Metodi di ionizzazione

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1 Metodi di ionizzazione IL PROCESSO DI IONIZZAZIONE avviene solitamente all interno della sorgente dello spettrometro di massa e può essere realizzato mediante varie tecniche. Dal tipo di processo di ionizzazione dipendono: il numero dei frammenti la natura dei frammenti l abbondanza dei frammenti

2 Metodi di ionizzazione - classificazione Sulla base dell energia energia coinvolta: Alcune tecniche di ionizzazione operano ad alta energia e portano ad una frammentazione spinta, altre operano a bassa energia producendo un numero inferiore di ioni: Tecniche hard: Estesa frammentazione Tecniche Soft informazione PM

3 - TECNICHE HARD Metodi di ionizzazione Ionizzazione elettronica (EI( - Electron Ionisation) - TECNICHE SOFT Ionizzazione chimica (CI( - Chemical Ionisation) Bombardamento con atomi veloci (FAB( - Fast Atom Bombardment) Ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI( - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) Ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI - Electrospray Ionisation)

4 Metodi di ionizzazione - classificazione In base al metodo di volatilizzazione che precede la ionizzazione del campione: Ionizzazione per vaporizzazione Ionizzazione per desorbimento Ionizzazione per nebulizzazione - Molecole piccole - Termicamente stabili - volatili - Molecole grandi - Termicamente poco stabili - non volatili Metodi di scelta per:

5 Metodi di ionizzazione Ionizzazione elettronica (EI( - Electron Ionisation) Ionizzazione chimica (CI( - Chemical Ionisation) Bombardamento con atomi veloci (FAB( - Fast Atom Bombardment) Ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI( - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) Ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI - ElectroSpray Ionisation)

6 IONIZZAZIONE ELETTRONICA (EI)* Campioni solidi o liquidi volatili e non termolabili possono essere introdotti nella camera di ionizzazione per ionizzazione elettronica attraverso: Introduzione diretta Introduzione indiretta (GC, HPLC) Sorgente a IONIZZAZIONE ELETTRONICA *Il termine impatto elettronico è poco usato

7 Ionizzazione elettronica (EI) Nella sorgente le molecole neutre del campione (M),( in fase gassosa,, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tugsteno) ) ed accelerato attraverso un potenziale regolabile dall operatore. L energia del fascio è normalmente fissata a 70 ev. Filamento M M M e - Molecole neutre vaporizzate +70 ev

8 Ionizzazione elettronica (EI) Tale interazione determina l'espulsione di un elettrone dalla molecola. Il catione radicalico M +. che si forma è detto ione molecolare. e - + M M e - catione radicalico Es.. Il normal decano + e - 2e- C 10 H 22 C 10 H M +. L energia fornita dall interazione con gli elettroni con la molecola causa la ionizzazione (rimozione di 1 elettrone) ed una frammentazione più o meno estesa delle molecole.

9 Ionizzazione-frammentazione Lo ione M +., dotato di alta energia, può FRAMMENTARSI e generare: molecole e/o radicali NEUTRI (che lo strumento non rileva) cationi e/o radicali cationi (IONI( frammento) Perdita di specie neutre - CH. 3 -e - C 10 H 22 Ionizzazione C 10 H M m/z C 2 H 5. Frammentazione dello ione molecolare C 9 H + 19 m/z 127 C 8 H + 17 m/z 113

10 Ionizzazione-frammentazione Le particelle neutre,, come CH 3., C 2 H 5., sono allontanate dalla pompa da vuoto; le particelle cariche,, come C 10 H +. 22, C 9 H 19+, C 8 H 17+,... sono accelerate e convogliate all analizzatore. Nello spettro appaiono in corrispondenza del loro rapporto massa/carica. m/z 113, 127, 142 C 8 H + 17 C 9 H + 19 C 10 H m/z

11 Sorgente a ionizzazione elettronica (EI) Filamento Ingresso del campione All analizzatore Fascio di elettroni Elettrodi di focalizzazione degli ioni e - + M M e - oltre a ioni monocarichi si possono formare anche ioni con più cariche.

12 Sorgente a ionizzazione elettronica (EI)

13 Caratteristiche (EI) E la modalità più classica, tuttora molto utilizzata. E una ionizzazione hard : si possono avere frammentazioni estese che lasciano poco o nulla dello ione molecolare. Il campione deve essere in stato di vapore. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC (separazione di miscele di analiti).

