User ś Manual. Myoglobin ELISA. Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of myoglobin in human serum HZ im age des cri ption

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1 im age des cri ption User ś Manual Myoglobin ELISA Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of myoglobin in human serum HZ

2 Version 4.0 Effective, June 2010 (102709) (it-kj) Please use only the valid version of the package insert provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung. Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de Contenidos 1 INTENDED USE INTRODUCTION PRINCIPLE OF THE TEST REAGENTS WARNINGS AND PRECAUTIONS FOR USERS STORAGE CONDITIONS INSTRUMENTATION REAGENT PREPARATION SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION PROCEDURAL NOTES ASSAY PROCEDURE QUALITY CONTROL CALCULATION OF RESULTS EXAMPLE OF STANDARD CURVE LIMITATIONS OF THE PROCEDURE EXPECTED NORMAL VALUES PERFORMANCE CHARACTERISTICS STANDARDIZATION USO INTESO INTRODUZIONE PRINCIPIO DEL TEST REAGENTI AVVERTENZE E PRECAUZIONI PER L UTENTE CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE INSTRUMENTAZIONE PREPARAZIONE DEI REAGENTI COLLEZIONAMENTO DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE NOTE AL PROCEDIMENTO PROCEDIMENTO D ANALISI CONTROLLO QUALITÀ CALCOLO DEI RISULTATI ESEMPIO DELLA CURVA STANDARD LIMITI DEL PROCEDIMENTO VALORI NORMALI ASPETTATI CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO STANDARDIZZAZIONE REFERENCES / LITERATURE / BIOGRAFIA SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 1

3 For In Vitro Diagnostic Use Only Store at 2 C to 8 C. Proprietary and Common Names Human Myoglobin Enzyme Immunoassay 1 INTENDED USE The Myoglobin ELISA is intended for the quantitative determination of myoglobin in human serum. 2 INTRODUCTION Myoglobin, a heme protein with a molecular weight of approximately 17,500 Daltons is found in both cardiac and skeletal muscle. Damage to either type of muscle following conditions such as trauma, ischemia, and diseases that cause myopathy, is associated with the release of myoglobin into serum. 1,2 Specifically, following cardiac necrosis associated with myocardial infarction (MI), myoglobin is one of the first markers to rise above normal levels. Myoglobin levels increase measurably above baseline within 2-4 hours post-infarct, peaking at 9-12 hours, and returning to baseline within hours. 1,3,4,5 In the absence of skeletal muscle trauma or other factors associated with a non-cardiac related increase in circulating myoglobin, its levels have been used as an early marker for myocardial infarct. 4,6,7 A number of reports suggest using the measurement of myoglobin as a diagnostic aid in ruling out myocardial infarction 5,8 with negative predictive values of up to 100% reported at certain time periods after the onset of symptoms Unlike the other cardiac enzymes such as creeatine kinase and the MB isoform (i.e., CK and CK/MB) which do not reach serum levels until several hours post-infarction (approx. 19 hours), myoglobin levels can be expected to peak within 6 to 9 hours. 16 The Myoglobin Enzyme Immunoassay provides a rapid, sensitive, and reliable assay for the quantitative measurement of myoglobin in serum. The antibodies developed for the test will determine a minimal concentration of 5.0 ng/ml, and there is no cross-reactivity with related cardiac or skeletal enzymes. 3 PRINCIPLE OF THE TEST The Myoglobin ELISA test is based on the principle of a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay. 17,18 The assay system utilizes a unique monoclonal antibody directed against a distinct antigenic determinant on the myoglobin molecule. Mouse monoclonal anti-myoglobin antibody is used for solid phase immobilization (on the microtiter wells). A goat anti-myoglobin antibody is in the antibody-enzyme (horseradish peroxidase) conjugate solution. The test sample is allowed to react simultaneously with the two antibodies, resulting in the myoglobin molecules being sandwiched between the solid phase and enzyme-linked antibodies. After a 45 minute incubation at room temperature, the wells are washed with water to remove unbound labeled antibodies. A TMB (Tetramethyl-benzidine) Reagent is added and incubated for 20 minutes, resulting in the development of a blue color. The color development is stopped with the addition of Stop Solution changing the color to yellow. The concentration of myoglobin is directly proportional to the color intensity of the test sample. Absorbance is measured spectrophotometrically at 450 nm. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 2

