DETERMINAZIONE DELLA GUAZATINA NEGLI AGRUMI: ASPETTI ANALITICI

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1 DETERMINAZIONE DELLA GUAZATINA NEGLI AGRUMI: ASPETTI ANALITICI SERENA LAZZARO *,, PAOLO BRANCA ** * U.O.S. n. 34 A.S.C.A. - Analisi e Servizi per la Certificazione in Agricoltura- Ispica (Rg) **Arpa Piemonte - Polo Alimenti - La Loggia (To)

2 LA GUAZATINA È UN FUNGICIDA DA CONTATTO NON SISTEMICO LARGAMENTE IMPIEGATA SU: CEREALI CONCIA DELLE SEMENTI AGRUMI IMMERSIONE (bulk dip) TRATTAMENTI POST RACCOLTA FUMIGANTE DURANTE IL PACKING

3 APPARTIENE ALLA CLASSE DELLE GUANIDINE NH R N C NH 2 H

4 DEFINIZIONE IUPAC: Una miscela di prodotti di reazione, tra poliammine - principalmente octametilendiammine, iminodi (octametilen)diammine, octametilenbis (imino-octametilen)diammine - e cianammide.

5 Poliammine Cianammide H 2 N (CH 2 ) 8 NH 2 H 2 N (CH 2 ) 8 - NH 3 / Catalizzatore NH (CH 2 ) 8 NH 2 NH 2 CN CH 3 COOH - NH 3 / Catalizzatore H 2 N (CH 2 ) 8 NH (CH 2 ) 8 NH 2 n

6 PRODOTTI PRIORITARI DI REAZIONE: GUAZATINA UNA MISCELA DI GUANIDINE

7 NG NH 2 H 2 N N H NH 2 GG H 2 N N H N NH H 2 NH NH GNG N H 2 NH 2 N H H N N H NH NH 2 H N NH NH 2 2 GGN N H 2 N H N NH 2 H N NH NH 2 2 NH GGG N H 2 N H N N H NH 2 H N NH NH 2 2 GGGN N H 2 N H N N NH 2 GGGG N H 2 H N NH NH 2 2 N H N H N NH 2 N H N NH 2 H N NH NH 2 N = gruppo amminico G = gruppo amminico (NH o NH ) guanidato

8 COMPOSIZIONE DELLA GUAZATINA 9.8 % 29.5 % GG 4.5 % 8.1 % 30.6 % 1.4 % GNG GGN GGG 89% + OTHER AMINES Report FAO 1997 International Portal on Food Safety, Animal and Plant Health 5.1 %

9 COMPOSIZIONE DELLA GUAZATINA 9.8 % 29.5 % GG 4.5 % 8.1 % GNG GGN STD 30.6 % GGG 1.4 % 5.1 %

10 Lyon 1997, Joint Meeting of the FAO panel of experts on pesticide residues in food and enviroment and WHO core assessement group: Guazatine moderately hazardous, with an oral LD 50 value in rats of 280 mg/kg bw

11 The Meeting concluded that the residue data were not adequate for cistrus fruits and recommended the withdrawal of the existing MRL of 5 ppm Australia Nuova Zelanda Austria Svezia Finlandia Norvegia Spagna Germania

12 Per il cereali Guideline Level: 0,05 ppm

13 Ministero della Salute: Nociva e pericolosa per l ambiente oltre ad essere altamente tossica per gli ambienti acquatici.

14 Nel 2003, l assessorato all ambiente della provincia di Firenze indica la Guazatina tra i fitofarmaci più pericolosi in riferimento al rischio complessivo per l ambiente (indice ICRA)

15 27 AGOSTO 2007 LA GUAZATINA IN EUROPA NON E PIU AUTORIZZATA.

16 NON CI SONO EVIDENZE PER AFFERMARE, MA NON SI PUÓ NEANCHE ESCLUDERE, CHE LA GUAZATINA SIA CANCEROGENA NE CHE SIA PERICOLOSA PER IL SISTEMA ENDOCRINO E RIPRODUTTORE. NON INFLUISCE SULLA COLINESTERASI, MA E COMUNQUE DEFINITA TOSSICA.

