Calprotectina ELISA KIT Per la determinazione di calprotectina fecale in vitro (MRP 8/14)

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1 Li StarFish S.r.l. Via Cavour, Cernusco sul Naviglio (MI), Italy Tel Fax Calprotectina ELISA KIT Per la determinazione di calprotectina fecale in vitro (MRP 8/14) 1

2 1. APPLICAZIONE Il kit ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) presentato è indicato per la determinazione in vitro di Calprotectina (MRP 8/14) nelle feci. E da utilizzarsi solamente per la diagnosi in vitro. 2. INTRODUZIONE Nomi alternativi della Calprotectina: Calgranulina A: MRP8, CP-10 (nel topo) Calgranulina B: MRP 14, S100A9 MRP 8/14: L1, (p8,14), p34 La Calprotectina è una proteina legante il calcio secreta prevalentemente dai neutrofili e dai monociti. La Calprotectina fecale è un marker di patologie infiammatorie e neoplastiche intestinali. E spesso difficoltoso discriminare fra sindromi di intestino irritabile e problemi organici cronici. Questo porta nella maggior parte dei casi ad eseguire indagini invasive (es: colonscopie ). Il test per la determinazione di Calprotectina permette di differenziare i due gruppi di pazienti. I livelli di Calprotectina fecale correlano significativamente con gli accertamenti istologici ed endoscopici nel morbo di Crhon e nella retto-colite ulcerosa tanto quanto l eliminazione nelle feci di Indio-111-marcato da parte dei granulociti neutrofili. Per questo motivo è suggerito come gold standard del livello di infiammazione nelle patologie infiammatorie intestinali. D altro canto la determinazione di Indio-111-marcato è estremamente costosa (ospedalizzazione del paziente, dispositivi per l analisi di materiale radioattivo) ed è vincolata all esposizione del paziente a radioattività. Per questa ragione è sconsigliata la determinazione ripetuta in bambini e gestanti. Livelli elevati di Calprotectina sono da considerarsi valori predittivi migliori di altri markers di infiammazione tipici, quali PCR e VES. Il confronto fra uno screening condotto con questo marker e i valori di sangue occulto nelle feci nel cancro del colon-retto ha dimostrato chiaramente la superiorità diagnostica del test della Calprotectina fecale. I risultati dimostrano un elevato significato diagnostico. Ad un basso livello di Calprotectina nelle feci corrisponde un elevata possibilità che non esistano patologie organiche intestinali. INDICAZIONI Marker di infiammazione acuta Valutazione del grado di infiammazione gastro-intestinale Monitoraggio del morbo di Crhon, Colite ulcerosa o dopo rimozione di polipi intestinali o cancro del colonretto. Diagnosi differenziale tra semplici problemi di intestino irritabile (IBS) e patologie intestinali organiche (IBD) 3. MATERIALE FORNITO N. catalogo denominazione Componenti del kit quantità K 6930MTP PIASTRA Supporto con strisce 12 8 pozzetti pretrattate K 6930WP WASHBUF Tampone di lavaggio ELISA ml 10 K 6930A2 AB Anticorpo concentrato 50 µl (anticorpo monoclonale anti-calprotectina (MRP8/14), legato a biotina) K 6930ST STD Standard di Calprotectina, 5 flaconi pronti all uso (0; 3.9; 15.6; 62.5; 250 ng/ml) K 6930KO CTRL Controllo, pronto all uso 1 flacone (vedere quanto specificato per il range) K 6930K CONJ Coniugato concentrato 50 µl (legato alla perossidasi exravidina) K 6930TMB SUB Substrato TMB 15 ml (tetrametilbenzidina), pronto all uso K 6930AC STOP Soluzione d arresto, pronta all uso 7 ml 2