4 4 REAGENTS 4.1 Materials provided with the kit Antibody-Coated Wells (1 plate, 96 wells) Microtiter wells coated with murine monoclonal anti-myoglobin. Reference Standard Set (0.5 ml/vial, 1 set/kit) Contains 0, 25, 100, 250, 500, and 1000 ng/ml myoglobin, liquid, ready-to-use. These standards have been pre-diluted 10-fold. Please do not dilute them again. Sample Diluent (25 ml/bottle) Contains phosphate buffer and 1.0% (w/v) Pro-Clin as preservative. Enzyme Conjugate Reagent (22 ml/vial) Contains anti-myoglobin conjugated to horseradish peroxidase in Tris buffer-bsa solution with preservatives. TMB Reagent (11 ml/bottle) Contains one-step TMB solution. Stop Solution (1 bottle, 11 ml/bottle) Contains diluted hydrochloric acid (1N HCl). 4.2 Materials required but not provided Precision pipettes: 20 µl, 50 µl, 200 µl, and 1.0 ml Disposable pipette tips Distilled water Vortex mixer or equivalent. Absorbent paper or paper towels Graph paper Microtiter plate reader 5 WARNINGS AND PRECAUTIONS FOR USERS 1. CAUTION: This kit contains human material. The source material used for manufacture of this kit tested negative for HBsAg, HIV 1/2 and HCV by FDA-approved methods. However, no method can completely assure absence of these agents. Therefore, all human blood products, including serum samples, should be considered potentially infectious. Handling and disposal should be as defined by an appropriate national biohazard safety guideline or regulation, where it exists Do not use reagents after expiration date and do not mix or use components from kits with different lot numbers. 3. Do not use the reagent when it becomes cloudy or contamination is suspected. 4. Do not use the reagent if the vial is damaged. 5. Replace caps on reagents immediately. Do not switch caps. 6. Each well can be used only once. 7. Do not pipette reagents by mouth. 8. Solutions containing additives or preservatives, such as sodium azide, should not be used in the enzyme reaction. 9. Avoid contact with 1N HCl. It may cause skin irritation and burns. If contact occurs, wash with copious amounts of water and seek medical attention if irritation persists. 10. For in vitro diagnostic use. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 3

5 6 STORAGE CONDITIONS 1. Store the unopened kit at 2-8 C upon receipt and when it is not in use, until the expiration shown on the kit label. Refer to the package label for the expiration date. 2. The opened and used reagents are stable until the expiration date if stored properly at 2-8 C. 3. Keep microtiter plate in a sealed bag with desiccant to minimize exposure to damp air. 7 INSTRUMENTATION A microtiter well reader with a bandwidth of 10 nm or less and an optical density range of 0 to 3 OD or greater at 450 nm wavelength is acceptable for absorbance measurement. 8 REAGENT PREPARATION All reagents should be brought to room temperature (18-25 C) before use. Patient serum and control serum should be diluted 10 fold before use. Prepare a series of small tubes (such as 1.5 ml microcentrifuge tubes) and mix 20 µl serum with 180 µl (0.18 ml) Sample Diluent. PLEASE DO NOT DILUTE THE STANDARDS THEY HAVE ALREADY BEEN PRE-DILUTED 10-FOLD. Samples with expected myoglobin concentrations over 1000 ng/ml may be quantitated by further dilution 10-fold with sample diluent. 9 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The use of SERUM samples is required for this test. Specimens should be collected using standard venipuncture techniques. Remove serum from the coagulated or packed cells within 60 minutes after collection. Specimens which cannot be assayed within 24 hours of collection should be frozen at 20 C or lower, and will be stable for up to six months. Specimens should not be repeatedly frozen and thawed prior to testing. DO NOT store in frost free freezers, which may cause occasional thawing. Specimens which have been frozen, and those which are turbid and/or contain particulate matter, must be centrifuged prior to use. 10 PROCEDURAL NOTES Pipetting recommendations (single and multi-channel): Pipetting of all standards, samples, and controls should be completed within 3 minutes. All standards, samples, and controls should be run in duplicate concurrently so that all conditions of testing are the same. It is recommended that the wells be read within 15 minutes following addition of Stop Solution. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 4