17 PUR ESSENDO UNANIMENTE CONSIDERATA UNA SOSTANZA NOCIVA, LA GUAZATINA E RACCOMANDATA COME ANTIDOTO MIGLIORE CONTRO LA FUSARIOSI DEL PIEDE DEI CEREALI, SOPRATTUTTO SE ASSOCIATA AL TRITICONAZOLO.

18 RESIDUI DI GUAZATINA SONO STATI RILEVATI IN AGRUMI PROVENIENTI DAL NORD AFRICA, IN PARTICOLARE DAL MAROCCO, MA ANCHE SU AGRUMI NAZIONALI.

19 RICERCA BIBLIOGRAFICA LA RISOLUZIONE E L IDENTIFICAZIONE DEI COMPONENTI PRINCIPALI DELLA MISCELA GUAZATINA È STATA ESEGUITA MEDIANTE:

20 RICERCA BIBLIOGRAFICA GC-MS DERIVATIZZAZIONE CON ESAFLUOROACETIL ACETONE

21 RICERCA BIBLIOGRAFICA GC-MS DERIVATIZZAZIONE CON ESAFLUOROACETIL ACETONE

22 RICERCA BIBLIOGRAFICA HPLC-ESI-MS Single-quadrupole COLONNA 250 X 10 mm ISOLAMENTO DEI COMPONENTI PRIORITARI QUANTIFICAZIONE

23 RICERCA BIBLIOGRAFICA HPLC-ESI-MS Single-quadrupole COLONNA 250 X 10 mm ISOLAMENTO DEI COMPONENTI PRIORITARI QUANTIFICAZIONE

24 1 OBIETTIVO RISOLUZIONE CROMATOGRAFICA MEDIANTE UNA COLONNA ANALITICA HPLC -ESI MS ION TRAP

25 SI È PROVVEDUTO ALL ACQUISTO DI:

26 STANDARD DELLA GUANIDINA GNG 9.8 % 29.5 % GG 4.5 % 8.1 % 30.6 % GNG GGN GGG 1.4 % 5.1 %

27 Standard Analitico di GUAZATINA miscela di guanidine

28 Formulato Commerciale PANOCTINE L - FUNGICIDA Composizione: GUAZATINA 30.00% GLICOLE ETILENICO 0.00% NON SPECIFICATI 70.00% Registrazione n 5890 del 25/04/1984 del Ministero della Sanità. Società Detentrice: makhteshim agan italia Distributore: makhteshim agan italia

29 L ANALISI DEI COMPENENTI DELLA GUAZATINA È STATA ESEGUITA MEDIANTE COLONNA ANALITICA % B = 70 % Luna C 18 Phenomenex 250 x 4.6 mm Temperatura Colonna 19 C TEMPO (min) 30 min A = H % HCOOH B = CH 3 CN + 1% HCOOH

30 L ANALISI DEI COMPENENTI DELLA GUAZATINA È STATA ESEGUITA MEDIANTE COLONNA ANALITICA % B = 70 % Luna C 18 Phenomenex 250 x 4.6 mm Temperatura Colonna 19 C Flow 300 μl/min Flow 300 μl/min TEMPO (min) 30 min A = H % HCOOH B = CH 3 CN + 1% HCOOH

31 L ANALISI DEI COMPENENTI DELLA GUAZATINA E STATA ESEGUITA MEDIANTE COLONNA ANALITICA % B = 70 % Luna C 18 Phenomenex 250 x 4.6 mm Temperatura Colonna 19 C Flow 300 μl/min TEMPO (min) 30 min A = H % HCOOH B = CH 3 CN + 1% HCOOH

