di PLCγ1 Aumento dell espressione del recettore AT 1 RAS indipendenti Attivazione e incremento dell attività di src, Aumento di fosforilazione di Pyk2 Incremento dell attività delle tirosin-fosfatasi

15 Conclusioni Questi risultati suggeriscono un coinvolgimento del signaling intracellulare di RAS nel danno retinico in corso di diabete. Il modello sperimentale descritto potrebbe essere utilizzato per studiare gli eventi precoci indotti dal milieu diabetico, al fine di identificare possibili interventi terapeutici contro le alterazioni della funzione visiva in corso di diabete.

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