6 11 ASSAY PROCEDURE 1. Patient serum and control serum should be diluted 10 fold before use. Prepare a series of small tubes (such as 1.5 ml microcentrifuge tubes) and mix 20 µl serum or plasma with 180 µl (0.18 ml) Sample Diluent. PLEASE DO NOT DILUTE THE STANDARDS THEY HAVE ALREADY BEEN PRE- DILUTED 10-FOLD. 2. Secure the desired number of coated wells in the holder. 3. Dispense 20 µl of myoglobin standards, diluted specimens and diluted controls into the appropriate wells. 4. Dispense 200 µl of Enzyme Conjugate Reagent into each well. 5. Thoroughly mix for 30 seconds. It is very important to mix completely. 6. Incubate at room temperature (18-25 C) for 45 minutes. 7. Remove the incubation mixture by flicking plate contents into a waste container. 8. Rinse and flick the microwells 5 times with distilled or deionized water. (Please do not use tap water.) 9. Strike the wells sharply onto absorbent paper or paper towels to remove all residual water drops. 10. Dispense 100 µl of TMB Reagent solution into each well. Gently mix for 5 seconds. 11. Incubate at room temperature for 20 minutes. 12. Stop the reaction by adding 100 µl of Stop Solution to each well. 13. Gently mix 30 seconds. It is important to make sure that all the blue color changes to yellow color completely. 14. Read absorbance at 450 nm with a microtiter well reader within 15 minutes. 12 QUALITY CONTROL Good laboratory practice requires that quality control specimens (controls) be run with each calibration curve to verify assay performance. To ensure proper performance, control material should be assayed repeatedly to establish mean values and acceptable ranges. 13 CALCULATION OF RESULTS 1. Calculate the mean absorbance value (A450) for each set of reference standards, controls and samples. 2. Construct a standard curve by plotting the mean absorbance obtained for each reference standard against its concentration in ng/ml on graph paper, with absorbance values on the vertical or Y axis, and concentrations on the horizontal or X axis. 3. Use the mean absorbance values for each specimen to determine the corresponding concentration of myoglobin in ng/ml from the standard curve. 4. Since the reference standards have already been pre-diluted 10-fold, there is no need for the patient samples or control sera observed values to be multiplied by the dilution factor of 10. However, if the patient samples are diluted to 100-fold, the observed values should be multiplied by 10. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 5

7 Absorbance (450nm) Myoglobin ELISA HZ EXAMPLE OF STANDARD CURVE Results of a typical standard run with optical density readings at 450 nm shown in the Y axis against myoglobin concentrations shown in the X axis. This standard curve is for illustrative purpose only, and should not be used to calculate unknowns. Each laboratory should obtain its own data and standard curve. Myoglobin (ng/ml) Absorbance (450 nm) Myoglobin Conc. (ng/ml) 15 LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Reliable and reproducible results will be obtained when the assay procedure is carried out with a complete understanding of the package insert instructions and with adherence to good laboratory practice. Diagnostic results obtained from the Myoglobin ELISA should be used in conjuction with other diagnostic procedures and information available to the physician.; e.g., additional clinical testing, ECG, symptoms, and clinical observations. The wash procedure is critical. Insufficient washing will result in poor precision and falsely elevated absorbance readings. Patient samples may contain human anti-mouse antibodies (HAMA) which are capable of giving falsely elevated results with assays that utilize mouse monoclonal antibodies. The Myoglobin ELISA assay has been designed to minimize interference from HAMA-containing specimens; nevertheless complete elimination of this interference from all patient specimens cannot be guaranteed. Test results that are inconsistent with the clinical picture and patient history should be interpreted with caution. 16 EXPECTED NORMAL VALUES Normal serum myoglobin levels range from 12 to 100 ng/ml. Values increase slightly with age. 22 Using the Myoglobin ELISA, an evaluation of the clinical data was conducted to determine the normal expected value of the kit. The study yielded normal range values in agreement with industry standards. Eighty-three (83) apparently healthy adults were assayed using the test to establish the normal expected value. The range was found to be between 8.1 and 54.5 ng/ml myoglobin. Each facility should establish its own reference intervals for myoglobin as performed on ELISA test. Other factors should also be considered in the diagnosis of myocardial infarction, as any condition resulting in skeletal or cardiac muscle damage may potentially increase myoglobin levels above the expected normal range. NOTE: Serial sampling may be required to detect elevated levels. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 6

8 17 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 17.1 Clinical Performance A clinical investigation was conducted to determine the accuracy of the Myoglobin ELISA as compared to the Abbott AxSym Myoglobin MHZ. The data is presented below. A statistical study using 150 clinical patient serum samples, ranging in myoglobin concentration from 3.7 ng/ml to ng/ml as analyzed using the Myoglobin ELISA (HZ-3955) (13.0 ng/ml to ng/ml Abbott Myoglobin MHZ), demonstrated equivalent correlation with the AxSym Myoglobin kit as shown below. Correlation coefficient = Slope = Intercept = HZ-3955 Mean = ng/ml Abbott Myoglobin Mean = ng/ml 17.2 Sensitivity The lowest detectable level of myoglobin by this assay is estimated to be 5 ng/ml Hook Effect No high-dose hook effect is observed in this test with patient sample concentrations up to 10,000 ng/ml Precision a. Intra-Assay Precision Within-run precision was determined by replicate determinations of five different serum samples in one assay. Within-assay variability is shown below: Serum Sample # Reps Mean Myo. (ng/ml) ,437 S.D C.V. (%) 3.9% 6.0% 5.5% 5.2% 6.6% b. Inter-Assay Precision Between-run precision was determined by replicate measurements of five different serum samples over a series of individually calibrated assays. Between-assay variability is shown below: Serum Sample # Replicates Mean Myo (ng/ml) S.D C.V. (%) 7.8% 5.2% 11.8% 9.3% 7.2% Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 7