14 IONIZZAZIONE CHIMICA (CI) La CI consiste generalmente nel trasferimento di un PROTONE da un gas reagente (GH),, precedentemente ionizzato, alla molecola neutra M da analizzare per formare uno ione molecolare protonato [M+H] +. GH + + M MH + + G Ionizzazione chimica di M La particolarità è che nello spettro vedremo lo ione molecolare con un unità di massa in più M

15 IONIZZAZIONE CHIMICA (CI vs EI) 3,4-dimetossiacetofenone MW = 180 M +. m/z 180 MH + m/z 181 M + 1

16 IONIZZAZIONE CHIMICA (CI) A questo scopo nella n camera di ionizzazione sono presenti: la molecola da analizzare (M)( ) allo stato gassoso un gas reagente (G) in concentrazioni relativamente elevate (1 a 100).

17 Ionizzazione chimica (CI) 1. Il gas reagente è soggetto a ionizzazione elettronica EI. G G +. Ionizzazione EI del gas reagente G 2. Io ione radicalico del gas reagente G +. reagisce con molecole G neutre e forma ioni GH +. G +. Il gas reagente protonato GH + (acido di Brönsted) fungerà da specie ionizzante attraverso una reazione di trasferimento di un protone (reazione ione-molecola neutra) GH + + M GH + Ionizzazione del gas reagente G MH + + G Ionizzazione chimica di M

18 1. Ionizzazione del gas reagente Es. Metano 1. CH 4 + e > CH e > CH 3+ + H. Lo ione molecolare del metano (CH( +. 4 ) generato per ionizzazione elettronica può reagire con l'eccesso di metano neutro: 2. CH CH > CH 5+ + CH. 3 CH CH > C 2 H 5+ + H 2 + H. C 2 H 5+ + CH -----> C 4 3 H H 2 Il catione CH + 5, un acido forte, può quindi protonare con una reazione acido-base praticamente qualsiasi molecola organica (più basica del metano).

19 2. Trasferimento di un protone 3. Il processo di trasferimento di un protone corrisponde ad una reazione, in fase gas, Acido-Base secondo Brønsted nsted-lowrey CH M CH MH + + CH Ionizzazione chimica di M CH 4 M + 1? 3,4-dimetossiacetofenone

20 Formazione di addotti (metano) Oltre a reazioni di trasferimento protonico che portano alla formazione di ioni [M+H] + si possono osservare altri ioni: meno intensi A valori m/z superiori (nel caso del metano: 15, 29, 41..Da.Da)) a quelli dello ione [M+H] + quali.. [M+15 15] + [M+CH 3 ] + [M+29 29] + [M+C 2 H 5 ] + [M+41 41] + [M+C 3 H 5 ] + Tali ioni sono dovuti a formazione di ADDOTTI con la molecola M. M

21 Formazione di addotti (metanolo) Gas reagente metano: CH 5+ 48% C 2 H 5+ 41% C 3 H 5+ 6% CH 5+ + M MH + + CH 4 C 2 H 5+ + M [M+C 2 H 5 ] + + C 2 H 4 MH + M + 1 [M+C 2 H 5 ] + M + 29

22 Formazione di addotti (metanolo) Utili per identificare o confermare lo ione molecolare. MH + [M+C 2 H 5 ] + [M+C 3 H 5 ] + M + 29 M + 41 CI spectrum (by methane) ) of malonamide of pentobarbital PM = 200).

23 Altri gas reagenti impiegati in CI sono: isobutano, ammoniaca, acetonitrile e metanolo. Isobutano: - Altri gas reagenti 1. i-c 4 H 10 + e > i-c 4 H e - 2. i-c 4 H i-c 4 H > i-c 4 H 9+ + C 4 H 9 +H 2 3. (CH 3 ) 3 C + + M i-c 4 H 9 + MH + + (CH 3 ) 3 C=CH 2 M + 1

24 - Altri gas reagenti Ammoniaca: 1. NH 3 + e > > NH e- 2. NH NH > NH 4+ + NH NH M MH + + NH 3 M + 1 Formazione di addotti : [M+NH 4 ] + [M+18] +

25 Affinità protonica (PA) - Scelta del gas reagente Il gas G deve avere affinità protonica MINORE di quella di M altrimenti non è in grado di cedere il protone alla molecola M GH + + M MH M + + G H = PA (G) PA (M) Gas reagente G CH 4 H 2 O CH 3 OH i-c 4 H 10 NH 3 Acido Brønsted CH + 5 H 3 O + CH 3 OH + 2 i-c 4 H 9 + NH + 4 PA

26 Energia trasferita - Scelta del gas reagente L energia trasferita dai vari ioni secondari (metano, isobutano e ammoniaca) diminuisce nell ordine : CH + 5 > i-c 4 H + 9 > NH + 4 Lo ione NH 4+ trasferisce meno energia allo ione MH + che di conseguenza si frammenterà meno.

