Le intolleranze alimentari esaminate con test leucocitotossico.

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1 Regione Emilia Romagna-Azienda Ospedaliera di Bologna Policlinico S.Orsola-Malpighi Servizio Laboratorio Centralizzato Responasabile Dr.ssa P.Boni Centro per lo studio e la cura delle malattie croniche intestinali Responsabile Prof. M.Campieri Le intolleranze alimentari esaminate con test leucocitotossico. Campieri M., Maldini Casadei M., Marzetti C., Rizzi M., Boni P.,Chiesa D.,Bassi Mirna In uno studio condotto su 20 pazienti con sintomi tipici da intolleranze alimentari, per i quali era stata esclusa in precedenza la celiachia, abbiamo verificato la presenza di intolleranze alimentari su 60 sostanze mediante il test leucocitotossico, ed abbiamo quindi escluso dalla dieta gli alimenti a cui ciascun paziente risultava intollerante. I risultati ottenuti hanno dimostrato una remissione della sintomatologia nel 73,3% dei pazienti intolleranti già dopo 30 giorni di dieta di esclusione. Questo fa ritenere che il test leucocitotossico possa essere sottoposto ad ulteriori studi controllati per chiarirne il ruolo diagnostico nell individuazione delle intolleranze alimentari.

2 INTRODUZIONE Le cosiddette intolleranze alimentari rappresentano una problematica attuale, i cui numeri sono in costante aumento negli ultimi anni. Lo stesso termine intolleranza è largamente adoperato per individuare un insieme di sintomi non altrimenti spiegabili con le tecniche diagnostiche comunemente adottate e non regredibili a seguito di terapie sintomatiche. I sintomi più frequentemente riscontrati nei soggetti a cui si fa poi diagnosi di intolleranza alimentare sono: diarrea, dolore addominale crampiforme, meteorismo, nausea, senso di ripienezza postprandiale, cefalea; essi, differentemente da quanto accade per le allergie, possono interessare più sistemi/apparati (cute, apparato digerente, urinario, osteo-articolare, respiratorio, ORL, sistema nervoso centrale). Tale coinvolgimento si verifica in circa il 40% dei casi ed interessa in modo particolare l apparato digerente e la cute. I sintomi delle intolleranze alimentari tendono a manifestarsi tardivamente; i pazienti non riescono a stabilire un nesso di causalità in quanto realizzano una sintomatologia cronica, non necessariamente specifica dell apparato digerente, legata all assunzione di cibi che rientrano nell alimentazione di tutti i giorni. Pur non essendo stato univocamente chiarito, risulta che i meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo delle intolleranze alimentari siano almeno di due tipi differenti; il primo sarebbe riconducibile ad un alterato metabolismo di alcuni nutrienti, con conseguente accumulo a livello intestinale di sostanze capaci di determinare reazioni avverse agli alimenti in questione, come dimostrato dalla comparsa di sintomatologia solo in seguito alla ripetuta e costante assunzione di determinate sostanze alimentari; il secondo sarebbe da attribuire alla presenza di reazioni avverse per così dire innate, come risulta dalla positività dei test anche nei confronti di sostanze mai assunte, e comunque dall impossibilità di reintrodurre l alimento anche gradualmente. Appare evidente che il meccanismo patogenetico alla base delle intolleranze alimentari sia sostanzialmente diverso da quello che spiega le allergie alimentari; nei confronti degli alimenti per cui risulta un intolleranza, infatti, non sono state finora dimostrate reazioni su base immunitaria né esistono sovrapposizioni reciproche tra gli alimenti nei confronti dei quali si riscontrano fenomeni di reazioni allergiche e quelli a cui si risulta invece intolleranti. Il test leucocitotossico è stato messo a punto nel 1956 da Benson, Brayan e Brayan ed appare una metodica semplice e ripetibile, la cui attendibilità è stata sinora suffragata dai risultati clinici ottenuti dall eliminazione degli alimenti risultati positivi. Esso consiste nel porre a contatto il siero ed i leucociti dei pazienti con i singoli estratti alimentari delle sostanze da testare e nel verificarne in vitro, l azione citotossica o vacuolizzante nei confronti dei leucociti del paziente, venendo valutate in modo particolare le modificazioni strutturali citoplasmatiche a carico dei granulociti polimorfonucleati neutrofili. Tali modificazioni vengono poi classificate in una scala da 1 a 4, sulla base della gravità della reazione nei confronti dell alimento testato e del numero di neutrofili interessati per campo: 1 grado:leucociti esenti da deformazioni; 2 grado: leucociti vacuolizzati con alterazioni strutturali di membrana; 3 grado: leucociti vacuolizzati con parziale perdita dell integrità di membrana e dei granuli citoplasmatici; 4 grado: leucociti disgregati con frammentazione della membrana e dispersione del materiale endocellulare.