9 17.5 Recovery Various patient serum samples of known myoglobin levels were combined and assayed in duplicate. The mean recovery was 102.8%. PAIR NO. EXPECTED [Myoglobin] (ng/ml) OBSERVED [Myoglobin] (ng/ml) % RECOVERY % % % % % % % % % % % % % % % % Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 8

10 17.6 Linearity Three patient samples were serially diluted to determine linearity. The mean recovery was 105.8%. # Dilution Expected Conc. (ng/ml) Observed Conc. (ng/ml) % Expected 1. Undiluted 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1: Mean = 106.4% % 107.7% 113.6% 111.6% 114.5% 111.2% 101.2% 90.7% 2. Undiluted 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1: % 105.8% 111.2% 111.5% 110.3% 105.4% 86.5% Mean =104.6 % 3. Undiluted 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1: % 104.8% 100.6% 110.8% 106.0% 98.0% 125.0% Mean = 106.5% Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 9

11 17.7 Specificity The following materials were tested for cross-reactivity at concentrations up to the levels indicated below. No cross-reactivity was observed for any of the components. MATERIAL TESTED Interfering Substances Cardiac Tnl Cardiac TnT Cardiac TnC Skeletal Tnl CK-MB CK-MB2 CK-MM CK-BB Tropomyosin Myosin Light Chain Kinase (MLCK) Actin Endogenous Substances Billirubin Cholesterol Triglyceride Total Protein Total Protein Therapeutic Substances Aspirin Coumadin Digoxin Flurosemide (Lasix) Sodium Heparin TEST CONCENTRATION 1000 ng/ml 1000 ng/ml 1000 ng/ml 1000 ng/ml 1000 ng/ml 100 ng/ml 5 µg/ml 10 µg/ml 1000 ng/ml 1000 ng/ml 1000 ng/ml 20 mg/dl 500 mg/dl 1,500 mg/dl 3 g/dl 10 g/dl 0.3 ng/ml 1000 µg/ml 200 ng/ml 400 µg/ml 8 U/ml 18 STANDARDIZATION Human myoglobin Complex was obtained from a qualified vendor, and myoglobin concentration was determined. The material was further diluted with the Myoglobin Sample Diluent and served as Standard Stock Solution for preparing myoglobin reference Standard Sets. The target value of the Standard Stock Solution was confirmed by the Abbott AxSym Myoglobin immunoassay. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 10

12 Per l uso diagnostico in vitro soltanto Conservare a 2 C a 8 C. Denominazioni comuni e di proprietà Human Myoglobin Enzyme Immunoassay ( test imunoenzimatico per la mioglobina umana) 1 USO INTESO Il test ELISA Mioglobina é inteso per la determinazione quantitative di mioglobina nel siero umano. 2 INTRODUZIONE La mioglobina, una proteina emica con un peso molecolare di approssivamente 17,500 Daltons é trovato sia nel muscolo cardiaco che scheletrico. Un danno a questi muscoli dovuto a trauma, ischemia e a malattie che causano miopatie, è associato con un rilascio di mioglobina nel siero. 1,2 Specificamente, dopo una necrosi cardiaca associata ad infarto miocardio (MI), la mioglobina è uno dei primi marker i cui livelli si alzano sopra il livello normale. I livelli di mioglobina aumentano misurabilmente oltre una soglia entro i primi 2-4 ore postinfartico, raggiungono un massimo a 9-12 ore e ritornano al livello di base entro ore. 1,3,4,5 Nell assenza di un trauma ad un muscolo scheletrico o di altri fattori associati all aumento della mioglobina circolante, i suoi livelli sono stati usati come un marker precoce dell infarto miocardio. 4,6,7 Tante pubblicazioni suggeriscono di usare la misura della mioglobina come un aiuto diagnostico nella gestione dell infarto miocardio 5,8 con valori di predicivitá negativa fino al 100% riportati, dopo determinati periodi di tempo dopo l inizio dei sintomi Al contrario di altri enzimi cardiaci come la creatina kinasi e le isoforme MB (p.es. CK e CK/MB) che raggiungono i livelli del siero soltanto dopo molte ore post-infarto (approx. 19 ore), un massimo dei livelli della mioglobina puó essere aspettato entro 6-9 ore 16. Il test immunoenzimatico della mioglobina fornisce un test rapido, sensitivo ed affidabile per la misura quantitativa della mioglobina nel siero. Gli anticorpi sviluppati per questo test determinano una concentrazione minima di 5,0 ng/ml, senza reattivitá ad incrocio con enzimi cardiaci o scheletrici correlati. 3 PRINCIPIO DEL TEST Il test ELISA mioglobina é basato sul principio di un test immunoassorbente legato ad enzimi nella fase solida. 17,18 Il test usa un unico anticorpo monoclonale diretto contro un area antigenica determinante della molecola della mioglobina. Un anticorpo monoclonale murino anti-mioglobina è usato per l immobilizzazione su fase solida (sui pozzetti microtiter). Un anticorpo di pecora anti-mioglobina legato ad un enzima (perossidasi di rafano) è aggiunto nella soluzione tracciante. Il campione del test puó reagire simultaneamente con entrambi gli anticorpi, risultando in molecole di mioglobina legati a sandwich tra la fase solida e gli anticorpi coniugati ad enzimi. Dopo una incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente, i pozzetti sono lavati con acqua per rimuovere gli anticorpi marcati non legati. Un reagente TMB (benzidine tetrametilico) è aggiunto ed incubato per 20 minuti, risultando nello sviluppo di un colore blu. Lo sviluppo di colore è terminato dall aggiunta di una soluzione d arresto che cambia il colore dal blu al giallo. La concentrazione di mioglobina è direttamente proporzionale all intensitá di colore nel campione. L assorbanza viene misurata spettrofotometricamente a 450 nm. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 11

