La progettazione degli esperimenti nella validazione dei metodi di prova: presentazione di esempio applicato

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1 AGENZIA REGIONALE PER LA PREVENZIONE E PROTEZIONE AMBIENTALE DEL VENETO La progettazione degli esperimenti nella validazione dei metodi di prova: presentazione di esempio applicato Bologna 25 Novembre 2004 Alessandro Grigato ARPAV, Dip.to Prov.le di Rovigo OBIETTIVO Illustrare le potenzialità della tecnica D.O.E. nell abbattimento dei costi della validazione. 1

2 Validare costa! La validazione di un metodo richiede circa 1 mese uomo per ogni combinazione analita/matrice. 2

3 Riferimenti 1) UNICHIM, Manuale n. 179/0, Linee guida per la validazione di metodi analitici nei laboratori chimici, Milano, ) IUPAC Technical Report, Harmonized guidelines for singlelaboratory validation of methods of analysis, Pure Appl. Chem., 75, 835, 2002 (www.iupac.org/reports/index.htlm). 3) FAO Soil Bulletin 74, Guidelines for Quality Management in Soil and Plant Laboratories: Quality of analytical procedures, 1998 (www.fao.org/docrep/w7295e/w7295e00.htm#contents) 4) Oles P.J., JAOAC, 76, 615, ) Jimidar M. et al., LC.GC Europe, Apr, 230, 2002 (www.lcgceurope.com/lcgceurope/) 6) Dolan J. W., LC.GC Europe, July, 386, 2004 (www.lcgceurope.com/lcgceurope/) 3

4 Progettazione degli Esperimenti (Design Of Experiments - DOE) Migliorare un processo Individuare le variabili (fattori) critiche Individuare le variazioni massime delle variabili per garantire le performances di processo prestabilite Verificare le interazioni tra variabili Valutare la robustezza di un processo 4

5 Sperimentazione fattoriale completa (Full Factorial Design) Scopo: studiare gli effetti delle variazioni di N fattori a 2 livelli ciascuno Per studiare tutte le possibili combinazioni con la tecnica della sperimentazione fattoriale completa servirebbero, per N=7 2 7 = 128 esperimenti!! 5

6 Otterrete le stesse informazioni utili selezionando una opportuna frazione di tutte le possibili combinazioni. riducendo di molto il lavoro! Sperimentazione Fattoriale Frazionata: (Fractional Factorial Design) "A factorial experiment in which only an adequately chosen fraction of the treatment combinations required for the full factorial experiment is selected to be run." ASQC Glossary & Tables for Statistical Quality Control Genichi Taguchi 6

7 Sperimentazione fattoriale frazionata 3 VARIABILI SU 2 LIVELLI (4 combinazioni al posto di 8) V A R I A B I L I PROVE A B C VARIABILI SU 2 LIVELLI (8 combinazioni al posto di 128) V A R I A B I L I PROVE A B C D E F G

8 UNI CEI EN ISO/IEC 17025: Parametri di validazione Selettività Campo di applicazione Linearità Sensibilità Ripetibilità Limiti di rilevazione Robustezza Esattezza Incertezza 8

9 Robustness The characteristic of the process output or response to be insensitive to the variation of the inputs NIST/SEMATECH e-handbook of Statistical Methods, (www.itl.nist.gov/div898/handbook/index.htm) 9

10 International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use The ICH is a unique project that brings together the regulatory authorities of Europe, Japan and the United States GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2A VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: DEFINITION AND TERMINOLOGY 9. ROBUSTNESS The robustness of an analytical procedure is a measure of its capacity to remain unaffected by small, but deliberate variations in method parameters and provides an indication of its reliability during normal usage. 10

11 Robustezza Manuale Unichim N. 179/0, 1999 Capacità posseduta da un metodo di non essere influenzato significativamente, in termini di risultati finali, per effetto di variazioni deliberate introdotte nelle sue fasi di realizzazione. 11

12 INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY HARMONISED GUIDELINES FOR SINGLE-LABORATORY VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS (IUPAC Technical Report) Prepared for publication by MICHAEL THOMPSON, STEVEN L R ELLISON, AND ROGER WOOD A11. Ruggedness The ruggedness of an analytical method is the resistance to change in the results produced by an analytical method when minor deviations are made from the experimental conditions described in the procedure. The ruggedness of a method is tested by deliberately introducing small changes to the procedure and examining the effect on the results. 12

13 UNICHIM SCOPO PARAMETRO Qualitativa d identificazione Semiquantitativa su tracce Quantitativa su tracce Quantitativa e/o confronto con un valore prefissato Prove di comportamento Selettività x x x x Esattezza x x Recupero x x Ripetibilità x x x LOD x x LOQ x Linearità x x Campo di app x x Robustezza x x x x x 13