3 DATI PERSONALI In uno studio abbiamo voluto verificare se, utilizzando il test leucocitotossico per individuare gli alimenti a cui un certo numero di pazienti era intollerante, ed escludendo dalla dieta degli stessi pazienti gli alimenti in questione, si verificasse un cambiamento nella sintomatologia soggettiva dei pazienti. Sono stati inclusi nello studio 20 pazienti, 10 maschi e 10 femmine, di età compresa tra 27 e 62 anni (età media: 44,5 anni), di cui 8 pazienti con precedente diagnosi di IBD (Rettocolite ulcerosa o malattia di Crohn) e 12 con diagnosi di Colon Irritabile posta per esclusione di altre patologie organiche. In tutti i pazienti è stata esclusa la celiachia, tramite il dosaggio sierico della transglutaminasi; nei pazienti che presentavano anche sanguinamento rettale la valutazione iniziale è stata completata con l esecuzione di una rettoscopia per evidenziare eventuali cause di proctorragia. I sintomi lamentati dai pazienti all inizio dello studio, variamente associati tra loro, sono riportati in tabella(tab.1) Tabella 1 Sintomi n.casi Diarrea 15 Stipsi 5 Meteorismo 17 Nausea 8 Senso di ripienezza postprandiale 10 Tutti i soggetti sono stati sottoposti a test leucocitotossico i cui kit diagnostici sono stati forniti dalla ditta Antigenia di Bologna. Il procedimento di lettura dei vetrini è stato effettuato sempre dallo stesso operatore. Il test leucocitotossico è stato eseguito ponendo in contatto il siero ed i leucociti dei pazienti con estratti di 60 alimenti (Tab 2) ed ha permesso di evidenziare alterazioni morfologiche dei granulociti polimorfonucleati neutrofili dei pazienti inclusi nello studio con grado variabile da 3 a 4 in 15 casi sul totale di 20 pazienti studiati. Tabella 2: Alimenti testati Latte vaccino Gamberi Arancia Latte di pecora Merluzzo Mela Latte di capra Sogliola Fragola Lievito Zucchina Albicocca Lievito chimico Melanzana Banana Farro Lattuga Pera Orzo Peperoni Pesca Grano Cicoria Uva Riso Cavolo Arachide Mais Spinaci Mandorla Tacchino Carota Noce

4 Coniglio Asparago Oliva Maiale Patata Piselli Agnello Sedano Soia Mix cefalopodi Cipolla Fagiolo Manzo Funghi The Pollo Pomodoro Cacao Uova Kiwi Caffè Salmone Limone Zucchero Tonno Prugna Miele Nei 15 casi in cui è stato possibile evidenziare alterazioni di grado compreso fra 3 e 4 a carico dei neutrofili sono stati sospesi dalla dieta gli alimenti per i quali era stata riconosciuta l intolleranza. E stata quindi preparata per ciascun paziente una dieta di eliminazione che consentisse di escludere gli alimenti positivi al test e di sostituirli con altre sostanze equivalenti dal punto di vista nutrizionale, al fine di evitare carenze nutritive di qualunque tipo. La sospensione dalla dieta individuale degli alimenti positivi al test è stata protratta per 30 giorni, al termine del quale si è proceduto in prima istanza alla verifica delle condizioni cliniche del soggetto in esame, in seconda istanza alla reintegrazione degli alimenti in ragione di uno ogni 10 giorni fino al ripristino delle abitudini dietetiche precedenti allo studio. Nella fase della verifica, effettuata dopo un mese di dieta di eliminazione, è stato possibile evidenziare una completa scomparsa dei sintomi in 11 pazienti sul totale di 15 sottoposti a dieta di eliminazione, sintomi poi nuovamente lamentati dai pazienti al ripristino graduale degli alimenti nel proprio regime dietetico, salvo poi cessare alla nuova e definitiva eliminazione della sostanza dalla propria dieta. In alcuni casi e per taluni alimenti si è notata una comparsa della sintomatologia soggettiva solo se assunti con costanza e frequenza elevate, mentre perdurava lo stato di benessere se l alimento era assunto solo saltuariamente. Dei 4 pazienti sottoposti a dieta di eliminazione che non hanno riferito miglioramenti nella propria sintomatologia, 2 erano affetti da malattia di Crohn in fase di attività complicata da fistole ed ascessi perianali, mentre 1 aveva contratto nei primi giorni di dieta di eliminazione un infezione intestinale sostenuta da Candida Albicans. DISCUSSIONE La crescita esponenziale delle malattie allergiche ha suggerito ad alcuni autori il termine di epidemia allergica per definire il fenomeno, sulla base di studi epidemiologici