13 4 REAGENTI 4.1 Materiale provisto con il kit Pozzetti ricoperti di anticorpi (1 piastra, 96 pozzetti) Pozzetti microtiter ricoperti con anticorpo monoclonale anti-mioglobina murino. Set di Standard di riferimento (0.5 ml/flacone, 1 set/kit) Contiene 0, 25, 100, 250, 500 e 1000 ng/ml mioglobina, liquida, pronto all uso. Questi standard sono stati pre-diluiti 10 x. Non diluirli ulteriormente. Diluente dei campioni (25 ml/bottiglia) Contiene un tampone fosfato e 1.0% (w/v) Pro-Clin come conservante. Reagente del tracciante enzimatico (22 ml/flacone) Contiene un anticorpo anti-mioglobina coniugato alla perossidasi di rafano in una soluzione conservata con Tris- tampone BSA. Reagente TMB (11 ml/bottiglia) Contiene una soluzione di TMB. Stop Solution (1 bottiglia, 11 ml/bottiglia) Contiene acido ipoclorico diluito (1N HCl). 4.2 Materiali richiesti ma non forniti Pipette di precisione: 20 µl, 50 µl, 200 µl e 1.0 ml Punte monouso Acqua distillata Mixer vortex od equivalente. Carta assorbenteo fazzolletti Carta grafica Spettrofotometro per micropiastre 5 AVVERTENZE E PRECAUZIONI PER L UTENTE 1. ATTENZIONE: Questo kit contiene materiale umano. Il materiale d origine usato per il kit é stato testato e trovato negativo per HBsAg, HIV 1/2 e HCV con metodi approvati dalla FDA. Comunque nessun metodo puó assicurare la completa assenza di questi agenti. Pertanto, tutti i prodotti di sangue, incluso campioni di siero, devono essere considerati potenzialmente infettivi. L uso e lo smaltimento devono essere regolati dalle rispettive norme nazionali di sicurezza, dove esistono Non usare i reagenti dopo la data di scadenza e non mescolare componenti di questo kit con numeri di lotto differenti. 3. Non usare i reagenti se sono diventati opachi o se si sospettano contaminazioni. 4. Non usare i reagenti se il contenitore è danneggiato. 5. Rimettere i tappi immediatamente dopo l uso. Non scambiare i tappi. 6. Ogni pozzetto puó essere usato soltanto una volta. 7. Non pipettare i reagenti con la bocca. 8. Soluzioni che contengo additivi o conservanti, come l azide di sodio, non devono usati in questo test. 9. Evitare il contatto con 1N HCl. Puó causare irritazioni cutanee e bruciature. Se occorre, lavare con abbondante acqua e cercare l aiuto di un medico se l irritazione persiste. 10. Per la sola diagnosi in vitro. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 12

