Coltivazione dei batteri Identificazione dei microrganismi

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1 Coltivazione dei batteri Identificazione dei microrganismi G I O VA N N I D I B O N AV E N T U R A C I «M I C R O B I O L O G I A E M I C R O B I O L O G I A C L I N I C A» C D S M E D I C I N A E C H I R U R G I A U N I V E R S I TÀ G. D A N N U N Z I O, C H I E T I - P E S C A R A A A

2 Terreni di coltura Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo Caratteristiche: concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica adeguato grado di umidità reazione (ph) adatta sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

3 Terreni di coltura Contenuto qualitativo Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.) NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari Estratti di lievito, carne, d organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine; necessari per la crescita di batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide) Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori critici di ph del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo fermentativo del batterio

4 Terreni di coltura Classificazione In base allo stato fisico: Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati. Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel) In base alla composizione chimica: Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note. Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note. Terreni COMPLESSI: non è nota l esatta composizione chimica. Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.).

5 Terreni di coltura Classificazione In base alla funzione: Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

6 Terreni di coltura Preparazione 1. Pesata degli ingredienti 2. Dissoluzione degli ingredienti 3. Correzione del ph al valore desiderato 4. Distribuzione nei recipienti (terreni liquidi) 5. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi) 6. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi) 7. Controllo della sterilità dei terreni

7 Semina per isolamento Terreni di coltura Tecniche di semina Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate. Lo striscio avviene mediante utilizzo di un'ansa sterile (bisogna evitare contaminazioni crociate con altri microrganismi presenti sulla superficie di tale oggetto). Prevede una serie di semine in differenti aree della superficie dell agar, in modo da disperdere le varie cellule presenti sull'ansa (prelevate da brodocoltura o da altra crescita su agar).

8 Terreni di coltura Tecniche di semina Semina per inclusione Agevola la conta delle colonie batteriche. La sospensione batterica viene miscelata, in capsula/piastra Petri sterile, al terreno agarizzato allo stato liquido (che, raffreddandosi, successivamente gelificherà). Mixare mediante movimenti orari, antiorari e a croce. Solitamente, l agar si cimenta con differenti diluizioni, in soluzione fisiologica (NaCl 0.9%) sterile, del campione.

9 Terreni di coltura Tecniche di semina Semina per infissione Mediante un ago da inoculo, il campione viene seminato nello spessore del terreno agarizzato. Consente di valutare il rapporto del metabolismo batterico con O 2 sulla base della altezza in cui si osserva crescita: nella parte alta (AEROBIO), sul fondo (ANAEROBIO), diffusa (ANAEROBIO FACOLTATIVO) Consente di valutare la motilità del microrganismo: se la crescita è diffusa, il batterio possiede flagelli. Consente di valutare specifiche attività enzimatiche: proteasi, ureasi, produzione indolo

10 Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica Cetrimide Agar Selettivo per l isolamento e l identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. Cetrimide composto ammonio quaternario verso cui P. aeruginosa è resistente - inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi. Columbia Blood Agar Base Di uso generale, oppure quale base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella). Hektoen Enteric Agar Differenziale e selettivo per Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H 2 S (colonie nerastre, Salmonella)

11 Hektoen enteric agar Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica Cetrimide agar (Pseudomonas aeruginosa) Columbia blood agar base (Streptococcus poyogenes)

12 Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica MacConkey agar isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (Escherichia coli, Klebsiella spp, Salmonella spp, Shigella spp). Cristalvioletto e sali biliari inibiscono la crescita di Gram+. Il lattosio evidenzia la capacità fermentante: colonie fermentanti lac+ (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appaiono di rosa acceso, incolori quelle non fermentanti lac- (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa). Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi. Urea broth base (terreno di Christensen) evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae mediante il viraggio di un indicatore di ph (rosso fenolo).

13 Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica MacConkey agar (lac+ vs lac-) Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar (Bacteroides fragilis) Urea broth base (Helicobacter pylori)

14 Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica Mannitol Salt Agar selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di altri batteri; sistema fermentante: mannitolo e rosso fenolo; S. aureus, fermentante, produce colonie con alone giallo-brillante, mentre stafilococchi coagulasinegativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora Salmonella-Shigella Agar (SS Agar) selettivo e differenziale per Salmonella e Shigella; sodio citrato, sali biliari e verde brillante inibiscono la crescita di Gram+ e alcuni enterobatteri; sistema fermentante: lattosio e rosso neutro; Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero, dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di H 2 S a partire da sodio tiosolfato presente nel terreno Saboraud Dextrose Agar terreno acidificato per l isolamento di diversi funghi e lieviti: Candida albicans (colonie incolori/rosa), Candida non-albicans (colonie rosa scuro/rosse)

15 Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica Agar sale-mannite Agar Salmonella-Shigella (colonie nere di Salmonella, incolori quelle di Shigella) Saboraud Dextrose agar (Candida albicans)

16 Terreni «dedicati» Isolamento di agenti eziologici poco frequenti Campione Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento Feci Colera Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Faringe Infiammazione Haemophilus influenzae ostruttiva epiglottide e faringe Acqua peptonata alcalina Agar sangue cioccolato Agar Casman Tampone rinofaringeo Escreato Faringite membranosa Corynebacterium diphteriae Agar Loeffler Agar Tinsdale Terreno al tellurito di sodio Pertosse Bordetella pertussis Bordet-Gengou Tubercolosi Mycobacterium tuberculosis Lowenstein-Jensen Middlebrook 7H-11 Micosi polmonare Blastomyces dermatitidis Brain-heart Infusion agar Urina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher Sangue, midollo osseo o biopsia Brucellosi Brucella spp. Agar brucella