32 L ANALISI DEI COMPENENTI DELLA GUAZATINA E STATA ESEGUITA MEDIANTE COLONNA ANALITICA

33 IDENTIFICAZIONE DEI COMPONENTI PRINCIPALI DELLA GUAZATINA 89%DEL TOTALE DELLA MISCELA

34 FORMULATO STANDARD ANALITICO

35 STANDARD ANALITICO 2 OBIETTIVO DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA % GNG 4.5 % STD

36 DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA % DELLO STANDARD ANALITICO SE LO STANDARD ANALITICO FOSSE PER IL 100 % COSTITUITO DA GUAZATINA IN UNA SOLUZIONE 34 ppm DI GUAZATINA IL CONTENUTO DI GNG DOVREBBE ESSERE: 4.5 : 100 = x :34 X = 1.5 ppm TEORICI

37 NELLA SOLUZIONE DI GUAZATINA IL CONTENUTO IN ppm DI GNG CALCOLATO CON IL METODO DELLO STANDARD ESTERNO RISULTA PARI A 0,6O ppm 0,6 : 1,53 = X :100 0,6 : 1,53 = X :100 p p m E F F E T T I V I p p m E F F E T T I V I p p m T E O R I C I p p m T E O R I C I LA PUREZZA % DELLO STANDARD ANALITICO SARA : LA PUREZZA % DELLO STANDARD ANALITICO SARA : RETTA DI CALIBRAZIONE GNG RETTA DI CALIBRAZIONE GNG

38 NELLA SOLUZIONE DI GUAZATINA IL CONTENUTO IN ppm DI GNG CALCOLATO CON IL METODO DELLO STANDARD ESTERNO RISULTA PARI A 0,6O ppm LA PUREZZA % DELLO STANDARD ANALITICO SARA : LA PUREZZA % DELLO STANDARD ANALITICO SARA : X = 39 % X = 39 % RETTA DI CALIBRAZIONE GNG RETTA DI CALIBRAZIONE GNG 0,6 : 1,53 = X :100 0,6 : 1,53 = X :100 p p m E F F E T T I V I p p m E F F E T T I V I p p m T E O R I C I p p m T E O R I C I

39 3 OBIETTIVO QUANTIFICAZIONE DELLA GUAZATINA 1997 JOINT MEETING OF THE FAO PANEL OF EXPERTS ON PESTICIDE RESIDUES IN FOOD AND THE ENVIRONMENT AND THE WHO CORE ASSESSEMENT GROUP Lyon (IARC), 22 September-1 October 1997

40 3 OBIETTIVO QUANTIFICAZIONE DELLA GUAZATINA The use of such a complex mixture as guazatine presents a problem in choosing a residue analytical method. It is not considered practical to attempt the determination of all the components so some alternative is necessary. Two approaches may be applicable: 1. Development of a total residue method by conversion to a single compound. 2. The choice of a major component as a marker,, with the inclusion of a correction factor to give the total residue.

41 STANDARD ANALITICO Marker = GGG GGG 30.6 % FULL SCAN uma IONE ESTRATTO GGG

42 STANDARD ANALITICO Marker = GGG GGG 30.6 % SENSIBILITÀ FULL SCAN uma IONE ESTRATTO GGG

43 GGG

44 GGG WASTE S O U R C E SOURCE WASTE 17,5-19 min 30 min

45 ION TRAP EVENTS SCAN EVENT 1 CHE ASSICURI IONI QUALIFICATORI SELETTIVITÀ

46 ION TRAP EVENTS IONI QUALIFICATORI CHE ASSICURI SCAN EVENT 1 SCAN EVENT 2 SELETTIVITÀ SENSIBILITÀ IONE QUANTIFICATORE

47 SCAN EVENT 1 SELETTIVITÀ INDIVIDUAZIONE DI IONI QUALIFICATORI GGG MS 1 Ione principale( M+2H) +2

48 GGG MS 1 GGG MS 2 Ione principale( M+2H) C.E. 42 % Ione principale( M+2H)

49 GGG MS 1 GGG MS 2 Ione principale( M+2H) C.E. 42 % C.E. 36 % Ione principale( M+2H) IONI QUALIFICATORI SCAN EVENT GGG MS 3