14 6 CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE 1. Conservare il kit non aperto a 2-8 C dopo il ricevimento e quando non viene usato, fino alla data di scadenza indicata sull etichetta. Riferirsi all etichetta della scatola per la data di scadenza. 2. I reagenti usati ed aperti sono stabili fino alla data indicate se conservati a 2-8 C. 3. Conservare i pozzetti microtiter nella busta chiusa con l essiccante per minimizzare l esposizione all umiditá. 7 INSTRUMENTAZIONE Uno spettrofotometro per micropiastre con una aperture di 10 nm o meno e una densitá ottica nel campo da 0 a 3 OD o superiore a 450 nm é accettabile per le misure di assorbimento. 8 PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (18-25 C) prima dell uso. Siero di pazienti e siero di controlli devono essere diluiti 10 volte prima dell uso. Preparare una serie di tubetti (p.es. tubetti per microcentrifughe da 1.5 ml) e mescolare 20 µl di siero con 180 µl (0.18 ml) del diluente dei campioni. SI PREGA DI NON DILUIRE GLI STANDARD CHE SONO GIÀ STATI DILUITI 10 x PRECEDENTEMENTE. Campioni con concentrazioni aspettati di mioglobina superiori a 1000 ng/ml possono essere diluiti ulteriormente 10 x con il diluente per la quantificazione. 9 COLLEZIONAMENTO DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE L uso di campioni di SIERO é richiest per questo test. I campioni devono essere prelevati usando tecniche di venipuntura. Rimuovere il siero dal coagulato entro 60 minuti dopo la raccolta. Campioni che non possono essere analizzati entro 24 ore dalla raccolta possono essere congelati a -20 C o inferiore e rimaranno stabili per sei mesi. I campioni non devono essere congelati e scongelati ripetutamente prima dell analisi. NON conservarli in congelator frost free, dato che si possono occasionalmente scongelare. Campioni congelati e quelli che si presentano turbidi e/o presentano materiale particolato, devono essere centrifugati prima dell uso. 10 NOTE AL PROCEDIMENTO Raccomandazioni al pipettamento (pipette singoli o multicanali): Il pipettamento di tutti i campioni, i controlli e degli standard deve essere completato entro 3 minuti. Tutti gli standard, i controlli e campioni devono essere analizzati in doppio allo stesso momento, in modo che tutte le condizioni del test siano uguali. Si raccomanda di determinare l assorbanza dei pozzetti entro 15 minuti dall aggiunta della soluzione d arresto. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 13

15 11 PROCEDIMENTO D ANALISI 1. I sieri dei pazienti e i sieri di controllo devono essere diluiti 10 volte prima dell uso. Patient serum and control serum should be diluted 10 fold before use. Preparare una serie di tubetti (p.es. tubetti per microcentrifughe da 1.5 ml) e mescolare 20 µl di siero con 180 µl (0.18 ml) del diluente dei campioni. SI PREGA DI NON DILUIRE GLI STANDARD CHE SONO GIÀ STATI DILUITI 10 x PRECEDENTEMENTE. 2. Fissare il numero necessario di pozzetti nel sostegno. 3. Aggiungere 20 µl degli standard di mioglobina, dei campioni diluiti e dei controlli diluiti nei pozzetti appropriati. 4. Aggiungere 200 µl del reagente dell enzima tracciante in ogni pozzetto. 5. Mescolare accuratamente per 30 secondi. E imortante mescolare il contenuto completamente. 6. Incubare a temperature ambiente (18-25 C) per 45 minuti. 7. Rimuovere la miscela d incubazione capovolgendo la piastra. 8. Lavare e svuotare I pozzetti 5 volte con acqua distllata o deionizzata. (non usare l acqua del rubinetto.) 9. Premere I pozzetti contro la carta assorbente per rimuovere ogni goccia d acqua. 10. Aggiungere 100 µl di reagente TMB in ogni pozzetto. Mescolare cautamente per 5 secondi. 11. Incubare a temperature ambiente per 20 minuti. 12. Fermare la reazione aggiungendo 100 µl della soluzione d arresto in ogni pozzetto. 13. Mescolare per 30 secondi. Assicurarsi che il colore blu vira completamente al giallo. 14. Determinare l assorbanza a 450 nm con uno spettrofotometro per piaster entro 15 minuti. 12 CONTROLLO QUALITÀ Good laboratory practice requires that quality control specimens (controls) be run with each calibration curve to verify assay performance. To ensure proper performance, control material should be assayed repeatedly to establish mean values and acceptable ranges. 13 CALCOLO DEI RISULTATI 1. Calcolare il valore medio di assorbanza (A450) per ogni coppia di standard, controlli e campioni. 2. Costruire una curva standard riportando i valori medi di assorbanza per ogni standard di riferimento contro la sua concentrazione in ng/ml su carta grafica, con i valori di assorbanza sull ordinata Y e le concentrazioni sull ascisse X. 3. Usare il valore medio di ogni campione per determinare la sua concentrazione di myoglobina in ng/ml dalla curva standard. 4. Dato che gli standard di riferimento sono stati già pre-diluiti 10 volte, non bisogna moltiplicare i sieri di pazienti o dei controlli con un fattore di diluizione 10. Se comunque il siero dei pazienti veniva diluito 100 volte, il valore osservato deve essere moltiplicato per 10. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 14