3 4. MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO Acqua bidistillata Bilancia analitica Pipette da µl Parafilm Agitatore orizzontale di micropiastre con incubatore a 37 C Dispensatore per micropiastre o dispensatore automatico Centrifuga da 3000 g Vortex-mixer Vetreria da laboratorio Lettore di micropiastre a 450 nm ( lunghezza d onda di riferimento 620 o 690 nm) 1. PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI Al fine di poter utilizzare più volte i reattivi assicurarsi che siano conservati alle condizioni descritte sulle etichette. Preparare solo le quantità necessarie per ciascuna determinazione. Il kit può essere utilizzato per 4 volte entro la data di scadenza espressa sulla confezione. I reagenti con volumi inferiori a 100 µl possono essere centrifugati prima dell utilizzo per evitare perdite di volume. Il tampone ELISA concentrato (WASHBUF) deve essere diluito con acqua bidistillata 1:10 prima dell uso (100 ml di concentrato ml di acqua bidistillata), miscelare bene. Potrebbero verificarsi delle cristallizzazioni dovute all elevata concentrazione di sali nella soluzione madre. I cristalli devono essere sciolti a temperatura ambiente o in acqua a 37 C prima della diluizione. Il tampone concentrato è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza presente sull etichetta. La soluzione diluita può essere conservata in un flacone chiuso a 2-8 C per 1 mese. L anticorpo monoclonale (AB) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl AB e 10 ml di tampone). L anticorpo è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza riportata. L anticorpo diluito non è stabile e non può essere conservato. Il coniugato (CONJ) deve essere diluito 1:1000 con il tampone (WASHBUF) (10 µl CONJ e). L anticorpo è stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza riportata. Il coniugato diluito non è stabile e non può essere conservato. Tutti gli altri reagenti sono pronti all uso. Sono stabili fino alla data di scadenza se conservati a 2-8 C. 6. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Estrazione del campione di feci Il tampone (WASHBUF) è usato come soluzione di estrazione. 1. si raccomanda l uso del dispositivo di raccolta del campione di feci per dosarne 100 mg (kit di raccolta da Roche Diagnostic, Mannheim, Germany; cat.# ). Il campione di feci deve essere sospeso in 5 ml di tampone. Volume costante del tampone: 5 ml Fattore costante di diluizione: 1:50 2. in alternativa, il campione di feci può essere pesato manualmente entro un range di mg. a. l aggiunta di 5 ml di tampone non dipende dalla quantità del campione. Volume costante del tampone: 5 ml Il fattore di diluizione varia a seconda della quantità di campione come mostrato nei calcoli successivi. Controllare la tabella con i fattori corretti qui di seguito: 3

4 Peso (mg) Fattore di diluizione Peso (mg) Fattore di diluizione b. Il volume del tampone per i singoli campioni dipende dalla quantità di campione (vedi tabella). Il fattore di diluizione rimane costante volume del tampone variabile fattore di diluizione costante: 1:50 Ne consegue che, lo stesso fattore di diluizione può essere usato per tutti i campioni nella valutazione successiva dei risultati. Peso (mg) Volume del tampone (ml) Peso (mg) Volume del tampone (ml) Successivamente, miscelare le feci con il tampone; vortex per almeno 30 secondi a seconda della consistenza del campione. Trasferire circa 1 ml di sospensione (1 passaggio di diluizione) in un tubo Eppendorf e centrifugare per 5 minuti a rpm (=13000g) DILUIZIONE DEL CAMPIONE Campione di feci Il sovranatante ottenuto con l estrazione (1 passaggio di diluizione) è diluito 1:50 con il tampone (WASHBUF). Per esempio: 20 µl di sovranatante (diluizione 1) µl di tampone (WASHBUF) = 1:50 (2 passaggio di diluizione) per l analisi, pipettare 100 µl di sovranatante del 2 passaggio di diluizione per pozzetto. La Calprotectina nelle feci è da considerarsi stabile per 6 giorni circa. In ogni caso, si raccomanda di conservare I campioni per non più di 48 ore a 2-8 C. Periodi di conservazione più lunghi prevedono lo stoccaggio a 20 C. Scongelare lentamente i campioni, ad esempio una notte a 2-8 C, e portare a temperatura ambiente prima dell analisi. (Poullis A et al (2002) Aliment Pharmacol Thr 16: ) 4