27 - Scelta del gas reagente. CH + 5 > i-c 4 H + 9 > NH + 4 Figure 1. CI spectrum (by methane) Malonamide of pentobarbital PM = 200 MH + = 201 Figure 2. CI spectrum (by ammonia) MH + = 201 MINORE FRAMMENTAZIONE

28 - Scelta del gas reagente. CH + 5 > i-c 4 H + 9 > NH + 4 Metilbenzofenone PM = 196

29 - Scelta del gas reagente Dall esame degli spettri registrati con diversi reagenti si arriva alla conclusione che, oltre all informazione sul peso molecolare,, si possono anche ottenere informazioni sulla frammentazione, mediante una oculata scelta del gas reagente.

30 Caratteristiche (CI) E una ionizzazione soft soft. Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione molecolare MH + con un bassissimo eccesso di energia (< a 5 ev), e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti. Ione molecolare sempre presente: informazione PM Minore frammentazione: scarse informazioni sulla struttura

31 EI versus CI EFEDRINA Spettro di Massa per Ionizzazione Elettronica MW= 165 M +.

32 EI versus CI EFEDRINA Spettro di Massa per Ionizzazione Chimica MW= 165 [M+H]+ E una tecnica di ionizzazione ad energia più bassa e consente di rilevare lo ione molecolare.

33 Caratteristiche (CI) Il campione deve essere in stato di vapore Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con sistemi cromatografici (HPLC).

34 Ionizzazione per Desorbimento: FAB e MALDI E un processo attraverso il quale una molecola è sia evaporata da una superficie (substrato) che ionizzata. Il campione viene desorbito e ionizzato mediante un processo che sfrutta il bombardamento del substrato contenente il campione, con atomi ad alta energia o fotoni, o frammenti di fissione nucleare. L impatto deposita energia sul campione tramite la matrice e porta al trasferimento delle molecole in fase gassosa e alla ionizzazione

35 Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi veloci - FAB - Fast Atom Bombardment Il campione è miscelato ad una MATRICE LIQUIDA (Glicerolo, Tioglicerolo, Nitrobenzil alcol, dietilammina). La miscela (analita( analita-matrice) ) posta su una sonda opportuna, viene introdotta nella camera della sorgente viene bombardata da un fascio di atomi neutri che si muovono ad alta velocità (atomi neutri pesanti come xenon, argon con un energia cinetica di kev ). Soluzione dell analita in glicerina Sonda

36 Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi veloci (FAB) L impatto degli atomi contro la miscela crea fenomeno di superficie cioè gli atomi impattano sulle superfici e proiettano via molecole di analita. Visione pittorica del bombardamento con atomi veloci sulla superficie della soluzione (dispersione) di glicerina con produzione di ioni positivi e negativi dell analita come pure di specie neutre (N) e ioni di glicerina (G)

37 Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi veloci (FAB) In particolare, si verifica un elevato innalzamento della temperatura, per un breve periodo, troppo breve per causare la rottura dei legami chimici, ma sufficientemente alto da permettere la ionizzazione per protonazione dei composti da analizzare.

38 Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi veloci (FAB) L introduzione di questa tecnica nei primi anni 80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. In questo tipo di ionizzazione il vantaggio rispetto alle precedenti è costituito dal fatto che il campione non deve essere trasformato in gas o vapore. Questa tecnica può essere quindi applicata anche a molecole grandi poco volatili: peptidi,, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a 5000). Ionizzazione soft. Con questa tecnica in genere si evitano ulteriori frammentazioni della molecola in esame, problema presente sia nella ionizzazione chimica che elettronica. Quantità minima circa 20 picomoli

39 MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation La tecnica MALDI è stata introdotta da Karas e Hillkamp nel 1988 per la ionizzazione di peptidi e di proteine. Successivamente questa tecnica è stata in grado di analizzare altri tipi di biomolecole come oligosaccaridi glicolipidi, nucleotidi e polimeri sintetici. Il campione è cristallizzato con MATRICI CRISTALLINE capaci di assorbire la radiazione UV del laser, (Es.( nicotinic acid or dihydroxybenzoic acid).