16 Absorbance (450nm) Myoglobin ELISA HZ ESEMPIO DELLA CURVA STANDARD I risultati di una tipica curva standard ottenuta dalle misure della densità ottica a 450 nm riportati sull ordinata e le concentrazioni di mioglobina riportati sull ascisse. Questa curva standard é soltanto per scopi demostrativi e non deve essere usato per calcolare concentrazioni ignote. Ogni laboratorio dovrebbe costruire la propria curva standard. Mioglobina (ng/ml) Assorbanza (450 nm) Myoglobin Conc. (ng/ml) 15 LIMITI DEL PROCEDIMENTO Risultati affidabili e riproducibili saranno ottenuti quando il procedimento é effettuato con una completa comprensione delle istruzioni e attenendosi alla good laboratory practice. I risultati diagnostici ottenuti dal test ELISA Mioglobina devono essere usati assieme ad altri procedimenti diagnostici e ad informazioni del medico; p.es. test clinici, ECG, sintomi e osservazioni cliniche. Il procedimento di lavaggio è critico. Lavaggio insufficiente porterà ad una scarsa precisione e a valori di assorbimento falsamente elevati. I campioni di pazienti possono contenere anticorpi umani anti-topo (HAMA) che possono dare risultati falsamente elevati con metodi di test che usano anticorpi monoclonali di topo. Anche se il test ELISA mioglobina è stato costruito per minimizzare le interferenze da specie contenenti HAMA, una completa eliminazione di queste interferenze in tutti i pazienti non puó essere garantita. I risultati del test che sono inconsistenti con il quadro clinico e la storia del paziente devono essere interpretati con cautela. 16 VALORI NORMALI ASPETTATI I livelli normali di mioglobina sono nel campo tra 12 a 100 ng/ml. I valori si inalzano leggermente con l età. 22 Usando il test ELISA mioglobina, è stata condotta una valutazione dei dati clinici per determinare i valori normali aspettati con il test kit. Lo studio risultava in valori nel campo in accordo con gli standard industriali. Ottantatre (83) adulti apparentemente sani sono stati analizzati usando il test per stabilire i valori normali da aspettare. Il campo è stato trovato di essere tra 8.1 e 54.5 ng/ml mioglobina. Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori di riferimento per la mioglobina con il test ELISA. Altri fattori devono essere presi in considerazione per la diagnosi dell infarto miocardico, dato che ogni danno al muscolo cardiaco o scheletrico puó potenzialmente alzare i livelli di mioglobina oltre il campo normale aspettato. NOTA: raccolta seriale puó essere richiesto per determinare livelli elevati. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 15

17 17 CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO 17.1 Rendimento clinico Per dettagli più precisi consultare la metodica in inglese Sensitività Il livello di mioglobina minima analizzabile é di 5 ng/ml Effetto Hook 17.4 Precisione 17.5 Ritrovabilità 17.6 Linearità 17.7 Specificità Per dettagli più precisi consultare la metodica in inglese. 18 STANDARDIZZAZIONE Il complesso della mioglobina umana é stato ottenuto da un fornitore qualificato e la concentrazione di mioglobina è stata determinata. Il materiale è stato conseguentemente diluito con il diluente dei campioni Mioglobina e serviva come soluzione stock degli standard per preparare i set degli standard di riferimento di mioglobina. Il valore esatto della soluzione stock degli standard è stato confermato dal test immunologico Abbott AxSym Myoglobin. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 16