5 2. PROCEDURA Principio del test Il sistema utilizza la tecnica a sandwich con due anticorpi monoclonali selezionati che legano la Calprotectina umana. Gli standard, i controlli e i campioni diluiti dei pazienti che devono essere processati sono aggiunti ai pozzetti della micropiastra che presentano sul fondo un anticorpo monoclonale ad alta affinità anti-calprotectina umana. Durante la prima incubazione, la Calprotectina, presente nel campione, si lega con l anticorpo fissato. Nell incubazione successiva, un anticorpo monoclonale legato a biotina anti-calprotectina umana è aggiunto al contenuto di ogni pozzetto della micropiastra. Viene poi aggiunto in ogni pozzetto un coniugato legato alla exravidina e successivamente si formano i complessi: l anticorpo legante - Calprotectina umana anticorpo biotinilato di rilevazione coniugato con perossidasi. La tetrametilbenzidina è utilizzata come substrato per la perossidasi. Infine, viene aggiunta una soluzione acidificante d arresto per terminare la reazione. Il colore cambia da blu a giallo. L intensità della colorazione gialla dipende dalla concentrazione di Calprotectina presente nel campione. Si ottiene una curva dose-risposta dell unità di assorbanza (densità ottica, OD a 450 nm) riferita alla concentrazione, usando come riferimento i valori ottenuti dagli standard. La Calprotectina presente nei campioni dei pazienti è determinata direttamente da questa curva. Procedura del test 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (18-26 C) e miscelare bene 2. Riportare le posizioni di STANDARD/CAMPIONE/CONTROLLO in un protocollo operativo 3. Preparare tante strisce della micropiastra quante sono necessarie. Stoccare le strisce che non vengono utilizzate a 2-8 C dopo averle coperte. Sono stabili fino alla data di scadenza. 4. Lavare berne ogni pozzetto per 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascuno di essi. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura. 5. Aggiungere 100 µl di STD/CAMPIONE/CTRL in doppio nei rispettivi pozzetti 6. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 7. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura. 8. Aggiungere 100 µl di AB (anticorpo di rilevazione) in ciascun pozzetto 9. Coprire bene la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 10. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura 11. Aggiungere 100 µl di CONJ (coniugato) in ciascun pozzetto 12. Coprire con cura la piastra e incubare per 1h a 37 C su un agitatore orizzontale** 13. Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto. Lavare 5 volte dispensando 250 µl di tampone diluito in ciascun pozzetto. Dopo l ultimo lavaggio, la micropiastra capovolta può essere battuta su carta assorbente per facilitare l asciugatura 14. Aggiungere 100 µl di SUB (substrato) in ciascun pozzetto 15. Incubare per minuti al buio* a temperatura ambiente (18-26 C) 16. Aggiungere 50 µl di STOP (soluzione d arresto) in ciascun pozzetto, miscelare perfettamente 17. Determinare immediatamente l assorbanza con un lettore di micropiastre a 450 nm contro 620 (o 690) nm come riferimento. Se non vi è la possibilità di una lunghezza d onda di riferimento, leggere solo a 450 nm. Se lo standard più alto cade fuori dalla capacità del fotometro, l assorbanza deve essere misurata immediatamente a 405 nm contro un riferimento di 620 nm. 5

6 *l intesità del colore cambia con la temperatura. Si raccomanda di osservare il cambiamento di colore e di fermare la reazione quando si presenta una chiara differenza. **l incubazione a 37 C su un agitatore orizzontale è raccomandata dalla metodica, se non è possibile miscelare durante l incubazione, si raccomanda di incubare a 37 C senza alcuna agitazione. 8. RISULTATI I seguenti algoritmi possono essere utilizzati alternativamente per calcolare i risultati. Si raccomanda di usare l algoritmo a 4 parametri. 1. algoritmo a 4 parametri si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione. Quando si usa un ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore inferiore ad 1 (es. 0.01) 2. calcolo point-to-point si raccomanda un ordinata lineare per la densità ottica ed un ascissa lineare per la concentrazione. 3. curva algoritmica si suggerisce di utilizzare in ordinata lineare la densità ottica e in ascissa logaritmica la concentrazione. Quando si usa un ascissa logaritmica, lo zero del calibratore deve essere corrispondente ad un valore inferiore ad 1 (es. 0.01) L accettabilità dei risultati potrebbe essere verificata prima di una loro validazione. Se questo non è possibile con il programma in uso, un controllo dei risultati in doppio potrebbe essere fatto manualmente. Campioni di feci Per ottenere la concentrazione di Calprotectina nei campioni di feci, moltiplicare il valore ottenuto con il fattore di diluizione stabilito nella preparazione del campione: preparazione del campione 1 e 2b: fattore di diluizione costante: 1:50 moltiplicare il risultato ottenuto con 2500 (1 passaggio di diluizione 2 passaggio di diluizione) per ottenere la concentrazione finale preparazione del campione 2a: il fattore di diluizione è variabile il fattore di diluizione corrispondente è preso dalla tabella e deve essere moltiplicato per 50 (2 passaggio di diluizione) per ottenere la concentrazione finale. 6