50 GGG MS 1 GGG MS 2 Ione principale( M+2H) C.E. 42 % C.E. 36 % Ione principale( M+2H) MS 3 + CRM SCAN EVENT GGG MS 3

51 SCAN EVENT 2 SENSIBILITÀ INDIVIDUAZIONE IONE QUANTIFICATORE GGG MS 1 Ione principale( M+2H) +2 MS 1 + SIM

52 MS 1 + SIM MS 3 + CRM WASTE S O U R C E SOURCE WASTE 17,5-19 min 30 min

53 RANGE DI CALIBRAZIONE = ppm

54 4 OBIETTIVO QUANTIFICAZIONE DELLA GUAZATINA NEGLI AGRUMI

55 4 OBIETTIVO QUANTIFICAZIONE DELLA GUAZATINA NEGLI AGRUMI LA MAGGIOR PARTE DEI METODI RIPORTATI IN LETTERATURA SONO FINALIZZATI ALLA DETERMINAZIONE DELLA GUAZATINA NEI CEREALI.

56 BIBLIOGRAFIA

57 ESTRAZIONE GUAZATINA SOLUBILE IN FASE ORGANICA NH HN NH 2 NH N H 2 N H N N H NH 2 H + OH - + H 2 N NH NH NH 2 N H 2 N H N SOLUBILE IN FASE ACQUOSA N H NH 2

58 CEREALI CAMPIONE NaOH 0.5 N / MeOH RESIDUO ESTRATTO CLOROFORMIO FASE ACQOSA FASE ORGANICA GC-MS DERIVATIZZAZIONE

59 GC-MS DERIVATIZZAZIONE CON ESAFLUOROACETIL ACETONE

60 MELE UVA CETRIOLI

61 PER LE MATRICI AD ALTO CONENUTO DI FRUTTOSIO OCCORRONO DEI REAGENTI DI RILASCIO

62 REAGENTI DI RILASCIO MELE

63 GUANIDINA CLOROIDRATO

64

65 REAGENTI DI RILASCIO CONFRONTO MATRICI

66 ARANCE CAMPIONE GUANIDINA CLOROIDRATO NaOH 0.5 N / MeOH RESIDUO ESTRATTO CLOROFORMIO FASE ACQOSA FASE ORGANICA HPLC-ESI-MS 3 ROTOVAPOR

67 Full Scan ARANCE BIANCO Full Scan ARANCE DROGATE 0.33 ppm + GUANIDINA CLOROIDRATO RECUPERO= 35% STIMATO IN SIM-MODE GGG

68 ARANCE DROGATE A 0,33 ppm in presenza di EDTA

69 ARANCE DROGATE A 0,33 ppm in presenza di EDTA STD MIX

70 L EDTA COMPLESSA LE GUANIDINE

71 L EDTA COMPLESSA LE GUANIDINE ARANCE DROGATE A 0,33 ppm in presenza di EDTA COMPLESSO GGG + EDTA 261 STD MIX

72 CONSIDERAZIONI 1. LA GUAZATINA SI DEGRADA A CONTATTO CON IL BOROSILICATO

73 1. LA GUAZATINA SI DEGRADA A CONTATTO CON IL BOROSILICATO

74 CONSIDERAZIONI 2. LA GUAZATINA VIENE COMPLESSATA DA ALCUNI COSTITUENTI DELLE ARANCE FLAVONOIDI?

75 CONSIDERAZIONI 2. LA GUAZATINA VIENE COMPLESSATA DA ALCUNI COSTITUENTI DELLE ARANCE 3. L EDTA COMPETE CON TALI COSTITUENTI

76 PROSSIMO OBIETTIVO QUANTIFICAZIONE DELLA GUAZATINA NEGLI AGRUMI MEDIANTE L IMPIEGO DI SOLUZIONI STANDARD PREPARATE CON AGGIUNTA DI EDTA

77 Grazie per l attenzione agri2.ascalab@regione.sicilia.it Tel Fax U.O.S. n. 34 A.S.C.A. - Analisi e Servizi per la Certificazione in Agricoltura- Ispica (Rg)