18 19 REFERENCES / LITERATURE / BIOGRAFIA 1. Kagen, L.J.: Myoglobin: Methods and Diagnostic Uses, CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 2:273; (1978). 2. Juronen, E.L., Viikmaa, M.H., and Mikelsarr, A.V.N.: Rapid, simple and sensitive antigen capture ELISA for the quantitation of myoglobin using monoclonal antibodies, J. Imm. Meth.: 111, 109; (1988). 3. Chapelle JP. et al.: Serum myoglobin determinations in the assessment of acute myocardial infarction. Eur. Heart Journal, 3:122, (1982). 4. Cairns, J.P., et.al.: Usefulness of serial determinations of myoglobin and creatine kinase in serum compared for assessment of acute myocardial infarction, Clin. Chem. News, 29: 469, (1983). 5. Silva, D.P., et.al.: Development and application of antibodies to human cardiac myoglobin in rapid fluolrescence immunoassay, Clin. Chem., 37: 1356, (1991). 6. Ellis AK.: Patters of myoglobin release after reperfusion of injured myocardium. Clin. Chem., 72:639, (1985). 7. Mair J. et al.: Rapid diagnosis of myocardial infarction by immunoturbidimetric myoglobin measurement (letter). Lancet, ;337:1343, (1991). 8. Chapelle, J.P.: Myoglobin. Clin. Chem. News, 17:22, (1991). 9. Hamfelt, A., et. al.: Use of biochemical tests for myocardial infarction in the county of Vasternorrland, a clinical chemistry routine for the diagnosis of myocardial infarction. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 200:20, (1990). 10. Tucker, J.F., et.al.: Early diagnostic efficiency of cardiac troponin I and Troponin T for acute myocardial infarction, Academic Emergency Medicine: 4(1): 13-21; (1997). 11. de Winter, R.J., et.al.: Value of myoglobin, troponin T and CK-Mbmass in ruling out an acute myocardial infarction in the emergency room, Circulation: 92(12): ; (1995). 12. Montague, C., Kircher, T.: Myoglobin in early evaluation of acute chest pain, Amer. J. Clin. Path.: 104(4): 472-6; (1995). 13. Tucker, J.F., et.al., Value of serial myoglobin levels in the early diagnosis of patients admitted for acute myocardial infarction, Annals of Emergency Medicine: 24(4): 704-8; (1994). 14. Roxin, L.E., et.al.: The value of serum myoglobin determinations in the early diagnosis of acute myocardial infarction, Acta Medica Scand.: 215(5): ; (1984). 15. Sylven, C., Bendz, R.: Myoglobin, creatine kinase and its isoenzyme MB in serum after acute myocardial infarction, Eur. J. Cardiol.: 8(4-5): ; (1978). 16. Norregaard-Hansen, K., et. al.: Early observations of S-myoglobin in the diagnosis of acute myocardial infarction. The influence of discrimination limit, analytical quality, patient s sex, and prevalence of disease. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 46: , (1986). 17. Engvall, E., Methods in Enzymology, Volume 70, VanVunakis H. and Langone, J.J. (eds.), Academic Press, New York, NY, , (1980). 18. Uotila, M., Ruouslahti, E. And Engvall, E., J. Immunol. Methods, 42, 11-15, (1981). 19. U.S. Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration, 29 CFR Part Occupational Exposure ot Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register; 56(235):64175, (1991). 20. USA Center for Disease Control/National Institute of Health Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, (1984). 21. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue: Approved Guideline. NCCLS Document M29-A, (1997). 22. Clinical Guide to Laboratory Tests. N.W. Tietz, Ed., 3rd Edition, W.B. Saunders, Co., p. 482, (1995). Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 17

19 SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS RUO Symbol English Deutsch Français Español Italiano Consult instructions for use European Conformity Gebrauchsanweisung beachten CE-Konfirmitätskennzeichnung Consulter les instructions d utilisation Conformité aux normes européennes In vitro diagnostic Usage Diagnostic In-vitro-Diagnostikum device in vitro For research use only Nur für Forschungszwecke Seulement dans le cadre de recherches Consulte las instrucciones de uso Consultare le istruzioni per l uso Conformidad europea Conformità europea Para uso Diagnóstico in vitro Sólo para uso en investigación Per uso Diagnostica in vitro Solo a scopo di ricerca Catalogue number Katalog-Nr. Numéro de catalogue Número de catálogo Numero di Catalogo Lot. No. / Batch code Chargen-Nr. Numéro de lot Número de lote Numero di lotto Contains sufficient for <n> tests/ Ausreichend für n Ansätze Contenu suffisant pour n tests Contenido suficiente para <n> ensayos Contenuto sufficiente per n saggi Storage Temperature Lagerungstemperatur Température de conservation Expiration Date Temperatura de conservación Temperatura di conservazione Mindesthaltbarkeitsdatum Date limite d utilisation Fecha de caducidad Data di scadenza Legal Manufacturer Hersteller Fabricant Fabricante Fabbricante Distributed by Distributor Vertreiber Distributeur Distribuidor Distributore Content Content Inhalt Conditionnement Contenido Contenuto Volume/No. Volume / No. Volumen/Anzahl Volume/Quantité Volumen/Número Volume/Quantità Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 18

20 Ordering Information Myoglobin ELISA HZ-3955 For orders, please contact : Hölzel Diagnostika Handels GmbH Hansaring 10 D Köln Tel.: Fax: For technical advice, please contact: Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 19

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