14 Cosa fare? 1. Definire l obiettivo della sperimentazione 2. Stabilire il parametro di controllo 3. Selezionare le variabili (3 o 7) 4. Fissare i 2 livelli per ogni variabile 5. Scegliere la matrice ortogonale opportuna 6. Assegnare i valori delle variabili nella matrice 7. Condurre gli esperimenti (prove) 8. Analizzare i risultati 14

15 1. Definire l obiettivo della sperimentazione Stimare la robustezza del metodo interno validato: Azoto Kjeldahl in alimenti. Si introducono variazioni nelle condizioni di digestione che potrebbero verificarsi inavvertitamente durante il lavoro routinario. 15

16 2. Stabilire il parametro di controllo Recupero di Azoto Kjeldahl da prove condotte su un materiale di riferimento Accettabilità del recupero, prevista dal protocollo : % 16

17 3. 4. Scegliere le variabili e i loro livelli Le variazioni ai valori del protocollo sono quelle che presumibilmente potrebbero verificarsi accidentalmente durante il lavoro routinario. NOME DELLA VARIABILE Proto collo LIV. L- LIV. L+ A Quantità di catalizzatore (mg) 0,15 B Vol. della sol. di digestione (ml) 25 C Tempo di digestione (min) 20 0,1 0,

18 5. Scegliere la matrice ortogonale 3 VARIABILI X 4 COMBINAZIONI V A R I A B I L I PROVE A B C VARIABILI X 8 COMBINAZIONI V A R I A B I L I PROVE A B C D E F G

19 6. Assegnare i valori alle variabili NOME DELLA VARIABILE Cond Met. LIV. L- LIV. L+ A Quantità di catalizzatore (mg) 0,15 0,1 0,2 B Vol. della sol. di digestione (ml) C Tempo di digestione (min) V A R I A B I L I PROVE A B C V A R I A B I L I PROVE A B C 1 0, , ,1 0,

20 7. Condurre gli esperimenti V A R I A B I L I PROVE A B C CONTROLLO (RECUPERO%) , , , ,

21 8.1 Analizzare i risultati V A R I A B I L I PROVE A B C CONTROLLO (RECUPERO%) 1 0, , , , Media L- Media L+ Differenza Media L+ : L- : per la variabile A è la media dei risultati ottenuti dalle prove con A al livello L+ L- (prove 21 e 4) 3)

22 8.2 Analizzare i risultati Assumendo che le variazioni imposte ai fattori possano verificarsi accidentalmente durante il lavoro routinario, il metodo può ritenersi robusto? V A R I A B I L I PROVE A B C REC 1 0, , , , Accettabilità: % Accettabilità: % Differenza NOME DELLA VARIABILE Cond Met. LIV. L- LIV. L+ A Quantità di catalizzatore (mg) 0,15 0,1 0,2 B Vol. della sol. di digestione (ml) C Tempo di digestione (min)

23 DOE: non solo robustezza. ph fase mobile Composizione fase mobile Colonna Temperatura Flusso ma anche ottimizzazione del metodo: separazione tra due picchi, tempo d analisi 23

24 DOE: non solo robustezza. ma anche Validazione in base a modelli alternativi 24

25 DOE: non solo robustezza. INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY HARMONISED GUIDELINES FOR SINGLE-LABORATORY VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS (IUPAC Technical Report) Prepared for publication by MICHAEL THOMPSON, STEVEN L R ELLISON, AND ROGER WOOD Strumento Operatore Lotto di reagente ph di una soluzione Temperatura di reazione Tempo per completare un processo.. 25

26 per cui ritengo che Thompson M., Analyst, 125, 2020, 2000 if each factor were set at the extremes allowable in a method protocol, the precision resulting might be approximately that found in a collaborative trial. That is an exciting possibility, because it suggests that interlaboratory precision could be estimated from an in-house experiment, with consequent savings of resources. 26

27 DOE: non solo robustezza. Ripetibilità S r Riproducibilità S R = S r Incertezza U = ks R 27

28 E01035: Using ruggedness tests to estimate uncertainty This research project aims to investigate the modification of a standard ruggedness test to provide data with the same validity as a collaborative trial, but at a reduced cost. 28

29 E01036: Using ruggedness tests to estimate uncertainty Thursday, 07 October 2004 Results and findings This pilot study has shown that in a series of ruggedness tests it was not possible to simulate reproducibility SD by means of carefully considered perturbations of the analytical procedure in a Single Laboratory, with the possible exception of those methods not involving an empirical calibration. 29

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