40 MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Un impulso di raggio laser colpisce la MATRICE CRISTALLINA.. Il laser che emette radiazione UV, ha funzione di aiutare a introdurre energia ergia nel sistema molecolare per promuovere la ionizzazione impedendo contemporaneamente una degradazione termica del campione. - Matrice cristallina (anzichè liquida). - Fascio di fotoni (anziché di atomi). -The final molar ratio sample/matrix matrix is about or around 1/ Ioni prodotti sono spesso solo a singola carica

41 MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Molecole di campione matrice Ioni positivi Ioni negativi

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43 Caratteristiche MALDI MALDI è utilizzato per determinare il peso molecolare di peptidi, proteine, oligonucleotidi,, ed altri composti di origine biologica o sintetica (polimeri sintetici). La quantità di campione richiesta è molto piccola (1( to 10 pmol/ul). - MALDI tollera l impiego di sali e tamponi. Anche se è meglio rimuoverli per ottenere migliori performance.

44 Ionizzazione elettrospray (ESI) L ESI è una tecnica di ionizzazione soft che consente di analizzare molecole grandi, non volatili generando ioni molecolari [M+H[ M+H] + direttamente da una SOLUZIONE del campione. Il campione è sciolto in un solvente opportuno in presenza di piccole quantità di un acido. Capillare dell eletrospray eletrospray FLUSSO DI GAS Controelettrodo CAPILLARE

45 Nebulizzazione La soluzione (<10-3 M) dell analita analita, passando attraverso un capillare di acciaio inossidabile, viene NEBULIZZATA. Si forma un aerosol di piccole goccioline di solvente contenenti il campione. La ionizzazione di solito è spontanea, ma può essere indotta con l aggiunta di reagenti adatti. Capillare dell eletrospray eletrospray Solvente/campione

46 Nebulizzazione In particolare,, poiché l estremità del capillare si trova ad un POTENZIALE ELEVATO (3-6 kv) la nebulizzazione porta alla formazione di goccioline cariche che contengono l analita IONIZZATO. Capillare dell eletrospray eletrospray

47 Nebulizzazione: formazione delle goccioline cariche Meccanismo di formazione delle goccioline cariche Se il potenziale del capillare è positivo,, gli IONI POSITIVI della soluzione elettrolitica si allontanano dal capillare e si accumuleranno sulla superficie del liquido che si trova sulla punta del capillare. are. Gli IONI NEGATIVI saranno invece trattenuti all interno del capillare.

48 Nebulizzazione: formazione delle goccioline cariche Quando la repulsione degli ioni positivi presenti sulla superficie, assieme alla forza esercitata su di essi dal campo elettrico,, vincono la tensione superficiale del liquido si ha l espansione del liquido ido (che si muove seguendo il campo) in un cono (cono( di Taylor),

49 Nebulizzazione: formazione delle goccioline cariche La punta del cono di Taylor,, essendo la parte meno stabile, si allunga a formare un getto sottile si scinde in singole goccioline cariche (spray).

50 Evaporazione del solvente (evaporazione ionica) Le goccioline cariche positivamente,, vengono attratte da un controelettrodo,, che può essere costituito grossolanamente da un capillare mantenuto sotto vuoto e a un potenziale negativo; ; in tal modo e con l aiuto di un flusso di gas ausiliario inerte (N 2 ) riscaldato,, coassiale rispetto alla direzione del flusso di soluzione, il sovente evapora FLUSSO DI GAS Controelettrodo CAPILLARE

51 Evaporazione del solvente Man mano che il solvente contenuto nelle goccioline EVAPORA, queste si rimpiccioliscono (il raggio si riduce), mentre aumenta la densità di carica. In questo modo la forza di repulsione elettrostatica coulombiana, aumentata a causa della forte densità elettrica.

52 Evaporazione del solvente Ad un certo valore del raggio della gocciolina, quando la repulsione supera l effetto di coesione esercitato dalla tensione superficiale della goccia (limite( di Rayleigh*),, si osserva L ESPLOSIONE delle goccioline con formazione di piccolissime goccioline cariche. *Il limite di Rayleigh (il punto in cui la forza di repulsione di Coulomb delle cariche e sulla superficie è uguale alla tensione superficiale della soluzione).

53 Formazione di ioni La formazione di ioni mono e multicarica dalle goccioline è un fenomeno che ha luogo in più stadi attraverso meccanismi tuttora oggetto di discussione:?

54 Evaporazione del solvente e meccanismi di formazione di ioni Meccanismo del residuo carico, (CRM), charged residue model, Dole. Le goccie vanno incontro ad una serie di scissioni che portano alla fine alla produzione di piccole goccie con una o più cariche che trasportano una sola molecola di analita: ioni monocarica o multicarica

55 Evaporazione del solvente e meccanismi di formazione di ioni Meccanismo di evaporazione ionica (IME) ion evaporation model, Iribarne and Thomson). Singole molecole cariche vengono espulse direttamente dalla goccia per ridurre la densità di carica sulla superficie.