7 Curva di calibrazione STD OD1 OD2 Media OD CV (%) Conc I dati sono solo dimistrativi e non possono essere utilizzati per verificare i risultati delle determinazioni. 7

8 Sensibilità La sensibilità è stata misurata a B o + 1SD. Lo zero di riferimento è stato misurato 24 volte. Campione Calprotectina valore medio [OD] Deviazione standard (SD) Limite di lettura Linearità Due campioni sono stati diluiti con il tampone e poi analizzati. I risultati sono mostrati di seguito: Campione Diluizione Atteso Rilevato A B PRECAUZIONI solo per diagnostica in vitro devono essere osservate le linee guida del controllo di qualità il materiale di derivazione umana presente nel kit è stato testato ed è negativo per HIV, Epatite B ed Epatite C. In ogni caso, per ragioni di sicurezza, si raccomanda di trattare ogni componente come potenzialmente infetto. I reagenti contengono sodio azide e mertiolato come battericida. Sono entrambi tossici. I substrati per le reazioni enzimatiche colorimetriche sono tossici e cancerogeni. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La soluzione di arresto è composta da acido solforico, che è un acido forte. Anche diluito va maneggiato con cura. Può causare bruciature e deve essere maneggiato con guanti, occhiali e camice. Gli schizzi devono essere immediatamente risciacquati con abbondanti quantità d acqua. 13. ACCENNI TECNICI Non utilizzare componenti del kit di lotti differenti I reagenti non devono essere usati oltre la data di scadenza espressa sull etichetta La soluzione del substrato deve rimanere incolore fino all utilizzo Per assicurare risultati corretti è necessario chiudere in modo appropriato le piastre durante le incubazioni. Evitare la produzione di schiuma quando si miscelano i reagenti La seduta deve procedere seguendo quanto spiegato nel manuale 9

9 9. RACCOMANDAZIONI I campioni di feci con valori di Calprotectina più alti dello standard maggiore devono essere diluiti con il tampone e riletti. 10. CONTROLLO DI QUALITA Immundiagnostik AG raccomanda l uso di campioni di controllo per il controllo di qualità interno, se sono reperibili. I campioni di controllo dovrebbero essere analizzati ad ogni seduta. L accettabilità dei risultati deve essere verificata con appropriati metodi statistici. I risultati dei campioni dei pazienti potrebbero non essere validi se nella stessa seduta uno o più valori del controllo di qualità sono fuori dai limiti. Valori attesi Valori normali (1g di feci è equivalente ad 1ml) Calprotectina fecale: < 15 mg/l Area grigia mg/l Si suggerisce a ciascun laboratorio di stabilire dei propri range di concentrazione. 11. CARATTERISTICHE DEL TEST Precisione e riproducibilità Intra-Assay (n=40) Campione Calprotectina CV [%] Inter-Assay (n=20) Campione Calprotectina CV [%] Due campioni sono stati miscelati con 4 differenti concentrazioni di standard di Calprotectina e seguente schema. misurati usando il n=2 Campione Aggiunta Calprotectina attesa Calprotectina rilevata 8

10 14. NOTE GENERALI SUL TEST Questo sistema è stato prodotto e presentato sul mercato in accordo con le linee guida IVD del 98/79/EC. Tutti i reagenti contenuti nel kit sono solo per uso diagnostico in vitro. Sono state osservate le linee guida per i laboratori bio-medici. I tempi di incubazione, le temperature di incubazione e i volumi utilizzati sono definiti nella procedura. Ogni variazione della procedura del test, non accordata con la casa produttrice, può influenzare i risultati del test. Immundiagnostik AG non è responsabile degli eventuali danni recati da un uso non appropriato. Segnalazioni e reclami devono essere fatti entro 14 giorni dal ricevimento del prodotto. Il prodotto deve essere rispedito ad Immundiagnostik accompagnato da una spiegazione scritta. 15. BIBLIOGRAFIA 1. Poullis A et al. (2002) Aliment pharmacol Thr 16 : Fagerhol et al. (2000) The Lancet 356 : Tibble et al. (2000) Gut 47 : Tibble et al. (2000) Gastro 119 :

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