che indicano una prevalenza nel Mondo Occidentale di allergopatie nel 20-30% della popolazione generale. Il numero degli allergici, però, aumenta in modo non reale per uso improprio, anche fra gli stessi medici, del termine allergico per definire effetti indesiderati dei farmaci, reazioni tossiche ad alimenti o vasomotorie ad agenti irritanti. Tuttavia un ulteriore sovrastima viene da un attribuzione di una genesi allergica alimentare a patologie fra loro estremamente diverse (emicrania, colon irritabile, orticaria cronica, sd della fatica cronica, sd ipercinetica del bambino, artriti siero negative, otite sierosa, malattia di Crohn) peraltro non confortata da rigorose evidenze scientifiche. Questo ha contribuito a creare una diffusa opinione generale che l allergia alimentare possa essere il camaleonte della medicina, in grado potenzialmente di spiegare patologie estremamente diversificate e che ancora non hanno trovato una sicura eziologia.

5 L esistenza di un imbarazzante distanza fra il sospetto clinico anamnestico e la sicura conferma diagnostica con il test in doppio cieco vs placebo (attualmente considerato il test diagnostico più sicuro) è documentata da due ampi studi europei, il primo olandese ed il secondo danese(tab 3): Tabella 3: Prevalenza delle reazioni avverse ai cibi Studio Anamnesi DBPCFC D.Altman, 12,4% 0,8% L.T.Chiaramonte(1994) 1483 soggetti JO B.Hourihane(1994) 7500 soggetti 19,9% 1,8% Si può razionalmente individuare nella scarsa disponibilità di estratti commerciali standardizzati e nell uso di tecniche non sufficientemente standardizzate come il prick by prick con alimento fresco, la causa di alcune false negatività e si possono anche ipotizzare modelli patogenetici immunologici diversi da quello reaginico in alcune reazioni ad alimenti per spiegare questa discrepanza, ma certamente l analisi di questi numeri induce una profonda riflessione circa i precisi confini dell allergia alimentare. Ulteriore elemento di confusione diagnostica è rappresentato dal fenomeno di un sempre più frequente ricorso, da parte dei pazienti a test alternativi, che si propongono di identificare con metodiche diverse dalle tradizionali, i cibi responsabili di allergie o intolleranze alimentari. Quest ultimo temine, che nella sua accezione più rigorosa vuole indicare ogni reazione avversa riproducibile che segue all ingestione di un alimento o ad alcuna delle sue componenti (proteine, carboidrati, grassi, conservanti) e comprende reazioni tossiche, metaboliche e allergiche è sempre più frequentemente interpretato in senso generico anche ad indicare un avversione psicologica nei confronti di questo o quel cibo. Il test leucocitossico, proposto per la prima volta nel 1956, e quindi cronologicamente prima della scoperta delle IgE, si basa sul principio che l aggiunta in vitro di uno specifico estratto alimentare al sangue intero o a sospensioni leucocitarie comporti una serie di modificazioni morfologiche nelle cellule fino alla loro citolisi. Nel test viene fornita una scala semiquantitativa che ha nella lisi cellulare l alterazione più significativa. In tempi più recenti è stata anche proposta una versione automatizzata del test che si basa sullo stesso razionale (ALCAT). Franklin e Lowell documentarono in soggetti allergici all ambrosia l assenza di significative differenze morfologiche nei globuli bianchi quando posti in provette a contatto con estratto di ambrosia. Chambers et al in soggetti polisensibilizzati non evidenziarono significative differenze nei globuli bianchi se posti a contatto con allergeni cui tali soggetti erano o meno sensibilizzati. Lieberman et al, in uno studio controllato, volto a valutare l effetto citotossico di alcuni allergeni su globuli bianchi posti in sospensione nel plasma, non identificarono alcuna correlazione fra risultati del test e reazioni allergiche a cibi o con reazioni indesiderate nei confronti degli stessi (emicrania, diarrea, astenia); inoltre il test non era riproducibile, dal momento che si ottenevano risultati diversi per una stessa persona se saggiata in momenti successivi. Benson ed Arkins in uno studio controllato in doppio cieco hanno identificato un elevato numero di risultati falsamente positivi e negativi.