17 Terreni «dedicati» Isolamento di anaerobi ed «esigenti» Terreno Agar sangue Agar cioccolato Scopo Terreno in piastra non selettivo di uso generale Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti Agar MacConkey Agar sangue feniletil alcool Terreno al tioglicolato + emina + vitamina K 1 Terreno di Thayer-Martin modificato Agar sangue kanamicina-vancomicina Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram- Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-

18 Crescita batterica Definizioni Crescita vs Tolleranza la crescita presuppone attiva divisione cellulare (riproduzione) e, quindi, aumento di biomassa; si usa il suffisso -fili in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possono sopravvivere ma non riprodursi, si usa il suffisso -tollerante Esempio: - un batterio termofilo cresce in presenza di elevate temperature - un batterio termotollerante sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori Obbligato (stretto) vs facoltativo Obbligato (o stretto ): una data condizione è necessaria per la crescita Facoltativo : il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali. Esempio: - un termofilo obbligato necessita di elevate temperature per la sua crescita - un termofilo facoltativo può crescere sia ad alte che basse temperature

19 Crescita batterica Regolazione: temperatura La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20 C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo optimum termico Psicrofili: crescono nel range 0 20 C (Listeria monocitogenes; Flavobacterium) Mesofili: crescono nel range C (maggior parte; E. coli) Termofili: crescono nel range C (Bacillus stearotermophilus) Ipertermofili: crescono nel range C (Pyrodictium brockii)

20 Crescita batterica Regolazione: ph La maggior parte dei batteri cresce a valori di ph compresi tra 6 ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo optimum di ph Acidofili: crescono al di sotto di ph 6 (ph 2-6, generalmente); funghi e lieviti generalmente più tolleranti vs batteri (ph 5-6) Neutrofili: crescono a ph 6-8; la maggior parte dei batteri Alcalofili: crescono a ph > 8 (ph 8-9.5, generalmente)

21 Crescita batterica Regolazione: pressione osmotica

22 Alofili: Crescita batterica Regolazione: alofilia crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche e bassa a w ; microrganismi alotolleranti (1-6% NaCl), alofili (6-15% NaCl), alofili estremi (15-30% NaCl) queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran parte dei microrganismi

23 Crescita batterica Regolazione: O 2 Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di O 2 Aerobi facoltativi: crescono meglio in presenza di O 2, ma anche in assenza Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O 2 Anaerobi facoltativi: crescono meglio in assenza di O 2, ma anche in presenza Microaerofili: crescono in presenza di (O 2 5%, CO 2 10%, N 2 85%)

24 Crescita batterica Atmosfera «controllata»: anaerobiosi Cappa (camera) per anaerobiosi Giara per anaerobiosi Figure 6.5

25 Crescita batterica Atmosfera «controllata»: carbossifilia Carbossifilia (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2 ) Giara con candela Sistemi per generazione di carbossifilia

26 Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi 3. Caratteristiche biochimiche 4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 5. Tipizzazione fagica 6. Identificazione genotipica

27 ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie Superficie Forma Margine Rilievo

28 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (emolisi) Emolisi completa (β-emolisi) Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus

29 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (fermentazione) A B Agar sale mannite. A) Il mannitolo non viene fermentato (S. epidermidis); il terreno non vira. B) Fermentazione del mannitolo ad opera di S. aureus; il terreno vira al giallo.

30 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (sciamaggio) Proteus mirabilis. Il batterio si muove grazie ai numerosi flagelli disposti alla superficie cellulare (peritrico), formando «fronti» concentrici (sciamaggio).

31 ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche Enterobacteriaceae, in particolare: capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore ph (blu di bromotimolo: vira al blu a ph basico) presenza di particolari enzimi ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi, ureasi produzione di specifici prodotti metabolici terminali H 2 S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer) capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test) 1% carboidrato + indicatore ph + campanella di Durhan (produzione di gas)

32 ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche API (biomérieux) Identification System

33 ID dei microrganismi Caratteristiche antigeniche La ricerca di Ag specifici avviene mediante utilizzo di Ab specifici. Utilizzo di antisieri (Ab specifici) per reazione di agglutinazione colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi Utilizzo di sferule di latex quali «carrier» di Ag o Ab (reazione macroscopica di agglutinazione) Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)

34 Agglutinazione Ag Ab latex bead

35 ID dei microrganismi Tipizzazione fagica Nell ambito di una stessa specie possiamo rinvenire differenti ceppi batterici (sottospecie o tipi), ciascuno dei quali caratterizzato da un peculiare grado di virulenza. E possibile utilizzare la tecnica della tipizzazione fagica a fini identificativi e/o epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell infezione). Questo è il caso di S. aureus: estremamente sensibile a numerosi (20) virus batterici (batteriofagi o fagi) virulenti (litici) sensibilità non uniforme (ceppo-specifica) individuazione di tipi fagici

36 ID dei microrganismi Tipizzazione fagica

37 ID dei microrganismi Identificazione molecolare Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificazione di sequenze bersaglio, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico elevata sensibilità (necessarie poche copie del target di partenza) e specificità sequenziamento genico (genotipizzazione) RNA ribosomale grandi quantità di rrna altamente conservate in specie differenti presenza di sequenze di rrna specifiche per specie e tipo. Il grado di differenza nell rrna di due batteri è funzione diretta della «vicinanza» filogenetica: piccole differenze sono suggestive per una vicinanza tra le specie, mentre grandi differenze indicano una distanza maggiore l individuazione di un pattern in rrna che non trovi riscontro in nessuna altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

38 ID dei microrganismi Identificazione molecolare