56 Gli ioni generati vengono poi indirizzati da un gradiente di campo verso l analizzatore

57 Caratteristiche (ESI) E un metodo di ionizzazione soft per cui si osserva uno ione molecolare integro. Si può formare: - uno ione a carica singola (M+H) + Es. Pentapeptide leucine enkephalin (C 28 PM = Da 28 H N 5 O 7 )

58 Caratteristiche (ESI) - Si possono formare addotti con il sodio (M+Na) + Lo spettro EI non è utile, in quanto il lattosio ha una bassa tensione di vapore ed è termicamente labile: lo spettro non presenta alcun picco caratteristico. ristico. Lo spettro ESI mostra un debole picco dello ione molecolare a m/z 342 e un picco caratteristico [M + 23] +, il picco ione molecolare più sodio. Poiché gli ioni sodio sono ubiquitari in soluzione acquosa, questi addotti con il sodio sono molto comuni.

59 Caratteristiche (ESI) - Spesso vengono prodotti ioni multicarica (z > 1) (multiply charged ions) (M+nH) n+. L ESI infatti può dislocare sulle molecole un numero di cariche (protoni) anche elevato. Siccome ogni misura di MS è una misura del rapporto m/z ne consegue che all'aumentare di z,, il rapporto m/z diminuisce e quindi possono essere analizzate anche sostanze con una elevatissima massa molecolare. Ad esempio, se una molecola di massa relativa M = 9990 Dalton dà uno ione con 10 cariche positive, tale segnale avrà la composizione (M+10 10H) 10 + e quindi il picco corrispondente apparirà a: m/z = (M+10) 10 ( ) = = = 1000 Ciò consente di analizzare anche molecole con ELEVATO PESO MOLECOLARE (ad esempio le proteine) impiegando analizzatori che hanno un range ridotto (limite superiore di PM 1200 Da), ad esempio i quadrupoli.

60 ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica Quando la massa molecolare relativa (RMM) è incognita, la si può calcolare da due semplici formule (o meglio il calcolatore la deduce da semplici formule) date da: m/z m 1 e m/z m 2 sono due picchi adiacenti dove m1<m2 n 2 = numero delle cariche dello ione a m/z m 2 H = la massa di un protone M = la massa molecolare relativa (RMM) dell'incognito. Dal momento che i picchi dell'insieme sperimentale formano una serie s in cui ciascun termine differisce dal vicino per una carica, risulta facile per il sistema di elaborazione dati: - identificare la carica associata a ciascun picco - calcolare la massa molecolare da ciascun picco usando M=n(m (m-h) - mediare i valori di massa molecolare. Un opportuno programma di trasformazione presenta poi i dati in uno spettro di massa ricostruito.

61 ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica Esempio 1: Spettro ESI di ioni positivi della mioglobina equina (peso molecolare medio 16950,5) Insieme di picchi ciascuno corrispondente alla molecola intatta, ma con diverse cariche (protoni) a partire da z=24 con m/z 707 fino a z=12 con m/z 1413.

62 ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica Esempio 1: Deconvoluzione dello spettro ESI multicarica della mioglobina. (peso molecolare 16950,5) Spettro ESI ricostruito

63 ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica Esempio 2: protein hen egg white lysozyme MW = Da

64 ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica Esempio 2: Deconvoluzione protein hen egg white lysozyme MW = Da Spettro ESI ricostruito

65 Caratteristiche (ESI) ioni multicarica Il numero di cariche positive che una molecola può supportare dipende dal numero di centri basici presenti sulla molecola. La ionizzazione di un peptide ha generato una popolazione di peptidi carichi e non carichi. (In positive ion mode the analyte is sprayed at low ph to encourage positive ion formation. In negative ion the analysis is normally carried out well above a molecules isoelectric point to deprotonate the molecule).

66 Caratteristiche (ESI) ioni multicarica [M+2H] ++ z = 2 [M+H] + m/z z è la carica dello ione = 2 m/z Lo spettro contiene ioni a carica singola (m/z( 379.2) e a doppia carica (m/z( 190.1)

67 Caratteristiche (ESI) ESI è un processo a pressione atmosferica. Ciò rende l ESI un metodo più semplice che può essere accoppiato molto bene con interfacce di tipo HPLC E il metodo di scelta per l analisi di molecole termolabili.. Può essere utilizzato per biopolimeri di piccole e grandi dimensioni (peptides, proteins, carbohydrates,, and DNA fragments), and lipids. Il campione deve essere solubile e stabile in soluzione, deve essere polare e relativamente pulito (free( of nonvolatile buffers, detergents, salts,, etc.).