6 Ciò dimostra che sull attendibilità di tali test esistono pareri controversi, ma se è vero che su tale parametro influiscono diverse variabili (diagnosi corretta, standardizzazione della metodica, esperienza dell operatore, ambiente, condizioni di stress psicofisico, stress ossidativi del paziente), l attendibilità dei test è comunque suffragata dai risultati clinici ottenuti con l astensione dagli alimenti risultati positivi. Anche nella nostra pratica clinica, l individuazione di intolleranze alimentari ottenute attraverso il test leucocitotossico permette di ottenere la risoluzione sintomatologica in un alta percentuale di casi (73,3% dei soggetti positivi). Va sottolineato che, come per ogni test diagnostico, la specificità aumenta in relazione a quanto più precisa sia l indicazione, e da ciò scaturisce l importanza di una corretta diagnosi. Gli eventuali risultati contrastanti sono spesso causati dall indiscriminato utilizzo dei test in assenza delle valutazioni anamnestiche e clinico-strumentali che sono alla base della medicina e che, purtroppo, vengono talvolta tralasciate; inoltre va sottolineata la fondamentale differenza tra intolleranza ed allergia, manifestazioni spiegabili attraverso meccanismi diversi, che non possono quindi essere utilizzate reciprocamente per la spiegazione o la negazione di un fenomeno. Occorre evidenziare che, per una dieta di astensione alimentare necessita impostare una corretta dieta di sostituzione che non sia priva di nutrimenti essenziali e pertanto bisogna avere buona conoscenza delle famiglie biologiche, dei gruppi alimentari e della composizione degli alimenti. Contrariamente a quanto si osserva nelle reazioni allergiche, il paziente intollerante potrà in una buona percentuale di casi, tornare a reintrodurre i cibi secondo la tecnica di rotazione. Prima di procedere alla reintroduzione alimentare è necessario verificare la possibilità di una doppia reazione immunitaria (IgG4/IgE), attraverso l esecuzione di RAST alimentare specifico. La negatività a tale test permetterà di insistere periodicamente nella reintroduzione alimentare di un cibo verso il quale si realizza ancora reazione avversa. Le intolleranze alimentari vanno tenute nella giusta considerazione nel puzzle diagnostico di ogni giorno, ed il non volerne riconoscere l esistenza rappresenterebbe un comportamento negligente. CONCLUSIONI E possibile pensare che il test leucocitotossico possa essere routinariamente utilizzato per la diagnosi di intolleranze alimentari? Non ancora, ma lo studio portato a termine può costituire uno spunto per dare l avvio a sperimentazioni cliniche controllate ed in doppio cieco, perché sembra evidente che il test leucocitotossico possa avere un ruolo importante, ma ancora non ben chiarito nella diagnostica di tali problematiche. Il meccanismo per cui si determinano alterazioni strutturali a carico dei leucociti dei soggetti in risposta a determinati estratti alimentari deve essere ancora chiarito, perché esso è dissimile rispetto alle reazioni immuno-mediate già ben note, e non risulta sufficientemente e completamente spiegato dall ipotesi che si tratti di un accumulo di metaboliti tossici. Infatti esiste una parte di pazienti che nei confronti di alcuni alimenti riscontra un corteo sintomatologico regredibile con la riduzione quantitativa dell alimento stesso, ma altri pazienti o gli stessi soggetti nei confronti di alimenti diversi, anche mai assunti, risultano positivi al test leucocitotossico e devono escludere completamente e definitivamente dalla propria dieta i suddetti alimenti. I meccanismi per cui si verificano alterazioni morfologiche del leucocita sembrano quindi essere almeno due, uno da accumulo di probabili metaboliti tossici mal digeriti ed uno da reazione immediata, quasi come da memoria da parte del leucocita nei confronti di sostanze o parti di sostanze.

7 In attesa che tali ipotesi di lavoro siano oggetto di verifica, i risultati della nostra esperienza, sia pure su un campione limitato di pazienti, starebbero a significare che il test leucocitotossico possa essere una metodica promettente nella diagnosi delle intolleranze alimentari. L intento dello studio è stato descrivere quanto abbiamo avuto modo di osservare attraverso la trattazione di queste problematiche, ma ci sembra siano necessari ulteriori approfondimenti condotti con metodiche controllate ed in doppio cieco, al fine di individuare una tecnica che possa fare luce su un problema clinico di rilievo, ma ancora non ben chiarito Qualora si verificasse la piena attendibilità del test leucocitotossico, ciò consentirebbe di prospettare ad un numero sempre crescente di pazienti una soluzione semplice, non invasiva, economica e di largo impiego per la diagnosi ed il trattamento di situazioni cliniche complesse e non altrimenti spiegate e curate, che incidono notevolmente sulla qualità di vita di molte persone. BIBLIOGRAFIA Amberg V.G.:Irritable Bowel Sindrome.Gastro Update Sciense Series published by Schetztor-Velag Ldt, Constabce, Germany, ;1999 Ballegaard M., Bjergstrom A., Brondum S., Hylander E., Jensen L., Ladefoger K.: IBD and food intolerance (abstract) Scand J Gastroenterol, 32(6):569-71;1997 Barnes R.M.R., Harvey M., Blears J., Finn R., Johnson P.M: IgG subclass of human serum antibodies reactive with dietary proteins.int.archs Allergy Appl.Immun 81: Biancone L., Monteleone I., Del Vecchio Bianco G., Valvassori P., Pallone F.: Recident bacterial flora and immune system. Digestive and Liver Desease:Vol.34-Suppl 2, 37/43; 2002 Bruijnzeel-Koomen C., et al.:adverse Reaction of food. Allergy V:623-35, 1995 Campieri M., Giochetti P.:Probiotics in inflammatory bowel disease:new insight to pathogenesis or a possibile therapeutic alternative? Gastroenterol. 116:1246-9;1999 Casimir G. J.A., Duchateau J., Gossart B., Cuvelier P.H., et al. :Atopic dermatitis :role of food and house dust mite allergeng. Pediatrics 92: ;1993 Champion M.C., Orr W.C.:Progressi in motilità gastrointestinale.blackwell Science Ldt.Osney Mead Oxford OX2 OEL, Gran Bretagna, 1997 Chandra RK., et al.: Food intolerance and irritable bowel syndrome. Gut; 30: , 1989 Cohen G., Hartman G., Hamburger R., O Connor R.: Severe anaemia and cronic bronchitis associated with a markedly elevated specific IgG to cow s milk protein. Annals of Allergy 55:38-40; 1985 Danese R., Galliani E.A., De Lazzari F., Di Leo V., Naccarato R., Discrepancies between reported food intolerance and sensitization test findings in irritable bowel sindrome patients. Aim.J.Gastroenterol.94(7):1982-7;1999 Digestive Disease Week(DDW), New Orleans, 1998 De Simone C., Famularo G., Bianchi-Salvatori B., Vesely R.:Prospettive terapeutiche dei batteri lattici.teoria eapplicazioni nel dismicrobismo intestinale.piccin Nuova Libreria S.P.A., Padova, 1998 De Santis A.Studi clinici:la sindrome dell intestino irritabile. Atti Simp. Probiotici:impiego dei preparati ad alta concentrazione Bologna 1997.P.14-5 Di Tullio G.: La malattia asmatica.ruolo della nutrizione biologica.atti 3 congresso S.N.G.B, suppl. al n 3 La med.biol.:15-19;2001 Gossart B., Cuvelier P.H., et al.:atopic dermatitis :role of food and house dust mite allergens.pediatrics 92 : ;1993 Guthrie EA, et al.:eating disorders in patients with IBS: a comparison with IBD and peptic ulceration.eur J.Gastroenterology 2:471-3, 1990

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